松阿扁叶蜂SSR—PCR反应体系的优化

松阿扁叶蜂SSR—PCR反应体系的优化Abstract: In order to establish the SSR-PCR amplification system using genomic DNA of Acantholyda posticalis which was extracted by SDS-proteinase K method as template, orthogonal design was used to optimize main PCR factors such as template DNA, Taq DNA polymerase, Mg2+, primer and dNTPs. The results showed that the optimized PCR system included 1.00 U Taq DNA polymerase, 3.00 mmol/L Mg2+, 3.75 mmol/L dNTPs, 25.00 ng/μL DNA template and 20.00 μmol/L each primer in the total volume 25 μL.Key words: Acantholyda posticalis Matsumura;SSR-PCR;orthogonal design松阿扁叶蜂(Acantholyda posticalis Matsumura)是松树的重要食叶害虫之一,其1年发生l代,主要为害油松､黑松､樟子松等,常将当年生和二年生针叶吃光,致使被害松林成橘褐色,严重时80%以上的针叶被取食,从而严重影响树木生长[1,2]｡中国关于松阿扁叶蜂的研究主要集中于其生物学特性[3,4]､发生原因[5,6]､寄主选择[7]､防治技术和预测预报[8,9]等方面,但关于该害虫种群遗传变异的研究至今未见报道｡微卫星(SSR)分子标记具有分布广泛､多态性高､稳定性好､操作简便､检测技术简单及共显性遗传等优点,已被广泛应用于物种资源遗传多样性研究､基因分子标记以及昆虫遗传多样性研究等领域｡但SSR-PCR反应结果易受反应体系中多种因素的影响,因此需要对其扩增体系进行优化,然后才能进行后续的试验分析;此外,不同物种所需的SSR-PCR反应的最佳反应体系一般也不尽相同｡在进行种群遗传多样性的研究中,运用正交设计方法[10-12]对影响松阿扁叶蜂SSR-PCR反应的各因素进行了优化试验,建立了一套适合松阿扁叶蜂SSR-PCR 的反应体系,为应用该技术进行松阿扁叶蜂的种群遗传多样性分析打下基础｡1 材料与方法1.1 材料1.1.1 原料供试材料为2010年6月采自陕西省周至县楼观台国家森林公园为害油松的松阿扁叶蜂幼虫,样品保存于体积分数为95%的乙醇中,带回西北农林科技大学林学院昆虫分子生物学实验室进行基因组DNA提取｡1.1.2 试剂与仪器10×PCR Buffer(无Mg2+)､10 mmol/L dNTPs､5 U/μL Taq DNA聚合酶､25 mmol/L MgCl2以及分子质量标准DL 2000 DNA Marker均购自宝生物公司(大连)有限公司,引物序列由生工生物工程(上海)有限公司合成,稀释成20 μmol/L｡Mastercycle Pro S型PCR仪购自德国Eppendorf公司,ND-1000微量紫外可见分光光度计购自美国NanoDrop公司｡1.2 方法1.2.1 基因组DNA的提取和浓度测定采用改良的SDS-蛋白酶K法[13]提取松阿扁叶蜂幼虫基因组DNA,在1%琼脂糖凝胶上电泳检测提取产物的完整性｡用ND-1000微量紫外可见分光光度计检测DNA溶液的浓度和纯度,并将其稀释到20 ng/μL,于-80 ℃保存备用｡1.2.2 退火温度的优化根据预试验结果,选定引物LIST2001[14]用于SSR-PCR反应体系的优化｡首先在45~65 ℃设置4个退火温度即48.9､52.7､57.6和61.6 ℃进行试验,确定该引物最佳的退火温度｡SSR-PCR基本反应体系为:2.5μL 10×PCR Buffer(无Mg2+),2 μL 25 mmol/L MgCl2,1 μL DNA模板,20 μmol/L上下游引物各1 μL,0.25 μL 5 U/μL Taq DNA聚合酶,2 μL 10 mmol/L dNTPs,最后用无菌去离子水补足至25 μL｡SSR-PCR基本扩增程序为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性45 s､48.9 ℃/52.7 ℃/57.6 ℃/61.6 ℃退火45 s､72 ℃延伸45 s,30个循环;最后72 ℃延伸7 min｡扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶上用100 V电泳40 min,用溴化乙锭染色10 min,用去离子水脱色10 min,然后于Bio-Rad凝胶成像仪上照相保存｡1.2.3 SSR-PCR正交试验的设计针对影响PCR反应的5个因素(DNA模板､Mg2+､dNTPs､引物和Taq DNA聚合酶),选用L16(45)正交表在4个水平上进行正交试验｡设计的因素与水平见表1,2次重复｡PCR反应程序为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s､61.6 ℃退火30 s､72 ℃延伸45 s,30个循环;最后72 ℃延伸7 min,4 ℃保存｡PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,经溴化乙锭染色后于Bio-Rad凝胶成像仪上照相保存｡根据正交设计PCR扩增图谱中DNA条带的清晰程度与特异性(即条带强弱及杂带多少),参照何正文等[15]的方法从低到高依次对每个反应结果进行打分,分值从1分到16分,分值越高,表示敏感性､特异性越好｡所有数据分析均采用SPSS 12.0软件｡2 结果与分析2.1 松阿扁叶蜂基因组DNA的提取结果松阿扁叶蜂幼虫基因组DNA的提取结果表明(图1),松阿扁叶蜂基因组DNA大小约15 kb,主带清晰,无拖尾现象,DNA浓度为500~1 000 ng/μL,纯度为1.8~2.0｡2.2 不同退火温度对SSR-PCR反应结果的影响退火温度是引物和模板结合时的温度参数,是影响PCR扩增特异性的重要因素｡4个退火温度下的扩增结果(图2)表明,退火温度较低时(泳道1和泳道2的退火温度分别为48.9和52.7 ℃),引物与模板之间的错配几率增大,非特异性扩增条带多并且模糊;随着退火温度升高(泳道3和泳道4的退火温度分别为57.6和61.6 ℃),引物的特异性增加,条带也更加清晰,引物二聚体减少｡但是,退火温度更高则会使Taq DNA聚合酶活性降低或丧失,从而导致无法扩增出条带｡2.3 SSR-PCR反应体系的正交设计分析依据正交设计SSR-PCR的扩增结果(图3),对每个扩增反应进行评分(表2),由表2可知,根据极差分析结果可知,最优的方案为A2B4C3D4E2,即松阿扁叶蜂SSR-PCR最优的反应体系为25 μL体系中含1.00 U Taq DNA聚合酶､3.00 mmol/L Mg2+､3.75 mmol/L dNTPs､25.00 ng/μL DNA模板和10.00 μmol/L引物｡2.4 正交设计中各个因素对SSR-PCR反应的影响2.4.1 Taq DNA聚合酶用量对试验结果的影响方差分析结果表明,Taq DNA 聚合酶的用量是SSR-PCR反应中最为重要的因素,不同用量对扩增结果的影响达极显著水平(P<0.01)｡Taq DNA聚合酶用量高时不仅成本过高,而且容易产生非特异性扩增产物,用量过低则会导致SSR-PCR产物的合成效率下降｡2.4.2 Mg2+浓度对试验结果的影响Mg2+的作用主要是dNTP-Mg2+与核酸骨架相互作用,影响Taq DNA聚合酶的活性｡Mg2+浓度对SSR-PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低SSR-PCR扩增的特异性,浓度过低则影响SSR-PCR扩增产量甚至使SSR-PCR扩增失败而扩增不出条带｡一般的情况下Mg2+的浓度为0.5~5.0 mmol/L｡2.4.3 dNTPs浓度对试验结果的影响dNTPs的质量和浓度与PCR扩增效率有密切关系,方差分析结果显示dNTPs对试验结果的影响达到显著水平(P<0.05)｡dNTPs浓度过高会扩增出片状拖带或涂抹带,dNTPs能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低｡dNTPs浓度低时PCR产率及特异性均增高｡若dNTPs浓度高至4~6 mmol/L时,Taq DNA聚合酶活力要降低20%~30%,即产生底物抑制现象｡2.4.4 DNA模板浓度对试验结果的影响DNA模板浓度是制约扩增产物获得率及特异性的重要因素｡DNA模板浓度过低,分子碰撞的机率会降低,扩增产物少或不稳定;DNA模板浓度过高,会产生大量非特异性扩增小片段,运用琼脂糖凝胶电泳检测时会有拖尾现象,有时候还可能会没有PCR条带,特别是在DNA模板不纯的时候,会对SSR-PCR起抑制作用｡2.4.5 引物浓度对试验结果的影响引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且会增加引物之间形成二聚体的机会,降低引物及酶的浓度也可以减少错误引发;引物浓度过低会使扩增产物减少｡3 小结与讨论筛选微卫星(SSR)引物和建立稳定的SSR-PCR反应体系是SSR分子标记检测过程中的一个重要环节,也是SSR多态性应用的基础｡在利用SSR分子标记开展松阿扁叶蜂的种群遗传多样性的初期研究试验中,曾对SSR-PCR反应体系中各因素分别进行了单独的梯度试验,但发现不能兼顾各因素间的交互作用,因此利用正交设计的均衡分散性和整齐可比性来解决理论上所需要的与实际可行的试验次数的矛盾｡为了确定最佳的反应体系,本研究利用松阿扁叶蜂的基因组DNA为模板,对SSR-PCR反应体系中的几个重要组成因素如模板DNA､dNTPs､Mg2+､引物以及Taq DNA聚合酶进行了多因素联合优化的正交试验,由于SSR-PCR反应体系中各组分均可能对扩增的特异性､敏感性和产量产生影响,针对每个因素进行分析时,都可以找到各自最适的浓度｡但是采用多因素联合优化的正交试验设计,借助合适的正交表,可以充分考虑各因素间的交互作用,通过极差分析确定松阿扁叶蜂SSR-PCR最优的反应体系为25 μL体系中含1.00 U Taq DNA聚合酶､3.00 mmol/L Mg2+､3.75 mmol/L dNTPs､25.00 ng/μL DNA模板和10.00 μmol/L引物｡此条件下获得的条带清晰,且重复率高｡利用这个体系已成功地进行了松阿扁叶蜂几个种群的遗传多样性分析,希望该研究结果也能为其他昆虫包括叶蜂其他种类的SSR-PCR研究提供参考｡参考文献:[1] 萧刚柔.中国森林昆虫[M].北京:中国林业出版社,1992.1147-1149.[2] 孙文杰,同金侠,李新岗. 松阿扁叶蜂发生规律调查初报[J]. 西北农业大学学报,1997,25(6):105-107.[3] 赵瑞良,李仲明,秦平友. 松扁叶蜂生物学特性及防治的初步研究[J].林业科学,1979,51(3):226-228.[4] 娄巍.松扁叶蜂为害樟子松简报[J].森林病虫通讯,1988,18(2):18.[5] 杨晖,王宇萍. 岐山县油松扁叶蜂大发生原因与对策[J].植保技术与推广,2000,20(1):27-28.[6] 刘素云.油松扁叶蜂的发生与防治[J].河北林业科技,2002(3):33.[7] 张同心,孙绪艮,崔为正,等.松阿扁叶蜂对不同树种挥发物的触角电位反应[J].昆虫学报,2005,48(4):514-517.[8] 武星煜,辛恒,马虽有.松阿扁叶蜂发生规律及防治技术研究[J].甘肃林业科技,2005,30(1):20-23.[9] 梁中贵,李建军,刘建强,等. 松阿扁叶蜂研究进展[J].中国植保导刊,2007,27(5):14-17.[10] 杨水云,李继娥,吴明宇,等. 正交试验法在PCR反应条件优化中的作用[J].生物数学学报,2005,20(2):202-206.[11] 刘佳妮,桂富荣,李正跃.SSR分子标记技术在入侵昆虫学研究中的运用[J].植物保护,2008,34(3):7-11.[12] 叶红卫. 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