Elisa
ELISA完整详解
ELISA完整详解(一)原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、牽9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。
在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。
即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。
比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。
(二)操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
(简称洗涤，下同)。
2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。
然后洗涤。
(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。
37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于4 50nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D 值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
方法二用于检测未知抗体的间接法：用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。
ELISA实验
ELISA实验ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。
它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。
此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。
(一)原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。
在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。
即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。
比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。
(二)操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
(简称洗涤，下同)。
2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。
然后洗涤。
(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。
37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
什么叫ELISA法
ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称.近二十几年来,免疫学分析方法发展很快,特别是在使用标记了的抗原和抗体的分析技术以后,使原来许多经典的分析方法在敏感性和特异性方面都不能相比.继50年代的免疫荧光（IFA）和60年代的放射免疫(RIA)分析技术之后,1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）用于IgG定量测定的文章,使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法,建立了用酶来标记抗原或抗体的分析技术.它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术,是一种用酶标记抗原或抗体的方法.由于酶的高效生物催化作用,一个酶分子在数分钟内可以催化几十几百个底物分子发生反应,产生了放大作用,使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来.ELISA试验是一种敏感性高,特异性强,重复性好的实验诊断方法.将抗原,抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用原理有机地结合起来,可敏感地检测体液中微量的特异性抗体或抗原.此项技术自70年代初问世以来,发展十分迅速,由于其试剂稳定,易保存,操作简便,结果判断较客观等因素,目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域.ELISA基本原理ELISA是以免疫学反应为基础,将抗原,抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术.ELISA基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记,基本原理有三条: （1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面,可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附,并保持其免疫学活性;（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物,而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性;（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后,可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在,而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的,因此,可以按底物显色的程度显示试验结果.由于抗原,抗体的反应在一种固相载体——聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行,每加入一种试剂孵育后,可通过洗涤除去多余的游离反应物,从而保证试验结果的特异性与稳定性.在测定时,把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应.用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例.加入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析.由于酶的催化频率很高,故可极大地地放大反应效果,从而使测定方法达到很高的敏感度.。
ELISA简介
• 固相载体 聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的 性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原 来的免疫学活性 免疫学活性。 免疫学活性 • • 聚氯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比 聚苯乙烯高，但空白值也略高。 良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值 吸附性能好， 吸附性能好 孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之 低，孔底透明度高 间性能相近 性能相近。 性能相近
洗涤液
• 在板式ELISA中，常用的洗涤液为含0.2%吐 在板式ELISA中 常用的洗涤液为含0.2%吐 ELISA 0.2% 20磷酸盐缓冲液 磷酸盐缓冲液。 温20磷酸盐缓冲液。
结合物
• 即酶标记的抗体（或抗原）是ELISA中关键的试剂 即酶标记的抗体（或抗原） ELISA中关键的试剂 • • • • 1 酶的催化活性 2抗体（或抗原）的免疫活性 抗体（或抗原） 3不含或少含游离的抗体（或抗原） 不含或少含游离的抗体（或抗原） 4结合物要有良好的稳定性。 结合物要有良好的稳定性。
酶的底物
• • • • • • HRP的底物 HRP的底物 DH2+ H2O2=D+ 2H2O 上式中， 为供氧体， 为受氢体。 上式中， DH2为供氧体， H2O2为受氢体。 为供氧体 为受氢体 DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。 一般为无色化合物， 一般为无色化合物 经酶作用后成为有色的产物。 DH2如：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS 。 (OPD)、 (TMB)和 如 邻苯二胺(OPD) 四甲基联苯胺(TMB) OPD氧化后的产物呈橙红色 用酸终止酶反应后， 492nm处有最高吸 氧化后的产物呈橙红色， OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸 收峰，灵敏度高，比色方便， HRP结合物最常用的底物 结合物最常用的底物。 收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。 • TMB经HRP作用后产物显蓝色。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只 TMB经HRP作用后产物显蓝色 TMB性质较稳定 可配成溶液试剂， 作用后产物显蓝色。 性质较稳定， 需与H 溶液混和即成应用液。酶反应终止后，TMB产物由蓝色呈黄 需与H2O2溶液混和即成应用液。酶反应终止后，TMB产物由蓝色呈黄 可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm 450nm。 色，可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm。 HRP对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2、 HRP对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2、小分醇的过氧化物和尿 对氢受体的专一性很高 H2O2 素过氧化物(urea peroxide)。 素过氧化物(urea peroxide)。 HRP浓度越高的地方TMB和H2O2越多，TMB供氢越多，颜色越深。 HRP浓度越高的地方TMB和H2O2越多，TMB供氢越多，颜色越深。 浓度越高的地方TMB 越多 供氢越多
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1.4.2 间接法
是检测抗体最常用的方法 原理为利用酶标记的抗原抗体（抗人免疫球蛋白抗体） 以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。
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目 录
1.概念
一
二 三 四
ELISA的基础
ELISA所需条件
2.原理 3.特点
4.分类
ELISA实验步骤 常见问题解答
3
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1.1 ELISA 的概念
指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载 体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定 性和定量检测方法。
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3.1 实验前准备
②
试剂的准备： 20x 洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按 1:20 稀释，即 1 份的 20x 洗涤
缓冲液加 19 份的蒸馏水。
③
洗板： 手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置 1min 后甩尽
夹心法（测抗原、抗体） 间接法（测抗体） 竞争法（测抗原） ABS-ELISA 法（测抗原、抗体）
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1.4.1 夹心法
双抗体夹心法测抗原
双抗原夹心法测抗体
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ELISA原理和应用
ELISA原理和应用
ELISA（Enzyme-linked immunosorbent assay），又称酶联免疫吸附
测定法（ELISA），是一种常用的免疫分析学和生物化学技术，它利用特
异性抗体与抗原结合，并用酶促化学反应检测的方法来测定抗原或抗体的
浓度；便携式ELISA试剂盒则可广泛应用于食品、产品、环境等检测现场，便捷性更能满足现行监管检测的要求。
ELISA技术的发展，使得免疫检测
变得更为快捷、准确、方便，大大节省了成本，得到广泛应用。
1.抗体-抗原结合：ELISA最重要的部分，也是最关键的部分，是一
个特异性的免疫反应。
在被检样品中，抗原可以通过特异性的抗体被特异
性结合；
2. 酶-底物反应：在ELISA技术中，一般采用酶-底物 colorimetric 反应，抗原和抗体结合后，将起作用的酶连接到抗体上，从而发生底物和
酶的反应。
底物将引发酶反应，将颜色发生一个变化。
无论酶浓度多少，
使得颜色的变化可以测定；
3.度量反应：一般有两种反应测定方法，即光度测定法、仪器检测法，可以测定抗原或抗体的浓度，从而得出最终的结果。
ELISA的原理和基本类型
ELISA的原理和基本类型ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的免疫测定技术，通过测定抗原或抗体与其相应配体之间的特异性反应来检测目标物质的存在和浓度。
这项技术具有高灵敏度、高特异性和高通量性的优势，已广泛应用于医学、生物学、环境科学和食品安全等领域的研究和临床诊断中。
1.直接ELISA：直接ELISA是最简单的ELISA形式之一、在直接ELISA中，适量的抗原被吸附在固相（如微孔板）上后，样本中的抗体与其结合。
接着，通过与该抗体特异性结合的酶标记抗体检测目标物质的存在与否。
最后，加入底物使酶催化发生彩色反应，根据颜色的强度来确定抗原浓度。
2.间接ELISA：间接ELISA是最常用的ELISA形式之一、在间接ELISA中，抗原被吸附在固相上，然后与试样中的抗体结合。
随后，加入与试样中抗体结合的酶标记抗体，再加入底物以进行酶催化的彩色反应。
该方法的优势在于，只需要极少量目标抗原即可进行检测。
3.竞争ELISA：竞争ELISA用于测定抗体或抗原浓度，是一种定量分析的方法。
在竞争ELISA中，抗原或抗体与固相相结合的抗体或抗原发生竞争结合，测定竞争反应的结果来确定目标物质的浓度。
4.夹心ELISA：夹心ELISA又被称为“双抗体夹心ELISA”。
该方法可用于检测样品中特异的抗原或抗体。
在夹心ELISA中，首先将一种抗体吸附在固相上，样品中的抗原与之结合。
然后加入酶标记的第二抗体与抗原再次结合。
最后，加底物使酶发生催化反应，并测量酶催化发生的信号。
总而言之，ELISA是一种高灵敏度、高特异性的免疫测定技术，可以通过测定抗原和抗体之间的特异性反应来快速、准确地检测目标物质的存在和浓度。
在不同类型的ELISA中，抗原或抗体通过固相吸附、结合特异性的酶标记抗体、进行酶催化反应的彩色反应来实现检测。
ELISA技术在医学、生物学和环境科学等领域的研究和诊断中发挥了重要作用。
elisa原理及步骤
elisa原理及步骤Elisa原理及步骤。
ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）是一种常用的免疫学实验方法，用于检测抗体或抗原的存在和浓度。
它的原理基于酶标记的抗体或抗原与待检测样品中的特定分子结合，然后通过酶介体的作用产生可定量检测的信号。
ELISA方法具有高灵敏度、高特异性和简单操作的特点，因此在生物医学研究和临床诊断中得到了广泛的应用。
ELISA的原理。
ELISA方法的原理是基于抗体-抗原的特异性结合。
在ELISA实验中，待检测的抗原或抗体首先被吸附在微孔板上，然后加入特异性的酶标记抗体或抗原，形成抗原-抗体-酶标记抗体复合物。
随后，通过加入底物使酶产生可定量检测的信号，最终通过光度计或荧光计测定信号的强度，从而确定待检测样品中抗原或抗体的浓度。
ELISA的步骤。
1. 样品处理，将待检测的样品（血清、尿液、细胞上清液等）进行处理，如离心、稀释等，以便得到适合实验的样品。
2. 固定抗原或抗体，将待检测的抗原或抗体溶液加入微孔板中，使其吸附在板上，然后对板进行洗涤，以去除未结合的物质。
3. 加入酶标记抗体或抗原，将特异性的酶标记抗体或抗原加入微孔板中，与固定的抗原或抗体结合，形成复合物。
4. 洗涤，对微孔板进行洗涤，以去除未结合的酶标记抗体或抗原。
5. 加入底物，加入适当的底物，使酶产生可定量检测的信号。
6. 反应停止，在适当的时间后，加入反应停止液停止酶的反应。
7. 测定光密度，使用光度计或荧光计测定产生的信号的强度，从而确定待检测样品中抗原或抗体的浓度。
ELISA方法的应用。
ELISA方法在临床诊断、生物医学研究和药物开发等领域得到了广泛的应用。
在临床诊断中，ELISA方法常用于检测感染病原体的抗体、抗原或相关蛋白质，如HIV、乙肝病毒、丙肝病毒等。
在生物医学研究中，ELISA方法常用于检测细胞因子、生长因子、激素等蛋白质的浓度，以及疾病标志物的检测。
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测特定抗原或抗体在样本中的存在量。
本操作规程旨在提供详细的ELISA实验步骤，确保实验的准确性和可重复性。
二、材料和试剂准备1. 微孔板：96孔或其他规格的微孔板。
2. 抗原或抗体：根据实验需求选择适当的抗原或抗体。
3. 样本：待测样本，如血清、尿液等。
4. 酶标记抗体：选择与待测抗原或抗体特异性结合的酶标记抗体。
5. 酶标记底物：选择适当的酶标记底物，如TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）。
6. 停止液：选择适当的停止液，如硫酸。
三、实验步骤1. 预处理a. 将微孔板的孔洗净，并将待测样本、阳性对照和阴性对照分别加入孔中。
b. 将微孔板密封或覆盖，孵育一定时间，使抗原或抗体与样本中的特定成分结合。
c. 弃去孔中液体，将孔洗净。
2. 添加酶标记抗体a. 将酶标记抗体加入每个孔中，使其与已结合在孔中的抗原或抗体结合。
b. 将微孔板密封或覆盖，孵育一定时间，使酶标记抗体与抗原或抗体结合。
3. 洗涤a. 弃去孔中液体，将孔洗净，重复2-3次，以去除未结合的酶标记抗体。
4. 添加酶标记底物a. 将酶标记底物加入每个孔中，使其与酶标记抗体结合。
b. 将微孔板密封或覆盖，孵育一定时间，使底物与酶反应产生显色。
5. 反应停止a. 加入适量的停止液，停止底物与酶的反应，防止进一步显色。
b. 使用酶标仪测量吸光度，记录各孔的光密度值。
6. 数据分析a. 根据实验设计和标准曲线，计算待测样本中特定抗原或抗体的浓度。
b. 统计数据并进行统计学分析，如平均值、标准差、t检验等。
四、实验注意事项1. 所有操作都应在洁净的实验室环境中进行，避免污染。
2. 严格按照实验步骤和操作规程进行，确保实验的准确性和可重复性。
3. 注意使用适当的阴性对照和阳性对照，以验证实验结果的准确性。
4. 注意控制实验条件，如温度、时间等，以保证实验结果的可比性。
elisa的名词解释
elisa的名词解释
ELISA是酶联免疫吸附剂测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）的简称，是免疫学中的一种技术，用于检测特异性抗体或抗原的免疫反应。
ELISA是一种灵敏、快速、特异的检测方法，广泛应用于生物医学领域，如感染性疾病的诊断、免疫学研究、药物筛选等。
ELISA的基本原理是将抗原或抗体吸附到固相载体表面，加入酶标记的抗体或抗原，加入底物显色，根据颜色反应判断是否含有待测抗原或抗体。
ELISA有多种类型，如直接ELISA、间接ELISA、夹心ELISA 等。
其中夹心ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是最常用的一种，它通过将抗原或抗体结合到酶标板上，再加入待测抗体或抗原，最后加入底物显色，根据颜色反应判断是否含有待测抗原或抗体。
ELISA具有高灵敏度、高特异性和可定量等优点。
然而，ELISA也存在一些局限性，如操作繁琐、需要专业人员操作、试剂成本高等。
此外，由于ELISA只能检测特异性抗体或抗原，因此不能用于检测非特异性免疫反应。
ELISA基础知识
（二抗） 二抗）
7.洗涤 8.加底物显色 9.观察结果
夹心法
1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。 2）加受检样本，保温反应。样本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物 。洗涤除去其他未结合物质。 3）加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结 合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与样本中受检抗原的量正相关。 4）加底物显色。
尽量避免酶标板叠放在一起 定期校准移液器， 定期校准移液器，确保移液器的正 确使用 酶标板用封条密封或者加盖 确定正确的洗板步骤 读板时清理干净酶标板底部
ELISA操作过程中可能遇到的问题 操作过程中可能遇到的问题
问题 可能的原因
试剂或者耗材污染 阴性对照产生了阳性的 结果 洗板出现问题 使用了过多的抗体 二抗产生了非特异性吸附 显色液不新鲜 显色反应时间过长没有终止 整板出现高背景 试剂或者耗材污染 反应温度过高导致的非特异性吸附 封闭条件不佳导致的非特异性吸附
10X PBS Tween 1X PBST (20%Tween) 10X CBS 包被缓冲液） （包被缓冲液） 1X CBS
室温 室温
3个月 3个月
表面活性剂。去垢剂的作用， 表面活性剂。去垢剂的作用，使蛋白质之间的非特 异性结合减弱，从而降低实验背景。 异性结合减弱，从而降低实验背景。 作用：降低背景。若含Tween太高， Tween太高 作用：降低背景。若含Tween太高，致使抗原抗体的 特异性结合也被减弱，从而影响结果。 特异性结合也被减弱，从而影响结果。 碳酸盐缓冲液 PH=9.6 包被可溶性蛋白， 包被可溶性蛋白，便于蛋白质吸附到酶标板上 碳酸盐缓冲液
牛奶 1：2500
ELISA的原理和类型
ELISA的原理和类型ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常见的免疫学实验技术，用于检测和诊断环境样品、食物、血液以及其他生物样品中的特定分子（如蛋白质、抗体、抗原等）。
ELISA具有高灵敏度、高特异性和较低的成本，广泛应用于医学、农业、环境科学和食品工业等领域。
间接式ELISA是最常用和经典的类型，其原理基本分为四步：1.固相吸附：将待测抗原分子固定在微孔板上，一般使用多孔质料（如聚合物）涂覆表面。
2.阻塞：为了防止非特异性结合，可以在固相吸附的基础上加入一层非特异性蛋白质（如牛血清白蛋白，BSA）来阻止未被抗原结合的空位。
3.特异性抗体结合：在孔中加入与抗原特异性结合的抗体，抗体会和已固定的抗原结合形成抗原-抗体复合物。
4.标记酶和底物检测：将酶标记的二级抗体加入孔中，与特异性抗体结合，再加入一种底物，使酶发生反应，并产生可观察的信号，如颜色反应。
夹心ELISA和间接式ELISA的步骤类似，但有所区别。
夹心ELISA在特异性抗体结合前和后都进行了固相吸附，因此可以检测出更弱的信号。
夹心ELISA也有更高的特异性，因为特异性抗体的结合位置被抗原所固定。
竞争ELISA用于测量待测样品中特定抗原的浓度。
与其他ELISA类型不同的是，竞争ELISA中待测物和标准抗原竞争与已固定抗原的特异性抗体结合。
待测样品中特定抗原的浓度越高，抗原与抗体结合的信号就越弱。
竞争ELISA的原理和标准曲线相关，用标准曲线中不同抗原浓度对应的信号强度来计算待测物的浓度。
直接ELISA是一种较少使用的类型，它通过直接将酶标记的特异性抗体与待测抗原结合，然后检测酶标记物的反应来获得结果。
直接ELISA省略了二级抗体的使用，所以比其他类型的ELISA快速，但灵敏度较低。
ELISA技术的应用范围非常广泛，如检测疾病诊断和筛查、食品卫生检测、生物制药质量控制以及环境监测等。
它通过测量特定分子的浓度，可以定量评估样品中待测物的含量，从而实现对疾病、食品质量或环境污染的检测、监测和控制。
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测和定量分析生物样本中的特定抗原或抗体。
本操作规程旨在提供一套标准化的ELISA操作步骤，以确保实验结果的准确性和可重复性。
二、材料和试剂准备1. 微孔板：96孔的酶联免疫吸附板。
2. 样本：待测试的生物样本，如血清、尿液等。
3. 标准品：已知浓度的目标抗原或抗体。
4. 缓冲液：适用于特定ELISA试剂盒的缓冲液，如PBS（磷酸盐缓冲液）。
5. 洗涤缓冲液：含有洗涤剂的缓冲液，如PBS-T（磷酸盐缓冲液-0.05% Tween-20）。
6. 酶标记的二抗：与目标抗原或抗体特异性结合的二抗，如HRP（辣根过氧化物酶）标记的抗人IgG。
7. 底物：与酶标记结合并产生可测量信号的底物，如TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）溶液。
8. 停止液：用于停止底物反应的溶液，如2M硫酸。
三、操作步骤1. 准备微孔板a. 将微孔板放置在工作台上。
b. 标记每个孔的编号，以便记录结果。
c. 添加适量的样本和标准品至不同的孔中，每个孔的体积应相同。
d. 添加适量的缓冲液至空白对照孔中。
2. 孵育a. 将微孔板盖好，使用封闭膜密封。
b. 将微孔板置于恒温孵育箱中，在适当的温度下孵育一段时间，通常为1小时。
3. 洗涤a. 将微孔板倒置，轻轻拍打以除去孔内液体。
b. 使用洗涤缓冲液，将每个孔洗涤3-4次，每次洗涤约200μL。
c. 在洗涤完成后，轻轻拍打微孔板以除去多余的洗涤缓冲液。
4. 添加酶标记的二抗a. 加入适量的酶标记的二抗至每个孔中，注意避免交叉污染。
b. 盖好微孔板，继续在恒温孵育箱中孵育一段时间，通常为1小时。
5. 再次洗涤a. 重复第3步的洗涤步骤，确保洗净未结合的二抗。
6. 底物反应a. 加入适量的底物（TMB溶液）至每个孔中。
b. 在暗处孵育一定时间，通常为15-30分钟，直至产生明显的颜色反应。
ELISA原理
1.将抗原包被在固相载体上。 2.如样品中含有抗体，则结合 为抗原抗体复合物。 3.再加入酶标记抗原，则结合 为抗原-抗体-酶标记抗原复合 物。
4.酶催化底物并显色。
抗原
固相载体
双抗原夹心法示意图
酶
抗抗 体
酶标记 抗抗体
抗体
1.将抗原包被在固相载体上。 2.如样品中含有抗体，则结合 为抗原抗体复合物。 3.再加入酶标记抗抗体，则结 合为抗原-抗体-酶标记抗抗体 复合物。
• 可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。
显色
• 显色是酶催化无色的底物生成有色产物 的温育反应。反应的温度和时间仍是影 响显色的因素。在一定时间内，阴性孔 可保持无色，而阳性孔则随时间的延长 而呈色加强。适当提高温度有助于加速 显色进行。
比色
• 拭干板底附着的液体，然后将板正确放 入酶标比色仪中。
• 均相EIA可不需进行游离的和结合的标记 物的分离而直接测定标记物。均相EIA在 临床检验中较少应用。
• 非均相EIA需先进行游离的和结合的标记 物的分离。
这种固相免疫酶测定方法在1971年最初 建立时称为酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay），简称 ELISA。
• （1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）； • （2）酶标记的抗原或抗体（结合物）； • （3）酶的底物； • （4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品； • （5）结合物及标本的稀释液； • （6）洗涤液； • （7）酶反应终止液
免疫吸附剂
• 固相载体--聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能， 抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活 性。
• 所有的ELISA固相均需封闭。
ELISA知识简介
其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原 结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少， 因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的，可直 接包被固相。
如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包 被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形 成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质，然后再加标本和酶标 抗体进行竞争结合反应。
图3 甲型肝炎病人血清中IgG抗体和IgM 抗 体出现的时间和水平。
每一系B细胞只产生针对某一抗原决定簇的抗体。如将 多种抗原或含有多个抗原决定簇的抗原注入机体，将由多 系的B细胞产生相应的多种抗体，这些抗体均存在于免疫 血清中。
免疫测定中所用的抗血清一般用抗原免疫兔、羊或马 制得。产生抗体的B细胞可在体外与繁殖力强的肿瘤细胞 融合成杂交瘤细胞。将单个杂交瘤细胞分离，在体内或体 外培养而分泌的抗体单克隆抗体monoclonal antibody， McAb或Mab）。单克隆抗体仅针对一种抗原决定簇，具有 很高的特异性。单克隆抗体通常用抗原免疫小鼠制备。将 免疫的脾细胞（含产生抗体的B细胞）与小鼠肿瘤细胞融 合，分离杂交瘤细胞，接种于小鼠腹腔，产生的腹水中含 有浓度很高的单克隆抗体。
1.3.2 最适比例
在恒定量的抗体中加入递增量的抗原形成抗体复合物.
抗原抗体比例最合适的范围，称为等价带（zone of quivalence）。在等价带前后分别为抗体过剩带和抗原过剩带 。
如果抗原或抗体极度过剩，则无沉淀物形成，在免疫测定 中称为带现象（zone nomenon）。抗体过量称为前带（ prezone），抗原地过量称为后带（postzone）。在用免疫学 方法测定抗原时，应使反应系统中有足够的抗体量，否则测 得的量会小于实际含量，甚至出现假阴性。
ELISA原理和分类(附图解)
一、ELISＡ旳原理ELIＳA旳基础是抗原或抗体旳固相化及抗原或抗体旳酶标记。
结合在固相载体表面旳抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记旳抗原或抗体既保存其免疫学活性，又保存酶旳活性。
在测定期,受检标本(测定其中旳抗体或抗原）与固相载体表面旳抗原或抗体起反映。
用洗涤旳措施使固相载体上形成旳抗原抗体复合物与液体中旳其他物质分开。
再加入酶标记旳抗原或抗体，也通过反映而结合在固相载体上。
此时固相上旳酶量与标本中受检物质旳量呈一定旳比例。
加入酶反映旳底物后,底物被酶催化成为有色产物，产物旳量与标本中受检物质旳量直接有关,故可根据呈色旳深浅进行定性或定量分析。
由于酶旳催化效率很高,间接地放大了免疫反映旳成果,使测定措施达到很高旳敏感度。
二、EＬISA旳类型ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体。
在这种测定措施中有三个必要旳试剂:(1)固相旳抗原或抗体,即＂免疫吸附剂＂（immunoｓorbｅnｔ)；（2)酶标记旳抗原或抗体，称为“酶联物”、“结合物”（conｊugate）；（3)酶反映旳底物。
根据试剂旳来源和标本旳状况以及检测旳具体条件,可设计出多种不同类型旳检测措施。
用于临床检查旳ELＩS Ａ重要有如下几种类型:（一）双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用旳措施,操作环节如下：(1）将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体。
洗涤除去未结合旳抗体及杂质。
（2) 加受检标本,保温反映。
标本中旳抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物。
洗涤除去其他未结合物质。
(3) 加酶标抗体,保温反映。
固相免疫复合物上旳抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合旳酶标抗体。
此时固相载体上带有旳酶量与标本中受检抗原旳量有关。
(4) 加底物显色。
固相上旳酶催化底物成为有色产物。
通过比色,测知标本中抗原旳量。
在临床检查中，此法合用于检查多种蛋白质等大分子抗原，例如HB ｓＡｇ、HBeAg、ＡFＰ、ｈＣG等。
只要获得针对受检抗原旳异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。
ELISA知识简介PPT课件
总结与展望：ELISA技术发展趋 势预测
2024/1/26
28
新型标记物在ELISA中应用前景探讨
荧光标记物
高灵敏度、宽线性范围，适用于低丰度蛋白检测 。
酶标记物
高催化活性，可放大信号，提高检测灵敏度。
纳米材料标记物
独特的光学、电学性质，可增强信号并降低背景 干扰。
2024/1/26
29
2024/1/26
肿瘤治疗监测
利用ELISA技术监测肿瘤患 者治疗过程中肿瘤标志物 的变化，评估治疗效果和 预后。
肿瘤复发监测
定期采用ELISA方法检测肿 瘤患者康复期肿瘤标志物 的水平，及时发现肿瘤复 发迹象。
16
药物滥用检测中ELISA方法应用
毒品滥用检测
采用ELISA技术检测尿液或血液中的毒品代谢物，如吗啡、可卡 因等，用于毒品滥用的筛查和确认。
多重检测技术在提高通量方面优势分析
1 2
多通道检测
同时检测多个样本，提高检测效率。
多重荧光标记
实现多目标蛋白同时检测，减少实验误差。
3
微流控芯片技术
集成化、微型化，降低样本消耗和检测成本。
2024/1/26
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自动化和智能化设备在ELISA领域应用前景
自动化样本处理
减少人工操作，提高实验可重复性。
等疾病。
2024/1/26
03
其他自身抗体检测
ELISA还可应用于抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）、抗磷脂抗体（
APL）等自身抗体的检测，为自身免疫性疾病的诊断提供依据。
15
肿瘤标志物筛查与监测进展
肿瘤标志物筛查
采用ELISA方法检测肿瘤标 志物，如AFP、CEA、 CA19-9等，实现肿瘤的早 期发现和筛查。
ELISA原理及步骤
ELISA原理及步骤ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测和定量特定抗原或抗体的方法。
ELISA技术可广泛应用于医学、生物学、农业和环境科学等领域，具有高灵敏度、高特异性和高通量的优点。
直接ELISA是最简单的一种ELISA形式，其中将特异性抗体直接固定在微孔板上，然后加入样品，特异性抗原与固相抗体结合，并使用标记的二抗或酶偶联的二抗进行检测。
标记的二抗与样品中的抗原结合，从而实现抗原的检测。
间接ELISA类似于直接ELISA，但使用的是一种抗体，该抗体不与待检测抗原直接结合，而是与特异性抗体结合。
首先，特异性抗体被固定在微孔板上，然后样品中的抗原经过结合，在该阶段，非特异性蛋白质将被洗掉。
接下来，加入与待测抗原特异性结合的二抗。
最后，使用标记的二抗或酶偶联的二抗进行检测，以确认待测抗原的存在。
竞争ELISA用于检测分析物，如细胞因子、激素或抗生素等。
在该方法中，待检测抗原被固定在微孔板上，标记的分析物样品添加到孔中，这些样品中的分析物会与待测抗原竞争结合到固定的抗体上。
最后，通过测量分析物与固定抗体的竞争程度，来确定分析物的浓度。
间接竞争ELISA则结合了间接ELISA和竞争ELISA的原理，主要用于检测抗体的含量。
在该方法中，先固定检测抗体在微孔板上，再加入不同浓度的标准抗体或待测抗体样品。
标准或待测抗体与固定的检测抗体竞争结合，最终通过测量标准或待测抗体与检测抗体的竞争程度，来确定抗体的含量。
1.用特异性抗体涂覆固定在微孔板上，这可以通过免洗、半干燥或吸附方式实现。
2.加入样品，让待测抗原与固定在板上的特异性抗体结合。
3.洗涤板子以去除非特异性蛋白质，以减少干扰。
4.添加二抗或酶偶联的二抗，它会与待测抗原特异性结合。
5.再次洗涤板子以去除未结合的二抗。
6.加入底物，底物受酶的作用而发生颜色变化。
7.加入终止液以停止反应。
elisa综述
酶联免疫法（Elisa）ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。
免疫测定（immunoassay，IA）是应用免疫学技术测定标本的方法。
在临床检验中主要通过抗原抗体反应检测体液中的抗体或抗原性物质。
此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。
原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。
在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。
即:用于检测抗体的间接法、用于检测抗原的双抗体夹心法以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。
比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。
一、ELISA的基本应用方法方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
(简称洗涤，下同)。
2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。
然后洗涤。
(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。
37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
elisa常用方法及其原理
elisa常用方法及其原理Elisa（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验方法，广泛应用于生物学和医学研究中。
本文将介绍Elisa的常用方法及其原理。
一、Elisa的基本原理Elisa是一种通过检测抗原-抗体反应来测定物质浓度的方法。
其基本原理是将待测物质（抗原或抗体）固定在固相载体上，然后加入特异性的酶标记二抗，通过酶标记物的催化作用，将待测物质与酶底物反应产生可测定的信号。
Elisa可以根据待测物质的特异性与酶标记物的催化作用来测定物质的浓度。
二、Elisa的常用方法1.直接Elisa法：将待测抗原直接固定在固相载体上，然后加入酶标记的第一抗体，通过酶标记物的催化作用来测定抗原的浓度。
这种方法简单快速，适用于抗原浓度较高的情况。
2.间接Elisa法：将待测抗原固定在固相载体上，然后加入与抗原特异性结合的第一抗体，再加入酶标记的第二抗体，通过酶标记物的催化作用来测定抗原的浓度。
这种方法灵敏度较高，适用于抗原浓度较低的情况。
3.竞争Elisa法：将待测抗原固定在固相载体上，然后加入与抗原特异性结合的酶标记抗体和待测样品，通过抗原与酶标记抗体的竞争来测定抗原的浓度。
这种方法可以测定抗原和抗体的亲和力，适用于测定抗原或抗体的亲和力常数。
4.间接竞争Elisa法：将待测抗原固定在固相载体上，然后加入与抗原特异性结合的第一抗体，再加入酶标记的第二抗体和待测样品，通过第一抗体与第二抗体的竞争来测定抗原的浓度。
这种方法可以测定抗原和抗体的亲和力，适用于测定抗原或抗体的亲和力常数。
三、Elisa的操作步骤1.涂覆：将待测物质（抗原或抗体）溶液加入固相载体上，使其吸附固定在载体表面。
2.阻断：加入适当的阻断剂，防止非特异性结合。
3.第一抗体反应：加入特异性的第一抗体，使其与待测物质发生特异性结合。
4.洗涤：用洗涤缓冲液洗去未结合的抗体。
5.酶标记抗体反应：加入酶标记的第二抗体，使其与第一抗体结合。
6.洗涤：用洗涤缓冲液洗去未结合的酶标记抗体。
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ELISA方法的基本原理和操作步骤
基本原理
1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。
这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。
②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。
在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。
由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
方法类型和操作步骤
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。
在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。
根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。
（三）间接法测抗体
间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。
操作步骤如下：
（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。
（2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。
经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。
其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。
（3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。
洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。
例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。
（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。
本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体
（三）间接法测抗体(我公司分装TORCH及传染病试剂盒大多采用本法)
间接法是检测抗体常用的方法。
其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法（见图2-3）。
操作步骤如下：
（1）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。
洗涤除去未结合的抗原及杂质。
（2）加稀释的受检血清，保温反应。
血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。
经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。
（3）加酶标抗抗体。
可用酶标抗人Ig以检测总抗体，但一般多用酶标抗人IgG检测I gG抗体。
固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。
洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。
（4）加底物显色
本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。
间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
间接法成功的关键在于抗原的纯度。
虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。
特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能与受过E.Coli感染者血清中的抗E.Coli抗体发生反应。
抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig去除，试验中也发生假阳性反应。
另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果。
间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体。
病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。
IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。
因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间隙。
另外，在检测过程中标本须先行稀释（1:40~1:200），以避免过高的阴性本底影响结果的判断。