新城疫抗体检测

新城疫的抗体检测

某些病毒具有凝集某种（些）动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的实验称血球凝集试验，以此来推断被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的血凝可为相应的抗体所抑制，即血球凝集抑制实验（HI），通过血凝与血凝抑制试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。一目的意义

1免疫监测（1）免疫效果评价（2）免疫时机确定

2诊断疾病（根据有无抗体或抗体的高低）

3流行病学调查

二试验仪器与试剂

1试验仪器离心机、离心管两支、50ml量筒一个、V型微量反应板、微量加样器（移液器）、塑料吸头（黄色）若干、1ml吸管1支、胶头滴管两支、微量振荡器、

电热恒温培养箱、托盘天平。

2试验试剂鸡新城疫抗原、流感H5、H9抗原、1%鸡红细胞、生理盐水、3.8%柠檬酸钠抗凝剂、待检血清。

三方法

1病毒的血凝试验

1.1 3.8%柠檬酸钠抗凝剂的配制：用托盘天平称取柠檬酸钠3.8克溶于100ml蒸馏水或纯净水中，摇匀使其充分溶解即可，有条件的可121℃高压蒸汽灭菌20分钟，冷却至室温后置4℃冰箱中保存备用。

1.2 1%鸡红细胞制备过程：事先用5ml（或10ml）的注射器吸入抗凝剂若干（其量为所需血量的1/5）,从健康公鸡（未经新城疫疫苗注射）的心脏或翅下静脉采取2-4毫升血液,以2000转每分钟，离心5分钟，吸去上清液（注意要将血细胞泥表面的一种薄膜吸净）。然后用生理盐水（用量为血细胞泥的5-10倍）洗红细胞，离心5分钟，弃去上清液，如此反复洗3-5次，直至上清液透明清亮为止，最后一次要用生理盐水将血细胞泥稀释成1%浓度，然后置4℃冰箱备用（一般可保存3天）。

1.3 红细胞凝集试验（血凝试验）操作方法（见表1）：

（1）取一块洁净的96孔V型微量血凝反应板，用微量移液器从第一列第一孔开始依次加入生理盐水，每孔25微升，直至加到第十五孔（第一列12孔，第二列3孔）。

（2）取新城疫抗原液25微升加入第一孔中，充分混合后吸取25微升加入第二孔中，如此直至第14孔，混合后吸取25微升丢弃，第15孔不加病毒为对照。

（3）更换移液器前端的塑料吸头，每孔加已备的1%鸡红细胞液各25微升（注意从后往前加）。

（4）将反应板置微型震荡器上，振动混合1分钟，取下置37℃恒温箱中作用30分钟后开始观察结果，注意每五分钟观察一次，直至30分钟，判定并记录结果。

判定结果如下：

++++——红细胞全部凝集，均匀分布于孔底。

++-------红细胞部分凝集，沉积于孔底呈小圆点状。

-——红细胞全部不凝集，沉积于孔底呈圆点状。

以使红细胞全部凝集的病毒最高稀释倍数为该病毒的凝集效价。4单位病毒的确定，以上述血凝价除以4即为4单位病毒，如血凝价为1:128，则1:128的0.1ml中有一个凝集单位，4单位病毒为128/4=32，即1:32为4个凝集单位。

表1：血凝试验（HA ） 单位：微升

稀释倍数 2 4 8 16 32 64 128

256

512

1024 2048 4096

8192 16384

对照组

生理盐水 25 25 25 抗原 25

25

25

1%鸡红细胞

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

振荡混匀置30℃恒温箱30分钟

2血凝抑制试验（HI ）血凝试验可以被病毒血清所抑制，因此可以通过血凝抑制试验检测抗病毒抗体。根据抗体效价的高低，可制订预防疾病的合理的免疫程序，也可间接得知鸡群是否存在病毒，对科学地防治具有重要意义。具体方法如下（见表2）：

（1） 清洁的96孔V 型微量血清反应板一块，在每孔中加生理盐水25微升（每一份血清加一列）。

（2） 将被检血清25微升加入第1孔中，充分混合后，取25微升加入第2孔中，如此稀释直至第10孔，第11孔不加血清为抗原对照孔，第12不加血清和抗原为红细胞对照。 （3） 根据血凝试验测定的病毒效价，配制4个血凝单位病毒稀释液。 （4） 将反应板置混合器上振荡3分钟，取下放室温10分钟。 （5） 每孔中加入1％鸡红细胞各25微升。

（6） 置微型混合器上振荡３分钟，取下放室温15分钟开始观察，至60分钟判定记录结果．

振荡混匀1分钟后置37℃恒温箱中作用15分钟 1%鸡红细胞 25 25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

25

振荡混匀1分钟后置37℃恒温箱中作用15分钟

以100％抑制凝集的血清最大稀释倍数为该血清的血凝抑制效价即滴度。