核酸分子杂交与应用优秀课件
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核酸分子杂交课件
探针标记
将标记物（如放射性同位素、荧 光染料等）连接到探针上，以便 于后续的信号检测。
杂交反应
预杂交
将样品和探针在一定温度和盐浓度下 进行预杂交，使探针与非目的序列的 核酸分子结合，排除非特异性结合。
杂交
将预杂交后的样品和探针进行杂交， 使探针与目的序列的核酸分子结合。
信号检测
放射自显影
对于放射性标记的探针， 可以通过放射自显影技术 检测杂交信号。
背景干扰
由于非特异性结合或交叉杂交的存在，可 能会导致背景干扰，影响结果的判断。
A 对探针质量要求高
探针的长度、纯度、标记方式等因 素都会影响杂交的效率和特异性， 因此需要高质量的探针才能获得可
靠的结果。
B
C
D
实验条件要求高
核酸分子杂交实验需要严格的实验条件， 如温度、盐浓度等，操作不当会影响实验 结果。
02
核酸分子杂交的基本步 骤
样品制备
01
02
03
细胞或组织破碎
通过物理或化学方法破碎 细胞或组织，释放出核酸 分子。
核酸提取
利用离心、沉淀、洗涤等 手段去除细胞碎片和蛋白 质等杂质，提取出核酸。
核酸变性
通过加热或化学试剂使核 酸双螺旋结构解开，形成 单链。
探针制备
目的基因克隆
将目的基因从生物体中克隆到载 体中，形成重组DNA分子。
生物信息学
利用生物信息学技术对核酸分子杂交 数据进行深入分析，挖掘更多有价值 的信息。
自动化与高通量技术
自动化技术
通过自动化技术实现核酸分子杂 交的快速、准确和高效检测，提
高检测效率。
高通量技术
利用高通量技术实现大规模样本 的同时检测，提高检测通量。
将标记物（如放射性同位素、荧 光染料等）连接到探针上，以便 于后续的信号检测。
杂交反应
预杂交
将样品和探针在一定温度和盐浓度下 进行预杂交，使探针与非目的序列的 核酸分子结合，排除非特异性结合。
杂交
将预杂交后的样品和探针进行杂交， 使探针与目的序列的核酸分子结合。
信号检测
放射自显影
对于放射性标记的探针， 可以通过放射自显影技术 检测杂交信号。
背景干扰
由于非特异性结合或交叉杂交的存在，可 能会导致背景干扰，影响结果的判断。
A 对探针质量要求高
探针的长度、纯度、标记方式等因 素都会影响杂交的效率和特异性， 因此需要高质量的探针才能获得可
靠的结果。
B
C
D
实验条件要求高
核酸分子杂交实验需要严格的实验条件， 如温度、盐浓度等，操作不当会影响实验 结果。
02
核酸分子杂交的基本步 骤
样品制备
01
02
03
细胞或组织破碎
通过物理或化学方法破碎 细胞或组织，释放出核酸 分子。
核酸提取
利用离心、沉淀、洗涤等 手段去除细胞碎片和蛋白 质等杂质，提取出核酸。
核酸变性
通过加热或化学试剂使核 酸双螺旋结构解开，形成 单链。
探针制备
目的基因克隆
将目的基因从生物体中克隆到载 体中，形成重组DNA分子。
生物信息学
利用生物信息学技术对核酸分子杂交 数据进行深入分析，挖掘更多有价值 的信息。
自动化与高通量技术
自动化技术
通过自动化技术实现核酸分子杂 交的快速、准确和高效检测，提
高检测效率。
高通量技术
利用高通量技术实现大规模样本 的同时检测，提高检测通量。
核酸分子杂交与应用
• 基因组DNA探针：有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针，多为某一基 因的全部或部分序列，或某一非编码序列。
• cDNA探针：以mRNA为模板经过逆转录酶催化产生的互补于mRNA的DNA链。
2020年10月29日星期
5
四
探针的种类
• DNA探针优点： • 1、一般克隆在质粒载体中，可以无限繁殖； • 2、DNA探针不易降解 • 3、DNA的标记方法比较成熟。
牛血清白蛋白
2020年10月29日星期
12
四
标记步骤
• 3、加入除标记核苷酸外的其他三种脱氧核糖核苷酸溶液(也可以是多种标记核苷酸)， 20mmol/L溶液各1μl。 以下操作要在同位素工作室中有防护措施的情况下进行操作
• 4、加入100μCi(10μl)标记的核苷酸溶液。注：应贮存在－20oC冰箱中，使用前在室 温下放置15～30分钟融化。要尽量减少冻融次数。
大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末 端标记法
T4DNA聚合酶标记法
2020年10月29日星期
23
四
大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末
端标记法：
标记反应步骤： (1)在反应管中依次加入下列试剂并混匀
DNA
1μg
10xKlenow片段缓冲液
2mmol/L3种dNTP(无dATP)
[α-32P]dATP
2020年10月29日星期
13
四
标记步骤
• 5、加入无菌蒸馏水，至终体积为46.5μl，混匀 • 6、加入0.5μl稀释的DNase I溶液，混匀 • 7、加入1μl(5U)DNA聚合酶I溶液，混匀 注：以上操作均在冰浴中进行 • 8、置14～16oC水浴中保温1～2小时 • 9、加入2μl 0.5mol/L EDTA终止反应 • 10、纯化标记的DNA探针
• cDNA探针：以mRNA为模板经过逆转录酶催化产生的互补于mRNA的DNA链。
2020年10月29日星期
5
四
探针的种类
• DNA探针优点： • 1、一般克隆在质粒载体中，可以无限繁殖； • 2、DNA探针不易降解 • 3、DNA的标记方法比较成熟。
牛血清白蛋白
2020年10月29日星期
12
四
标记步骤
• 3、加入除标记核苷酸外的其他三种脱氧核糖核苷酸溶液(也可以是多种标记核苷酸)， 20mmol/L溶液各1μl。 以下操作要在同位素工作室中有防护措施的情况下进行操作
• 4、加入100μCi(10μl)标记的核苷酸溶液。注：应贮存在－20oC冰箱中，使用前在室 温下放置15～30分钟融化。要尽量减少冻融次数。
大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末 端标记法
T4DNA聚合酶标记法
2020年10月29日星期
23
四
大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末
端标记法：
标记反应步骤： (1)在反应管中依次加入下列试剂并混匀
DNA
1μg
10xKlenow片段缓冲液
2mmol/L3种dNTP(无dATP)
[α-32P]dATP
2020年10月29日星期
13
四
标记步骤
• 5、加入无菌蒸馏水，至终体积为46.5μl，混匀 • 6、加入0.5μl稀释的DNase I溶液，混匀 • 7、加入1μl(5U)DNA聚合酶I溶液，混匀 注：以上操作均在冰浴中进行 • 8、置14～16oC水浴中保温1～2小时 • 9、加入2μl 0.5mol/L EDTA终止反应 • 10、纯化标记的DNA探针
最新核酸分子杂交与应用
15.01.2021
28
15.01.2021
T4DNA聚合酶， 无dNTP 加入dNTP,其中一种为标记核苷酸
29
标记反应步骤：
端标记法：
标记反应步骤： (1)在反应管中依次加入下列试剂并混匀
DNA
1μg
10xKlenow片段缓冲液
2μl
2mmol/L3种dNTP(无dATP) 1μl
[α-32P]dATP
30μCi
加水至
25μl
10xKlenow片段缓冲液
2μl
0.5mol/L 0.1mmol/L 1mmol/L
Tris.Cl(pH7.2) DMTgTS(O二4硫苏糖醇)
15.01.2021
2
探针的标记
• 切口平移法 • 标记原理：是目前实验室是最常用的一种
脱氧核糖核酸探针标记法。利用大肠杆菌 DNA聚合酶1的多种酶促活性将标记的 dNTP掺入新合成DNA链中使探针被标记。
带缺口(nick)的线状、超螺旋及环状双链 DNA均可作为切口平移法的模板。
15.01.2021
500μg
牛血清白蛋白
15.01.2021
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大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末 端标记法：
(2)加入1单位Klenow聚合酶片段，室 温反应30min。 (3)加入12μl0.5mol/LEDTA以终止反 应。酚/氯仿抽提1次。 (4)Sephadex G－50柱层析或乙醇沉 淀法分离标记的DNA片段。
15.01.2021
13
标记步骤
• 5、加入无菌蒸馏水，至终体积为46.5μl， 混匀
• 6、加入0.5μl稀释的DNase I溶液，混匀 • 7、加入1μl(5U)DNA聚合酶I溶液，混匀
《核酸的分子杂交》PPT课件
亲缘关系； 2）用来揭示核酸片段中某一特定基因
的存在与否、拷贝数及表达丰度。
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Home 6
二、核酸探针的制备
探针（Probe): 一段带有检测标记的与目的基
因或目的DNA特异互补的已知核 苷酸序列。
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7
探针的制备方法
探针长度一般以50~300bp为宜。
制备方法：
1）利用DNA重组技术
凝胶 滤膜
转膜
吸附有DNA 片段的膜
杂交、显影
Southern 印精迹选杂课件交ppt的技术流程
21
（二）Northern印迹杂交
与Southern杂交类似。检测 目的RNA的存在与否及含量。
精选课件ppt
22
（三）Western印迹杂交
将待检测蛋白质（或酶）经 PAGE电泳并染色后，转移到滤膜 上固定，再用“抗体-抗原”免疫 反应或“DNA-protein”结合反应 鉴别滤膜上的蛋白质。
两者比较：后者不及前者敏感，但后者保 存时间较长，无同位素污染。
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12
一个理想的标记物：
1）标记前后探针的基本结构、化学性 质相同;
2）特异性强、本底低、重复性好； 3）操作简单、节时； 4）安全、无环境污染。
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13
2、探针的标记方法
（1）缺口平移法
（2）随机引物标记法
（3）末端标记法
DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等
精选课件ppt
2
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3
Content of Table
一、核酸分子杂交技术的原理 二、核酸探针的制备 三、核酸探针的标记 四、核酸分子杂交技术
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的存在与否、拷贝数及表达丰度。
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二、核酸探针的制备
探针（Probe): 一段带有检测标记的与目的基
因或目的DNA特异互补的已知核 苷酸序列。
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7
探针的制备方法
探针长度一般以50~300bp为宜。
制备方法：
1）利用DNA重组技术
凝胶 滤膜
转膜
吸附有DNA 片段的膜
杂交、显影
Southern 印精迹选杂课件交ppt的技术流程
21
（二）Northern印迹杂交
与Southern杂交类似。检测 目的RNA的存在与否及含量。
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22
（三）Western印迹杂交
将待检测蛋白质（或酶）经 PAGE电泳并染色后，转移到滤膜 上固定，再用“抗体-抗原”免疫 反应或“DNA-protein”结合反应 鉴别滤膜上的蛋白质。
两者比较：后者不及前者敏感，但后者保 存时间较长，无同位素污染。
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12
一个理想的标记物：
1）标记前后探针的基本结构、化学性 质相同;
2）特异性强、本底低、重复性好； 3）操作简单、节时； 4）安全、无环境污染。
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13
2、探针的标记方法
（1）缺口平移法
（2）随机引物标记法
（3）末端标记法
DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等
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3
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一、核酸分子杂交技术的原理 二、核酸探针的制备 三、核酸探针的标记 四、核酸分子杂交技术
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核酸杂交课件
利用Klenow DNA聚合酶标记3’-端DNA探针
2）T4噬菌体多核苷酸激酶标记法 （polynucleofide kinase，PNK)
T4噬菌体多核苷酸激酶标记法示意图
（4）聚合酶链反应（PCR）标记DNA探针 （5）同位素标记RNA探针
1）SP6 RNA聚合酶体系 2）成对启动子系列
RNA探针标记
检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的 DNA分子 检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的 RNA分子 检测固定在膜上，经裂解从细菌体释放 的DNA分子 检测固定在膜上的DNA或RNA分子
检测细胞或组织中的DNA或RNA分子
一、Southern印迹杂交
[原理]
Sourthern印迹杂交是分析DNA的一种方 法，从细胞或组织中提取高分子量的DNA，用 一种或多种限制性内切酶消化，通过琼脂糖凝 胶电泳按大小分离所得片段，从凝胶中按原来 位置和顺序吸印转移到固相支持膜（硝酸纤维 素膜或尼龙膜）上，然后再与同位素或非同位 素标记探针杂交，最后经放射自显影或显色反 应进行检测。
杂交过程中须注意的问题：
（1）探针的浓度 （2）探针的长度 ：50～100bp （3）杂交的温度和时间：Tm-25℃，3h
5.杂交后处理
洗涤的条件包括盐溶液的浓度、温度、 洗涤次数和时间，一般遵循的原则是盐溶液 浓度由高到低而温度由低到高。值得注意的 是在漂洗的过程中，切勿使切片干燥，否则 反而会增强背景染色。
2.增强组织的通透性和核酸探针的穿透性
组织细胞中的核酸都以核蛋白复合体 的形式存在于细胞浆或细胞核中，经过固 定过程后，胞浆或胞核内生物大分子交联 形成网络结构，影响探针的穿透和杂交体 的形成。因此需要使用去污剂和蛋白酶对 组织细胞蛋白进行水解以去除核酸表面蛋 白。
2）T4噬菌体多核苷酸激酶标记法 （polynucleofide kinase，PNK)
T4噬菌体多核苷酸激酶标记法示意图
（4）聚合酶链反应（PCR）标记DNA探针 （5）同位素标记RNA探针
1）SP6 RNA聚合酶体系 2）成对启动子系列
RNA探针标记
检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的 DNA分子 检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的 RNA分子 检测固定在膜上，经裂解从细菌体释放 的DNA分子 检测固定在膜上的DNA或RNA分子
检测细胞或组织中的DNA或RNA分子
一、Southern印迹杂交
[原理]
Sourthern印迹杂交是分析DNA的一种方 法，从细胞或组织中提取高分子量的DNA，用 一种或多种限制性内切酶消化，通过琼脂糖凝 胶电泳按大小分离所得片段，从凝胶中按原来 位置和顺序吸印转移到固相支持膜（硝酸纤维 素膜或尼龙膜）上，然后再与同位素或非同位 素标记探针杂交，最后经放射自显影或显色反 应进行检测。
杂交过程中须注意的问题：
（1）探针的浓度 （2）探针的长度 ：50～100bp （3）杂交的温度和时间：Tm-25℃，3h
5.杂交后处理
洗涤的条件包括盐溶液的浓度、温度、 洗涤次数和时间，一般遵循的原则是盐溶液 浓度由高到低而温度由低到高。值得注意的 是在漂洗的过程中，切勿使切片干燥，否则 反而会增强背景染色。
2.增强组织的通透性和核酸探针的穿透性
组织细胞中的核酸都以核蛋白复合体 的形式存在于细胞浆或细胞核中，经过固 定过程后，胞浆或胞核内生物大分子交联 形成网络结构，影响探针的穿透和杂交体 的形成。因此需要使用去污剂和蛋白酶对 组织细胞蛋白进行水解以去除核酸表面蛋 白。
《核酸分子杂交》课件
实验步骤
1
样品制备
获得需要研究的核酸样品并进行提取和
合成探针和标记物
2
纯化。
设计和合成与目标核酸互补的DNA或
RNA探针，并标记探针以便检测。
3
杂交反应
将待测核酸样品与探针和标记物进行杂
杂交产物的检测和分析
4
交反应，使它们结合形成杂交分子。
通过不同的检测方法对杂交产物进行分 析和表征，如凝胶电泳、放射性测量等。
核酸杂交的种类
DNA-DNA杂交
两段DNA互相结合形成双链 DNA。
RNA-DNA杂交
RNA和DNA互相结合形成 RNA-DNA杂交分子。
RNA-RNA杂交
两段RNA分子互相结合形成 双链RNA。
应用
检测病原微生物、基因 突变、肿瘤等
核酸分子杂交可用于诊断病 原微生物感染、检测基因突 变和肿瘤相关标记物。
《核酸分子杂交》PPT课 件
核酸分子杂交是指不同DNA或RNA进行结合形成杂交分子的过程。它在分析 核酸序列的同源性和差异性、检测特定序列的核酸以及研究DNA和RNA的结 构、功能和互动关系方面非常重要。
定义
核酸分子杂交是指来自不同DNA或RNA的单链或双链核酸互相结合形成杂交 分子的过程。
重要性
研究基因表达、基因调 控等
通过核酸分子杂交，我们可 以研究基因的表达模式和调 控机制。
设计新型药物和检测方 法
利用核酸分子杂交技术，可 以设计基于核酸的新型药物 和高灵DNA和RNA的结
性和差异性
核酸
构、功能和互动关系
核酸分子杂交可用于比较 DNA或RNA序列，帮助我 们了解核酸之间的相似性 和差异性。
通过配对互补的探针和标 记物，核酸分子杂交可用 于检测具有特定序列的核 酸分子。
《核酸分子杂交》课件
核酸分子杂交的历史背景
01
1952年，S.E.Luria和 M.Delbrück在研究噬菌体的变 异性时，首次提出了分子杂交 的概念。
02
1961年，R.W.Powell和 E.M.Maxam将分子杂交技术应 用于DNA的化学分析。
03
1973年，J.K.Hershey和 M.Chase用分子杂交技术成功 地检测到了噬菌体PSU-13的基 因组DNA。
利用纳米材料如金纳米颗粒、碳纳米 管等，可以实现核酸分子的高效富集 和信号放大，提高杂交信号的强度和 特异性。
在核酸分子杂交中，纳米技术可以用 于构建高灵敏度的传感器和检测器， 实现对基因组中特定序列的快速、准 确检测。
生物信息学在核酸分子杂交中的应用
生物信息学是利用计算机科学和统计学 的方法，对生物学数据进行分析和解读
洗脱
去除未结合的核酸分子，留下 与目标序列结合的核酸分子。
检测
对杂交产物进行检测，确定目 标序列的存在。
核酸分子杂交的原理
互补性
通过碱基互补配对原则，使单链核酸分子与目标 序列结合形成双链结构。
特异性
由于碱基互补配对原则，使得核酸分子杂交具有 高度的特异性。
温度依赖性
通过调节温度，可以控制核酸分子的变性和复性 ，从而控制杂交过程。
比较转录组
利用核酸分子杂交技术，可以对不同 条件下的转录组进行比较，揭示基因 表达的差异和变化规律。
基因突变检测
突变筛查
通过核酸分子杂交技术，可以对基因进行突变筛查，为遗传性疾病的诊断和治 疗提供依据。
突变定位
利用核酸分子杂交技术，可以快速、准确地定位突变位点，为突变机制和功能 研究提供帮助。
基因组测序与比较基因组学
核酸分子杂交技术PPT课件
（一）DNA变性 1、定义：某些理化因素导致两条DNA链间的
氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性
.
3
2、变性的方法： （1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸
分子链间的氢键完全断裂。 （2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核
酸分子链 间的氢键断裂。 （3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使
.
18
（二）待测DNA样品的电泳分离 1、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶 分离小片段用高浓度胶 2、凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子 DNA泳动慢,小分子DNA泳动快， 大小 相同的分子处于同一条带 3、分子量标准：经HindⅢ消化的λDNA，杂交 所用分子量标准可用核素标记
.
19
（三）凝胶中核酸的变性（碱变化） 凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的
（2）Cot½与反应体系中核酸复杂性成正比
（3）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对 杂交率取决于DNA的相对复杂性
.
15
6、非特异性杂交反应：
（1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针 的非特异性吸附
（2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分 子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts 溶液或脱脂奶粉
.
9
3、复性的速率方程（服从二级反应动力学）
dC dt =K2C2 将（1）积分
（1）
一半CC单o 链=D1N+1AK分2C子ot 复性时，（2）式中的（2）CCo 为21
1
1
2 = 1+K2Cot
Cot1/2=
1 K2
（3）
Cot1/2值越大，复性速度越慢
.
10
氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性
.
3
2、变性的方法： （1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸
分子链间的氢键完全断裂。 （2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核
酸分子链 间的氢键断裂。 （3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使
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（二）待测DNA样品的电泳分离 1、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶 分离小片段用高浓度胶 2、凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子 DNA泳动慢,小分子DNA泳动快， 大小 相同的分子处于同一条带 3、分子量标准：经HindⅢ消化的λDNA，杂交 所用分子量标准可用核素标记
.
19
（三）凝胶中核酸的变性（碱变化） 凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的
（2）Cot½与反应体系中核酸复杂性成正比
（3）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对 杂交率取决于DNA的相对复杂性
.
15
6、非特异性杂交反应：
（1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针 的非特异性吸附
（2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分 子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts 溶液或脱脂奶粉
.
9
3、复性的速率方程（服从二级反应动力学）
dC dt =K2C2 将（1）积分
（1）
一半CC单o 链=D1N+1AK分2C子ot 复性时，（2）式中的（2）CCo 为21
1
1
2 = 1+K2Cot
Cot1/2=
1 K2
（3）
Cot1/2值越大，复性速度越慢
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《核酸分子杂交》PPT课件
《核酸分子杂交》PPT课 件
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一、概念：
1、分子杂交〔hybridization) :有一定同源性的两条 核酸单链，在适宜的温度和离子浓度等条件下，通过碱 基互补退火形成稳定的双链分子的过程 。
3、转膜的方式：
将DNA从凝胶中转移到固体支持物上的方法主要有3种:
(1)毛细管转移。本方法由Southern创造，故又称为 Southern转移(或印迹)。毛细管转移方法的优点是简单, 不需要用其他仪器。缺点是转移时间较长,转移后杂交信 号较弱。
(2)电泳转移。将DNA变性后,可电泳转移至带电荷的尼 龙膜上。该法的优点是不需要脱嘌呤/水解作用，可直 接转移较大的DNA片段。缺点是转移中电流较大，温度 难以控制。通常只有当毛细管转移和真空转移无转移。有多种真空转移的商品化仪器,它们一般 是将硝酸纤维素膜或尼龙膜放在真空室上面的多孔屏上， 再将凝胶置于滤膜上，缓冲液从上面的一个贮液槽中流 下，洗脱出凝胶中的DNA,使其沉积在滤膜上。该法的优 点是快速，在30分钟内就能从正常厚度(4-5mm)和正常 琼脂糖浓度(<1%)的凝胶中定量地转移出来。转移后得 到的杂交信号比Southern转移强2-3倍。缺点是如不小 心，会使凝胶碎裂，并且在洗膜不严格时，其背景比毛 细转移要高。
2、固体支持物的种类：
带正电荷的尼龙膜、硝酸纤维膜、PVDF膜
尼龙膜是较理想的核酸固相支持物，有多种类型； 硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格 最廉价；PVDF膜介于二者之间。
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一、概念：
1、分子杂交〔hybridization) :有一定同源性的两条 核酸单链，在适宜的温度和离子浓度等条件下，通过碱 基互补退火形成稳定的双链分子的过程 。
3、转膜的方式：
将DNA从凝胶中转移到固体支持物上的方法主要有3种:
(1)毛细管转移。本方法由Southern创造，故又称为 Southern转移(或印迹)。毛细管转移方法的优点是简单, 不需要用其他仪器。缺点是转移时间较长,转移后杂交信 号较弱。
(2)电泳转移。将DNA变性后,可电泳转移至带电荷的尼 龙膜上。该法的优点是不需要脱嘌呤/水解作用，可直 接转移较大的DNA片段。缺点是转移中电流较大，温度 难以控制。通常只有当毛细管转移和真空转移无转移。有多种真空转移的商品化仪器,它们一般 是将硝酸纤维素膜或尼龙膜放在真空室上面的多孔屏上， 再将凝胶置于滤膜上，缓冲液从上面的一个贮液槽中流 下，洗脱出凝胶中的DNA,使其沉积在滤膜上。该法的优 点是快速，在30分钟内就能从正常厚度(4-5mm)和正常 琼脂糖浓度(<1%)的凝胶中定量地转移出来。转移后得 到的杂交信号比Southern转移强2-3倍。缺点是如不小 心，会使凝胶碎裂，并且在洗膜不严格时，其背景比毛 细转移要高。
2、固体支持物的种类：
带正电荷的尼龙膜、硝酸纤维膜、PVDF膜
尼龙膜是较理想的核酸固相支持物，有多种类型； 硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格 最廉价；PVDF膜介于二者之间。
《核酸分子杂交技术》课件
核酸分子杂交原理
互补配对
核酸分子通过互补配对原理相 结合，碱基之间形成稳定的氢 键。
熔解
通过改变温度，使两条核酸分 子解开，断裂氢键，分离出单 链。
探针结合
利用互补配对原理，核酸探针 与目标核酸结合，形成稳定的 双链结构。
核酸探针的制备
1
设计探针序列
根据目标核酸序列设计探针，考虑碱基
合成探针
2
互补性和特异性。
《核酸分子杂交技术》 PPT课件
核酸分子杂交技术是一种重要的实验技术，能够研究DNA和RNA的结构、功 能以及相互作用。让我们一起探索这门神奇的科学吧！
什么是核酸分子杂交技术
1 定义
核酸分子杂交技术是指通过核酸探针与目标 核酸的互补碱基配对作用实现的一种检测、 分离和研究方法。
2 原理
该技术利用核酸分子的碱基互补性特点，使 探针与目标核酸发生相互结合，从而实现目 标分子的检测和定位。
利用合成技术合成目标序列的核酸探针。
3
标记探针
通过化学反应或酶标记等方法，将探针 标记上荧光剂或放射性示踪剂。
应用领域
遗传研究
核酸分子杂交技术在遗传研究中 起到了至关重要的作用，帮助人 们了解遗传信息的传递和变异。
医学诊断
通过核酸分子杂交技术，可以检 测病原体和基因突变，用于疾病 的早期诊断和治疗。
法医分析
核酸分子杂交技术用于法医学领 域的DNA鉴定和犯罪现场的分析， 提供了重要的法律证据。
核酸分子杂交技术的优势
1 高度特异性
通过合理设计探针序列， 核酸分子杂交技术能够高 度特异地检测目标核酸。
2 灵敏度高
核酸分子杂交技的特点。
3 广泛应用
核酸分子杂交技术在基础 研究、生物医学、农业科 技等领域均有广泛应用。
第一节 核酸分子杂交-PPT
第二十章常用分子生物学技术的原理及应用The Principle and Application of Common Used Techniquesin Molecular Biology掌握：1.分子杂交技术的概念及基本原理2.Southern、Northern、Western印迹法的适用范围。
3.聚合酶链式反应的概念及基本原理4.了解基本概念学习要求学习要求第二十章 常用分子生物学技术第一节 核酸分子杂交第二节 聚合酶链反应第三节 基因文库第四节 生物芯片技术第五节 生物大分子相互作用研究技术核酸的分子杂交：碱基序列互补的单链核酸，根据碱基互补原则，借助氢键相连而形成双链杂交分子的过程。
以DNA的变性和复性为理论基础复性RNA DNA•将探针与固定在NC膜上的DNA或RNA进行结合反应，探针的序列如与NC膜上的核酸序列相互补，就可结合到膜上的相应区带，经放射自显影或其他检测手段就可判断膜上是否有同源的核酸分子存在。
•硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称NC 膜)探针(probe)的概念用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列的已知被标记的DNA片段或RNA片段探针的种类o寡核苷酸探针o基因组DNA探针o cDNA探针o RNA探针•常用探针标记方法：1.放射性核素标记(放射自显影）2.生物素标记（酶联反应-显色）3.地高辛标记（酶联反应-显色）4.分子信标（荧光）第一节 分子杂交技术 – 应用1.Southern印迹杂交法：检测特异DNA片段2.Nouthern印迹杂交法：检测特异的RNA片段3.Western印迹杂交法：检测蛋白质（一）Southern blottingl1975年，英国Edwen Southern创建l检测DNA杂交方法，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。
l原始文献出处：Southern EM. Detection ofspecific sequences among DNA fragmentsseparated by gel electrophoresis. J Mol Biol，1975, 98(3):503-517.（一）Southern blotting10×SSC转移缓冲液Whatman 滤纸凝胶Whatman 滤纸纸巾玻璃板重物支持物500g与探针同源杂交的基因组DNA DNA 酶切片段内切酶NC 膜或尼龙膜Southern转膜---如何转膜？•常用方法：毛细管虹吸印迹法电转印法真空转移法电转印法Southert blotting用途•1、酶切图谱分析•2、特定基因定性和定量•3、基因突变分析•4、限制性片段长度多态性的分析（二）RNA 印迹技术(Northern blotting)相同点：Alwine JC , et al . Method for detection of specific RNA s in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes.Proc Natl Acad Sci USA, 1977, 74(12):5350-5354原始文献出处名称相对于Southern blotting•转移的是RNA •转移前无需酶切•转移效率较高•变性方法不同点原理均为毛细作用。
核酸分子杂交技术核酸分子杂交的基本原理PPT课件
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（4）杂交 • 杂交液体积小：10~20μl • cDNA和RNA探针杂交温度约为50℃ • 杂交时间:DNA探针杂交为2~4h.RNA探针杂交过夜 • 杂交前一般将组织切片置95 ℃ 5~15分钟使DNA变 性 • 冲洗温度一般 不超过50 ℃
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（5）杂交结果检测 • 所用探针为核素标记,放射自显影检测 • 所用探针为非核素标记,比色或化学发光检测
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2、杂交过程： （1）组织或细胞的固定
理想固定液应具备： • 保持组织细胞的形态 • 对核酸无抽提，修饰与降解作用 • 不改变核酸在组织细胞内的定位 • 不阻碍核酸与探针的杂交过程 • 对杂交信号无遮蔽作用 • 理化性质稳定
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（2）组织细胞杂交前的预处理 • 去垢剂（如Triton x-100和SDS）和蛋白酶
K去除核酸表面的蛋白质 • 组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体 • 控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻
片上脱落
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（3）探针的选择与标记 • 以获得最好杂交效果为依据选择探针 • 探针的长度一般为50~300bp ,有时达1.5kb • 放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定 检测结果分辨率高，但信号检测时间长 • 非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易 于观察
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四、探针的纯化
1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可 去除dNTP和蛋白质
2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将 大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷 酸（<80bp)等物质分离，常用凝胶基质是 Sephadex G-50
3、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相 同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此 法则是利用离心的方式来纯化探针
（4）杂交 • 杂交液体积小：10~20μl • cDNA和RNA探针杂交温度约为50℃ • 杂交时间:DNA探针杂交为2~4h.RNA探针杂交过夜 • 杂交前一般将组织切片置95 ℃ 5~15分钟使DNA变 性 • 冲洗温度一般 不超过50 ℃
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（5）杂交结果检测 • 所用探针为核素标记,放射自显影检测 • 所用探针为非核素标记,比色或化学发光检测
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2、杂交过程： （1）组织或细胞的固定
理想固定液应具备： • 保持组织细胞的形态 • 对核酸无抽提，修饰与降解作用 • 不改变核酸在组织细胞内的定位 • 不阻碍核酸与探针的杂交过程 • 对杂交信号无遮蔽作用 • 理化性质稳定
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（2）组织细胞杂交前的预处理 • 去垢剂（如Triton x-100和SDS）和蛋白酶
K去除核酸表面的蛋白质 • 组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体 • 控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻
片上脱落
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（3）探针的选择与标记 • 以获得最好杂交效果为依据选择探针 • 探针的长度一般为50~300bp ,有时达1.5kb • 放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定 检测结果分辨率高，但信号检测时间长 • 非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易 于观察
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四、探针的纯化
1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可 去除dNTP和蛋白质
2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将 大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷 酸（<80bp)等物质分离，常用凝胶基质是 Sephadex G-50
3、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相 同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此 法则是利用离心的方式来纯化探针
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10x切口平移缓冲液
0.5mol/L
Tris.Cl(pH7.2)
0.1mol/L 1mmol/L
MgSO4 二硫苏糖醇(DTT)
500μg/ml
牛血清白蛋白
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标记步骤
• 3、加入除标记核苷酸外的其他三种脱氧核 糖核苷酸溶液(也可以是多种标记核苷酸)， 20mmol/L溶液各1μl。
核酸分子杂交与应用优秀课件
16.11.2020
1
核酸分子杂交：来源相同或不同的 DNA甚至DNA与RNA分子变性后，在 合适的条件下通过碱基互补形成双链 杂交体的过程称核酸分子杂交 (molecular hybridization)。核酸分子 杂交技术是目前生物化学和分子生物 学研究中应用最广泛的技术之一，也 是临床分子检验的重要技术。
以下操作要在同位素工作室中有防护措施 的情况下进行操作
• 4、加入100μCi(10μl)标记的核苷酸溶液。 注：应贮存在－20oC冰箱中，使用前在室 温下放置15～30分钟融化。要尽量减少冻 融次数。
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13
标记步骤
• 5、加入无菌蒸馏水，至终体积为46.5μl， 混匀
• 6、加入0.5μl稀释的DNase I溶液，混匀 • 7、加入1μl(5U)DNA聚合酶I溶液，混匀
• 2、标记活性高，只需25ng样品DNA，可在 3小时内使40％～60％以上甚至90％的标记 dNTP掺入到探针DNA链上
• 3、操作方便
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3’末端标记 末端标记属于部分标记。特点是可得 到全长DNA片段，但标记活性不高。 3’末端标记法包括限制酶切和聚合酶 合成两个过程，3’标记有两种方式：
的寡聚核苷酸片段的混合物，可以与任何 核酸序列杂交，起到聚合酶促反应的引物 作用。将待标记的探针模板与随机引16
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标记步骤
• 1、冰浴中，在一微量离心管内顺序加入下 列溶液，并混匀
20mmol/L
DTT
1μl
5mmol/L dATP、dGTP、dTTP 1μl
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3
核酸探针的标记 探针(probe)是指用放射性核素或其 它标记物标记的核酸片段。
放射性标记
标
记
生物素标记
物 非放射性标记 地高辛标记
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荧光素标记 4
探针的种类
• DNA探针：双链或单链DNA探针是最常用 的核酸探针。长度在几百碱基对以上。 DNA探针又分为：
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6
探针的种类
• RNA探针：可以是标记分离的RNA，也可 以是重组质粒在RNA聚合酶作用下的转录 产物。其优点是：
• RNA探针为单链，复杂性低，与靶序列杂 交反应效率极高
• 因不存在重复序列，因此特异性高
• 本底低
• 缺点：
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7
探针的种类
• 寡核苷酸(oligo)探针：由17～50mer组成的 短探针。
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19
标记步骤
• 4、取10μl终止缓冲液，置－20oC保存备用
终止缓冲液
50mmol/L Tris.Cl(pH7.5)
50mmol/L NaCl
5mmol/L EDTA
0.5%
SDS
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20
随机引物标记法特点
• 1、除能进行双链DNA标记外，也可用于单 链DNA或RNA探针的标记。当用RNA为模 板是，操作方法同上，但必须采用反转录 酶。
大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末 端标记法
T4DNA聚合酶标记法
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大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末
端标记法：
标记反应步骤： (1)在反应管中依次加入下列试剂并混匀
DNA
1μg
10xKlenow片段缓冲液
2μl
2mmol/L3种dNTP(无dATP) 1μl
注：以上操作均在冰浴中进行 • 8、置14～16oC水浴中保温1～2小时 • 9、加入2μl 0.5mol/L EDTA终止反应 • 10、纯化标记的DNA探针
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单 链
D N A 探 针 的 标 记
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探针的标记
• 随机引物法 • 标记原理：随机引物是含有各种可能排列
[α-32P]dATP
30μCi
加水至
25μl
10xKlenow片段缓冲液
2μl
0.5mol/L 0.1mmol/L 1mmol/L
Tris.Cl(pH7.2) DMTgTS(O二4硫苏糖醇)
带缺口(nick)的线状、超螺旋及环状双链 DNA均可作为切口平移法的模板。
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DNase I DNA Pol I,α-32P-dNTP
10
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标记步骤
• 1、取1μgDNA溶于少量无菌蒸馏水中
• 2、加入μl10x切口平移缓冲液，混匀
• 优点：
• 可根据需要人工合成相应的序列；
• 因片段短，只有一个核苷酸突变，其Tm值 也有明显变化，特别适用于点突变的检测
• 杂交速度快特异性强
• 缺点：所带标记物少灵敏度低；片段短杂 交体不稳定
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探针的标记
• 切口平移法 • 标记原理：是目前实验室是最常用的一种
脱氧核糖核酸探针标记法。利用大肠杆菌 DNA聚合酶1的多种酶促活性将标记的 dNTP掺入新合成DNA链中使探针被标记。
10x随机引物缓冲液
1μl
标记dCTP
3μl
水
1μl
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18
标记步骤
• 2、取200ng双链DNA溶于1μl蒸馏水中，在 蜡膜上与1μl随机引物充分混匀，吸入一毛 细玻璃管中，用火封严两端。置沸水浴中 30分钟并迅速置冰水浴中1分钟。将DNA转 入上述离心管中
• 3、加入1μl(5U)DNA聚合酶Klenow片段， 混匀并离心，室温反应3小时以上
• 基因组DNA探针：有细菌、病毒、原虫、 真菌、动物和人类细胞DNA探针，多为某 一基因的全部或部分序列，或某一非编码 序列。
• cDNA探针：以mRNA为模板经过逆转录酶 催化产生的互补于mRNA的DNA链。
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5
探针的种类
• DNA探针优点： • 1、一般克隆在质粒载体中，可以无限繁殖； • 2、DNA探针不易降解 • 3、DNA的标记方法比较成熟。