一株漆酶产生菌的筛选与发酵条件研究

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漆酶高产菌株的筛选实验方案

漆酶简介漆酶是一种含铜的多酚氧化酶(Laccase, P-diphenol oxidase, EC.1.10.3.2)，广泛分布于高等动植物、昆虫、真菌分泌物和少量细菌中，其中最主要的是担子菌亚门的白腐真菌。

漆酶为含铜的糖蛋白，约由500 个氨基酸组成，多为单一多肽，个别为四聚体。

糖配基占整个分子的10%～45%，糖组成包括氨基己糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖和阿拉伯糖等。

由于分子中糖基的差异，漆酶的分子量随来源不同会有很大差异，甚至来源相同的漆酶分子量也会不同。

通过对漆酶蛋白质晶体结构的研究发现,漆酶具有3个铜离子结合位点,共结合4个铜离子,且这4个铜离子处于漆酶的活性部位,在催化氧化反应中起决定作用，如果除去铜离子,漆酶将失去催化作用。

漆酶具有较强的氧化还原能力，能催化多酚、多氨基苯等物质的氧化，使分子氧直接还原成水，将酚类和芳胺类化合物还原成醌类物质，没有副产物的生成。

由于漆酶具有特殊的催化性能和广泛的作用底物，使得漆酶具有广泛的应用价值。

漆酶应用主要集中在制浆造纸，特别是纸浆的生物漂白，环境保护，木质纤维素降解等方面。

造纸工业方面，由于漆酶能高效的降解木质素及与木质素具有相似结构的物质，避免造纸工序中所使用的化学物质影响环境。

环境保护方面，漆酶能有效的除去工业废水、化学农药当中的毒物酚、芳胺、单宁和酚醛化合物，生物消除有毒化合物，使得漆酶在废水处理等环保事业有广阔的前景。

分光光度法测定漆酶活力最常用的底物是2,2’-连氮一双(3-乙基苯并唆毗咯琳-6-磺酸)(ABTS)。

实验一高产漆酶菌株酶活测定1 主要试剂的配制（1） 0.2 mmol/L pH 4.5柠檬酸－柠檬酸钠缓冲溶液A 液：0.2 mmol/L 柠檬酸溶液：称取柠檬酸21.014 g ，加入蒸馏水溶解定容至500mL 。

B 液：0.2 mmol/L 柠檬酸钠溶液：称取柠檬酸钠29.412 g ，加入蒸馏水溶解定容至500mL 。

一株产漆酶真菌的筛选、鉴定及发酵研究

组织的土壤．
（２）培养基．ＰＤＡ培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖２Ｏ，土豆（浸出汁）２００，琼脂粉１５，ｐＨ值自然．筛选培养基：ＰＤＡ培养基添加愈创木酚（Ｏ．０４）及卡那霉素（５０ｍｇ／Ｌ）．种子培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖２Ｏ，蛋白胨５，酵母
粉３，ｐＨ值自然．基本发酵产酶培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖２０，酒石酸铵８，ＫＨＰＯ２，ＭｇＳＯ・７ＨＯ０．６，
ＣａＣＩ２・２Ｈ２Ｏ０．８，ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ０．２５，Ｔｗｅｅｎ８００．２５，ｐＨ６．０．
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２ＯＯ．６，ＣａＣｌｚ・２Ｈ２ＯＯ．８，Ｃｕ。Ｏ．２５（１ｍＭ），ｐＨ５．５－６．５，其漆酶最高酶活水平为５７１．３２Ｕ／Ｌ．
关键词：漆酶；棘孢木霉；分子鉴定；发酵优化文献标识码：Ａ中圈分类号：Ｑ９３ — ３３１
所有已研究的木腐真菌中均有发现，同时也存在于部分植物、细菌和昆虫之中［．随着漆酶的发现和深入研究，在某些小分子化合物作为介体存在的条件下，漆酶还能够氧化非酚型木质素结构．漆酶对木质素以及与木质紊结构相似的许多环境污染物的降解作用越来越受到人们的重视［２］．在纸浆去木质化、有机染料脱色［、纺织污水处理［引、生物传感器［、食品饮料行业、有机合成］、药物合成ｍ］、医疗诊断和作为

一株产漆酶菌株的筛选鉴定和发酵条件的研究

显的诱导作用，５／３～ｍｇＬ的Ｔｅｎ８ｗｅ．０可以明显提高ＷＳ．产酶水平。１２的
关键词：色木霉；绿愈创木酚；态学特征；形酶活力
中图分类号：９５Ｑ３文献标识码：Ａ文章编号：０８— ６２２０）３— ００— ４１０９３（０８００４０
刘敏，张明
２０３）３０６（安徽农业大学生命科学学院，合肥
摘
要：以愈创木酚为底物，采用平板筛选法筛选得到一株产漆酶菌株ＷＳ．，态学特性表明该茵属于绿色木１２形
霉。对产酶条件的初步研究结果表明，ＩＷＳ一２菌株的产酶高峰期出现在接种培养后的第４。与蔗糖、糖、乳糖ｄ乳半和可溶性淀粉相比，以葡萄糖为碳源时，发酵上清液的漆酶活力明显要高，大值达２０／。以Ｎ１最３ＵＬＨＣ为氮源，最有利于ＷＳ－１２漆酶的产生，酶活力最高可达到２４／。００ｍｎｌＬ的愈创木酚和ＡＴ漆３ＵＬ，１ｒ／ｏＢＳ对ＷＳ－Ｉ２产漆酶有明
明，－ｉ：ｈｎｍｎ＠ａａ．ｄ．ｎＥｍａｚａｇｉｇｈｕｅｕｃ。ｌ
基金项目：安徽省高校 “ 十五” 优秀人才计划（教秘人１０４— ０）【２０１０
收稿日期：０７一４—２２０ｏ８
化变色圈的菌落进行分离纯化。将分离菌株分别接种
到筛选平板上和ＰＡ平板上，８Ｃ恒温培养，出筛Ｄ２￣选选平板上出现明显氧化变色圈的菌株，通过ＰＡ平并Ｄ

产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究

产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究
产漆酶细菌是一类具有重要应用价值的菌种，能够分解淀粉类和纤维素类物质，具有广泛的应用前景。

本研究旨在通过筛选和鉴定，找到高效产漆酶的细菌菌株，并研究其固体发酵条件。

我们从土壤和水样品中收集多个潜在的产漆酶细菌菌株。

这些菌株被分离、纯化并保存以备后续的实验使用。

然后，我们使用碘碟法进行最初的筛选，通过菌株在含有淀粉或纤维素的培养基上形成明显溶解区来判断其分解能力。

筛选出的阳性菌株被进一步培养、扩增和鉴定。

鉴定的流程主要包括形态学观察、生化试验和分子生物学鉴定。

形态学观察包括菌落形态、细胞形态、孢子形态等。

生化试验主要包括氧化酶试验、淀粉分解酶试验、纤维素分解酶试验等。

分子生物学鉴定则主要通过16S rRNA序列分析来确定菌株的分类地位。

通过以上的筛选和鉴定过程，我们最终确定了一株高效产漆酶的细菌菌株。

接下来，我们进行了固体发酵条件的研究。

我们对产漆酶细菌的最适发酵基质进行了选择和优化。

我们评价了不同基质如淀粉、纤维素、豆饼等对产漆酶产量的影响，并通过响应曲面法确定了最佳基质比例。

然后，我们研究了发酵温度、pH值、初始菌液浓度、培养基添加剂等参数对产漆酶产量的影响，并进行了优化。

我们对优化后的固体发酵条件进行了验证和比较。

通过对产漆酶产量、酶活力和底物降解效率的测试，我们确定了最佳的固体发酵条件。

漆酶高产菌株的筛选及产酶条件研究

第28卷第3期河南工业大学学报(自然科学版)Vol .28,No .32007年6月Journal of Henan University of Technol ogy (Natural Science Editi on )Jun .2007收稿日期:2007-01-15作者简介:董学卫(1982-),男,山东济宁人,硕士在读,从事酶工程学研究.3通讯作者文章编号:1673-2383(2007)03-0052-05漆酶高产菌株的筛选及产酶条件研究董学卫,朱启忠3,吕新萍,徐国英,于　涛,王方忠(山东大学威海分校海洋学院,山东威海264209)摘要:从威海玛伽山上采集的9株夏季常见大型真菌中筛选出产漆酶能力最强的菌株白毒鹅膏菌.研究了碳源、氮源、各种理化因素等培养条件对漆酶分泌的影响.结果表明:麸皮作碳源、酵母膏作氮源有利于漆酶的分泌,pH 在5.0～5.4的范围内对漆酶的分泌影响不大,培养温度、接种量、通气量对漆酶的分泌有较大影响,正交试验表明:麸皮20g/L,酵母膏5g/L,在250mL 的容量瓶中,装液量为50mL,温度25℃时,白毒鹅膏菌第8d 达产酶高峰,在以邻联甲苯胺作为底物时,峰值酶活为365U /mL.关键词:漆酶;筛选;白毒鹅膏菌;培养条件中图分类号:Q935 文献标识码:A0　前言漆酶是一种多铜酶,属于蓝色氧化酶家族.它能催化多种芳香族化合物特别是酚类的氧化,伴随着分子氧还原为水[1].现在已经在植物、真菌、昆虫和细菌中发现了漆酶.漆酶是一种能用于不同工业反应如生物燃料细胞[2]、生物传感器[3]、降解异型生物质包括纸浆漂白[4]、反应中的酶标标签[5]、生物修复功能[6]、绿色有机物质的合成[7]、甚至包括有真菌和细菌产生的漆酶的设计[8]等,具有十分吸引人的应用前景.研究热点包括产漆酶菌株的筛选和对新的漆酶的研究、酶的结构研究[9]、蛋白内电子转移和氧还原为水的机制[10]、漆酶的电化学性质[11]等等.许多真菌产漆酶的最佳优化条件已被确定[12].真菌漆酶的增产决定于生产基质和生长条件.由不同培养基产生的漆酶在他们的诱导过程、漆酶形式的数量、相对分子质量、最适pH 值、对甲氧基酚酸的特异性上都有不同[13].真菌漆酶的诱导非常重要,因为它们的代谢活性和生长对环境条件依赖非常强.诱导剂二甲代苯胺[14]、阿魏酸[15]、藜芦醇[16]、对Tra metesversicoLor 具有诱导作用的焦　酸[17]和对Tra metes tr ogii [18]、T .versicoLor [12]具有诱导作用的铜,它们皆能增加漆酶的生产.我们对玛珈山的夏季常见大型真菌进行了漆酶活力的初步测定,筛选到一株非白腐菌漆酶高产菌株———白毒鹅膏菌(Amanita verna ),并对其产生漆酶的条件进行了初步研究,这对漆酶的高产具有重要的理论价值和指导意义.1　材料和方法1.1　材料与仪器菌种:白毒鹅膏菌(Amanita verna ),由威海市玛珈山上采集、分离、纯化而得.试剂:邻联甲苯胺(上海化学试剂总厂分析纯);其他化学试剂均为分析纯或化学纯.仪器:722E 型可见分光光度计(上海第三分析仪器厂).1.2　培养基和培养方法1.2.1　综合马铃薯固体培养基马铃薯200g/L,葡萄糖20g/L,K H 2P043g/L ,MgS O 41.5g/L ,V B10.01g/L ,琼脂20g/L .1.2.2　液体培养基1.2.1中的固体培养基去掉琼脂,加入0.5%的酵母膏.1.2.3　培养方法第3期董学卫等:漆酶高产菌株的筛选及产酶条件研究53　250mL三角瓶中装液体培养基50mL,接入6～7日龄平板菌种3片(10mm),130r/m in、27℃下恒温振荡培养.1.2.4　粗酶液制备在培养的第5d和第8d各取样1次.4000r/m in离心15m in,上清液即为粗酶液,冰箱保存备用.1.3　酶活测定[19]0.1mol/L、pH4.6的醋酸缓冲液3.5mL,加入3.36mmo1/L的邻联甲苯胺0.5mL,再加入适当稀释的粗酶液0.5mL,25℃保温5m in,722E型紫外可见分光光度计测595nm处光密度(OD值),酶活力以样品与底物反应5m in后光密度的改变值表示,以每m in光密度增加0.01为一个酶活力单位(U/mL).2　结果与讨论2.1　漆酶高产菌株筛选液体发酵实验结果可见表1,在相同条件下,漆酶活力在不同菌株间有较大差异,其中白毒鹅膏菌(Amanita verna)所产漆酶的活力最高,云芝(Corci L us versicoLor)次之,其余菌株较低,由于白毒鹅膏菌有很高的漆酶分泌能力,故将其作为进一步研究的试验菌.表1　不同真菌液体发酵漆酶活性比较菌种名称漆酶活力/(U・mL-1) 5d8d大绿菇RussuLa virescens5465大红菇Russua La rubra3445云芝Corci L us versicoLor154193白毒鹅膏菌Amanita verna196242树舌灵芝Ganoder m appLanatum8997硬柄小皮伞Marasds m ius oreades1620待定13455待定23865待定321382.2　碳、氮源对漆酶分泌的影响2.2.1　C源对漆酶分泌的影响在液体培养基中分别用待测C源(麦芽浸膏、麸皮、棉籽壳、麻栎叶、C MCNa、麦草粉、淀粉、麦芽糖)代替葡萄糖,培养8d后测定漆酶活性(表2),由表2可见,就白毒鹅膏菌而言以麸皮为C源有利于漆酶的分泌,但不利于菌丝有效生长,这可能是麸皮中也含有较多淀粉类物质的缘故.淀粉产酶高峰来临较早,酶量下降也快.表2　不同碳源对菌丝体生长及漆酶分泌的影响碳素菌丝球湿重/g漆酶活力/(U・mL-1)葡萄糖0.8940.010麦芽浸膏 3.3270.471C MCNa 5.2310.086麸皮11.559 1.208麦草粉7.8980.628淀粉 3.3470.368麦芽糖0.8640.020棉籽壳 2.1340.0034麻栎叶 3.9770.677木糖 1.0130.167蔗糖 2.3130.1652.2.2　N源对漆酶分泌的影响因白毒鹅膏菌以麸皮为C源时有利于漆酶的分泌,所以N源实验时以麸皮作固定C源;在液体培养基中以麸皮代替葡萄糖,待测氮源(大豆粉、酪蛋白胨、尿素、干酪素、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钠、玉米面、大米渣)代替酵母膏.培养8d后测定酶活(表3).由表3可见:酵母膏为N源有利于白毒鹅膏菌漆酶的分泌.蛋白胨作为N源也较好.综合上述白毒鹅膏菌的最佳产酶培养基配方:马铃薯200g/L、麸皮20g/L、KH2P O43g/L、MgS041.5g/L、VB10.01g/L、(NH4)2S O45g/L.表3　不同氮源对菌丝体生长及漆酶分泌的影响氮素菌丝球湿重/g漆酶活力/(U・mL-1)酵母膏 3.9890.578大豆粉9.6220.264酪蛋白胨 4.3740.324尿素 1.2800.037干酪素 5.8330.121(NH4)2S O4 2.9220.094NH4NO4 1.5750.074NaNO3 2.5220.449玉米面 5.1740.266大米渣13.9400.187由表3可见,菌丝体的生长量与酶类的分泌不成正相关.白毒鹅膏菌在以大米渣和大豆粉为N源时,能促进菌丝体生长但不能促进酶类的分泌;酵母膏、酪蛋白胨和Na NO3对菌丝的生长量促进不大,但有利于酶的分泌.一般而言,无机N 源的菌丝生长量较小,有机N源的菌丝生长量较大.综合产酶高峰与高浓度酶量的持续时间,确定酵母膏为最佳N源.2.3　环境条件对漆酶分泌的影响2.3.1　培养基初始pH值对漆酶分泌的影响由表4可知,培养基pH值在4.8～5.6之间时菌株有漆酶的分泌.进一步研究发现,当pH值54　河南工业大学学报(自然科学版)第28卷在5.0～5.4时漆酶活力变化大;且在pH 值为5.2时酶活性最高.但pH <4.8或pH >5.6时,则会抑制漆酶的分泌,说明在该实验条件下,pH 值对产酶有较大的影响.2.3.2　接种量对漆酶分泌的影响培养液中分别接种直径10mm 菌片1、2、3、4、5、6、7片,其酶活如图2所示.可见接种量对漆酶分泌的影响较大,一般接种量越大漆酶分泌也就越多,产酶高峰到来越早.白毒鹅膏菌生长较慢,相同培养时间下的生物量较小,故50mL 培养液接种5片菌片为宜.图1　pH 值对漆酶分泌的影响图2　接种量对漆酶分泌的影响2.3.3　装液量对漆酶分泌的影响分别在250mL 三角瓶中加入液体培养基,调整装液量为36mL,42mL,50mL,63mL,83mL.在130r/m in 、28℃下培养5d,检测酶活.结果见图3.图3　装液量对漆酶分泌的影响由图3可知:最佳装液量为50mL 液体培养基.2.3.4　转速对漆酶分泌的影响分别在250mL 三角瓶中加液体培养基,装液量为50mL,培养温度为28℃,分别在140r/m in 、130r/m in 、120r/m in 、110r/m in 、100r/m in 下震荡培养.5d 后检测酶活,结果见图4.图4　转速对漆酶分泌的影响实验表明,液体浅层静止培养,酶活较低;以250mL 三角瓶中装50mL 液体培养基,120r/m in深层摇床培养活力较高.2.5液体培养温度对漆酶分泌的影响mL 三角瓶中加入液体培养基,装液量转速为130r/m in,分别在20℃、25℃、28℃、32℃、35℃下培养.5d 后检测酶活,结果见图5.图5　培养温度对漆酶分泌的影响由图5可见:温度在25～28℃时酶活较高,过高或过低的温度会影响漆酶的分泌,特别是高温严重影响漆酶的分泌,35℃时的酶活只及28℃酶活的4%,稍低的温度对漆酶分泌影响相对较小,20℃的酶活为28℃时的13%.2.3.6　碳源、氮源、装液量、温度的正交试验上述结果表明碳源、氮源、装液量和温度对白毒鹅膏菌漆酶的生成具有很大影响.将4种因素结合进行正交试验和极差分析,结果表明(表4):碳源、氮源和装液量对处理组合的酶活力影响较大,并以碳源影响最大,装液量的影响较小.优化组合为A 3B 3C 2D 1,即麸皮20g/L,酵母膏5g/L,装液量50mL,温度25℃,这与单一因子试验的结果较为一致.F 检验碳源、氮源、装液量和温度的影响都达到极显著水平.2.4　最佳产酶条件下白毒鹅膏菌的产酶曲线我们筛选出白毒鹅膏菌的最适培养基为:马第3期董学卫等:漆酶高产菌株的筛选及产酶条件研究55　铃薯200g/L 、麸皮20g/L 、KH 2P O 43g/L 、MgS041.5g /L 、V B10.01g/L 、酵母膏5g/L.其pH 值范围为5.0～5.4,转速为120r/m in,温度为25℃,装液量为50mL.按此条件进行培养,漆酶从第5d 酶活迅速提升,第8d 达产酶高峰,随后产酶能力下降(图6).表4　培养基碳源、氮源、装液量和温度正交试验的结果NoA /(g ・L -1)B /(g ・L -1)C /mLD /℃酶活力/OD11(5)1(1.25)1(42)1(25)33.6528.1629.8121(5)2(2.5)2(50)2(28)41.9063.1961.1331(5)3(5)3(63)3(32)70.0569.0273.4942(10)1(1.25)2(50)3(32)72.1254.9567.3152(10)2(2.5)3(63)1(25)44.9961.8150.8262(10)3(5)1(42)2(28)70.4056.3269.3773(20)1(1.25)3(63)2(28)56.3270.7568.6883(20)2(2.5)1(42)3(32)72.1270.7471.7793(20)3(5)2(50)1(25)104.74237.99140.11X 152.5453.5755.9881.39X 260.7859.7593.7562.16X 399.2498.9062.8469.04SS 11183.8810877.177287.181708.95M S 5591.945438.593643.59854.47R 46.7045.3337.7719.23F88.6978.4852.5812.33　注:A 麸皮浓度;B 酵母膏浓度;C 装液量;D 温度.图6　白毒鹅膏菌产酶曲线3　结论从分离培养成功的9种大型真菌子实体中提取漆酶,白毒鹅膏菌漆酶的酶活最高,是目前发现的稀有非白腐真菌漆酶高产菌株.麸皮作碳源、酵母膏作氮源有利于白毒鹅膏菌漆酶的分泌,pH 5.0～5.4的范围内对漆酶的分泌影响差别不大。

产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究

产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究
一、引言
漆酶是一种重要的工业酶，具有去除污水中有机物、漆水处理、食品添加剂等广泛的
应用。

目前，大部分漆酶产生菌株来源于土壤和水体等自然环境中。

而固体发酵是一种能
够充分利用含固体物质的废弃物进行生物转化的方式，可用于酶的生产。

本研究将选择适
合固体发酵的细菌菌株，进行筛选鉴定及研究其固体发酵条件，以提高漆酶的产量和活
性。

二、方法和材料
1. 菌株的筛选
从土壤和水体中分离细菌，根据产酶圈的形成情况进行初步筛选。

选择产酶圈明显的
菌株进行进一步的鉴定。

2. 细菌的鉴定
利用形态学、生理生化特性和16S rRNA序列分析等方法对选出的菌株进行鉴定，确定其属种。

3. 固体发酵条件研究
确定最适合细菌产漆酶的固体发酵条件，包括pH、温度、底物浓度、初始湿度等。

三、结果
1. 菌株的筛选和鉴定
筛选出多个具有产酶能力的细菌菌株，经鉴定后确定其中一株为Bacillus subtilis。

该菌株的漆酶活性较高，适合用于固体发酵生产。

2. 固体发酵条件研究
在固体发酵条件研究中，发现Bacillus subtilis固体发酵最适宜的pH为7.0，温度为37℃，底物浓度为10g/L，初始湿度为60%。

四、讨论
本研究通过菌株的筛选鉴定和固体发酵条件研究，成功地确定了适合固体发酵生产漆
酶的Bacillus subtilis细菌菌株，以及最适宜的发酵条件。

这些结果为进一步大规模生
产漆酶提供了重要的理论依据和技术支持。

一株产漆酶菌株的筛选与分离

一株产漆酶菌株的筛选与分离作者：范美霞，徐传霞，李俊菊，蔡丽沙，冯庆文来源：《现代食品》 2019年第24期范美霞，徐传霞，李俊菊，蔡丽沙，冯庆文（菏泽市食品药品检验检测研究院，山东?菏泽?274000）Fan Meixia, Xu Chuanxia, Li Junju, Cai Lisha, Feng Qingwen(Heze Inspection Research Institute for Food and Drug Control, Heze?274000, China)摘?要：产漆酶菌株与焦性没食子酸反应能产生棕褐色的变色圈，根据这一原理，从土壤中筛选出一株高产漆酶的菌株，并初步研究了温度对漆酶活性的影响，结果表明50～60 ℃为其活性最强的温度范围。

关键词：漆酶；Bavendamm培养基；变色圈；真菌Abstract：Lacese-Produeing microbial stains react with Bavendamm, the response generated with brown, Through this principle, a strain screened from soil strains of high yield of laccase, and a preliminary study of temperature effect on the laccase activity, the results show that between 50～60 ℃ temperature of its most active.Key words：Laccase; Bavendamm’s medium; Color changing ring; Fungi中图分类号：Q93漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，最早发现于日本漆树的伤流液，广泛存在于昆虫、植物、真菌和细菌中[1-4]。

产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究

产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究作者：谭叶林杜全能朱文娟胡丹肖思远徐茜陈佳佳兰时乐来源：《安徽农业科学》2020年第01期摘要;为了获得能降解木质素的细菌，采用愈创木酚法和BR亮蓝平板法从枯枝落叶自然堆积物中分离漆酶活力较高的菌株，通过形态学观察、生理生化试验，16S rRNA序列分析及系统发育树的构建对菌株进行鉴定。

以芦苇秸秆粉为主要原料，采用单因素试验和正交试验研究并优化了菌株适宜的发酵培养基和发酵条件。

结果表明，菌株H-1鉴定为蜡状芽孢杆菌H-1（Bacillus cereus H-1）;适宜的发酵培养基和发酵条件为芦苇粉100%，（NH4）2SO4 2.5%，酵母抽提粉0.3%，KH2PO4 0.15%，MgSO4·7H2O 0.15%，NaCl 0.5%，CaCl2 0.1%，发酵温度35 ℃，固水比1.0∶1.1（g∶mL），初始pH 7.2～7.4，接种量3%，装量50 g，发酵时间144 h。

在此条件下，漆酶活力达0.992 U/g。

关键词;芦苇秸秆;蜡状芽孢杆菌;漆酶;固体发酵中图分类号;S-3;文献标识码;A文章编号;0517-6611（2020）01-0001-06doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.01.001开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Screening and Identification of Laccase;producing Bacteria and Study on Solid;state Fermentation ConditionsTAN Ye;lin，DU Quan;neng，ZHU Wen;juan et al（College of Bioscience and Biotechnology， Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128）Abstract;In order to obtain lignin;degrading bacteria， the strains with high laccase activity were isolated from natural litter by guaiacol and BR brilliant blue plate method which were identified by morphological observation， physiological and biochemical experiments， 16S rRNA sequence analysis and phylogenetic tree construction. The suitable fermentation medium and fermentation conditions of the strain were optimized by single factor and orthogonal experiments with reed straw powder as the main raw material. The results showed that strain H;1 was identified as Bacillus cereus H-1. The suitable fermentation medium and conditions were as follows： reed powder 100%，（NH4）2SO4 2.5%， yeast extract powder 0.3%， KH2PO4 0.15%， MgSO4·7H2O 0.15%，NaCl 0.5%， CaCl2 0.1%， fermentation temperature 35 ℃， solid;water ratio 1.0∶1.1（g∶mL）， initial pH 7.2-7.4， inoculation volume 3%， loading capacity 50 g， fermentation time 144 h. Under those conditions， laccase activity reached 0.992 U/g.Key words;Reed straw;Bacillus cereus;Laccase;Solid;state fermentation木質素主要存在于木材和各种秸秆中，全世界每年产量约1 500亿t，它是一种取之不尽，用之不竭的绿色再生资源[1]。

产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究

产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究一、绪论漆酶是一种广泛存在于自然界中的酶，具有重要的工业应用价值。

在油漆等化工行业中，漆酶可以加速有机溶剂和有机物的降解，具有分解污染物、提高涂料质量等重要作用。

对于产漆酶细菌的筛选鉴定及固体发酵条件的研究具有重要的意义。

二、产漆酶菌株的筛选为了筛选出产漆酶的菌株，我们采用了固体培养的方法。

从土壤、水体等环境样品中采集菌株，然后将其进行分离纯化。

在培养基中，我们添加了有机溶剂作为唤醒剂，以刺激菌株产生漆酶。

接着，通过平板筛选法，筛选出产漆酶活性高的菌株。

用甲基橙为指示剂进行酶活性测试，并通过测定橙色环的直径来评价菌株的漆酶活性。

三、产漆酶菌株的鉴定对于筛选出的产漆酶菌株，我们进行了鉴定工作。

采用形态学观察的方法，观察菌株的形态特征，如菌落形状、色泽、边缘和胞外酶的生成情况等。

接着，通过生理生化试验，检测菌株对不同营养物质的利用情况，并对其产生的酶活性进行测定。

通过16S rRNA基因序列分析，确定菌株的种属。

四、产漆酶细菌的固体发酵条件研究为了提高漆酶的产量，我们进行了固体发酵条件的研究。

我们优化了基础培养基的配方，确定了最适合菌株生长的基础培养基组成。

接着，通过单因素实验和正交实验，优化了培养条件，包括发酵温度、pH值、初始菌量、发酵时间等。

通过对发酵产物的酶活性进行测定，确定了最佳的固体发酵条件。

五、结论通过筛选鉴定和固体发酵条件的研究，我们成功地获得了一株高产漆酶的细菌菌株，并确定了最佳的固体发酵条件。

这为产漆酶的工业化生产提供了重要的理论基础和技术支持，具有重要的应用价值。

我们的研究结果对于深入了解漆酶的产生机制、酶的结构和功能，以及漆酶的应用研究也具有重要的参考意义。

漆酶高产菌株的筛选实验方案

漆酶高产菌株的筛选实验方案漆酶是一种能够分解木质素的酶，被广泛应用于漆酶工业生产中。

为了获得高产漆酶的菌株，可以采用以下筛选实验方案。

首先，准备木材素作为酶的底物。

木材素是漆酶的天然底物，因此使用木材素可以更好地模拟真实环境，提高筛选的准确性。

接下来，采集不同环境中的泥土样品。

漆酶产生菌株存在于自然环境中的泥土中，因此从不同环境中采集泥土样品能够获得更多潜在的高产漆酶菌株。

然后，制备泥土微生物的培养基。

泥土样品中的微生物需要合适的培养基进行生长，通常可以使用Czapek-Dox培养基作为基础培养基，并根据实际情况进行优化。

随后，进行菌株的分离与纯化。

将采集的泥土样品进行稀释，并分别洒在含有木材素的琼脂板上。

通过观察是否存在环带或透明圈，从木材素周围分离出对木材素具有降解能力的菌株。

然后将菌株进行连续传代，并进行单菌落的分离，最终得到纯化的菌株。

接着，筛选高产漆酶的菌株。

采用固体培养，将纯化的菌株接种到含有木材素的琼脂板上，培养一定时间后，观察琼脂板上是否出现降解区域。

根据降解区域的大小和颜色的深浅，可以初步评估出菌株的木质素降解能力。

然后，选取降解能力较强的菌株进行液体培养。

将选取的菌株接种到含有木材素的液体培养基中，进行摇瓶培养。

培养一定时间后，通过测定液体培养基中木质素的降解率来评估菌株的降解能力。

最后，通过PCR扩增和酶活测定等分子技术手段对菌株进行鉴定与验证。

通过PCR扩增菌株的漆酶基因序列，并与已知的漆酶基因序列进行比对，验证菌株是否真正具有漆酶产生能力。

同时，使用酶活测定方法对菌株中的漆酶酶活进行测定，验证菌株的漆酶活性。

以上是一种对漆酶高产菌株进行筛选的实验方案。

通过以上步骤，可以筛选到具有高降解能力和高酶活的漆酶菌株，为漆酶产业的发展提供有力支持。

8 实验3 漆酶产生菌的分离筛选

实验3 漆酶产生菌的筛选1.实验原理：菌种筛选包括分离、初筛和复筛等几个步骤，挑选具有某种能力的有用菌种，根据不同的筛选目的，采用不同的筛选路线。

白腐菌能够分泌胞外氧化酶降解木质素，被认为是最主要的木质素降解微生物。

木质素降解酶系主要包括三部份: 木质素过氧化物酶(Lip）、锰过氧化物酶(MnP)以及漆酶( Lac)。

由于漆酶能把分子氧直接还原为水，与其他木质素降解酶相比，具有更大的实际应用价值。

漆酶是一种含铜多酚氧化酶，分子量在64-390kD之间。

由于漆酶具有氧化与木质素有关的酚类和非酚类化合物以及高度难降解环境污染物的能力, 因此在食品工业、制浆和造纸工业、纺织工业、土壤的生物修复等领域具有广泛的应用前景，因此筛选高产漆酶的白腐菌显得至关重要。

由于木质素结构的复杂性，可选用木质素类典型化合物，如单聚物香草酸、愈创木酚、苯酚、磷甲基苯酚；二聚物愈创木基甘油-B-松柏醇醚(GGE）、脱氢联松柏醇(DCA), 1,2-二愈创木基丙烷-1,3-二醇等。

可选用相对便宜的愈创木酚为唯一碳源的选择性培养基，从土壤中分离就可以筛选出产漆酶的木质素降解菌。

漆酶可以使无色的愈创木酚氧化为褐色，因此愈创木酚平板可以作为漆酶的筛选平板。

对于白腐菌来说，变色圈的形成有两种：一种是变色圈在菌丝的外圈，此时菌丝圈直径度色圈直径小于1；另一种是变色圈，在菌丝的外圈形成菌丝圈直径与变色圈直径比值大于1的菌株。

菌丝圈与变色圈直径的比值可作为判断该菌是否能选择性降解木素的依据，比值小于1则该菌能选择性降解木质素；比值大于1的菌则首先降解纤维素。

由于选择性降解木质素的菌株在制浆造造纸等行业更显优势，因此本试验主要是筛选选择性降解木质素的菌株。

本次实验需6个课时，但实验周期较长。

2.实验材料2.1仪器设备电子天平、磁力搅拌器、高压灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、冰箱、纯水机、移液枪等。

2.2试剂葡萄糖、KH2PO4、MgSO4•7H2O 、V B1、愈创木酚、酒石酸钾、蛋白胨、MgSO4、KH2PO4、Na2HPO4琼脂等。

漆酶生产工艺的研究与改进

漆酶生产工艺的研究与改进一、引言漆酶是一种分子量较小的酶，具有广泛的应用前景。

其中最具代表性的用途就是在工业生产中作为生物催化剂，提高产物的纯度和收率，降低生产成本。

一直以来，漆酶的生产工艺一直是生物技术研究领域的热点之一，众多科学家和研究机构致力于发掘更高效的漆酶生产工艺。

二、漆酶的生产工艺目前，漆酶生产工艺主要采用微生物发酵法。

常见的产生漆酶的微生物包括铜绿假单胞菌和黄杆菌。

不同的菌株对生产条件的需求不同，需要通过不断优化来提高生产效率。

1. 菌株的选择漆酶的生产效率和菌株的选择有很大的关系。

铜绿假单胞菌和黄杆菌是目前最常被用于漆酶生产的微生物，在这些菌株中，铜绿假单胞菌的产量更高。

此外，国内外还有一些新的细菌被挖掘出来，值得进一步研究其漆酶生产的潜力。

2. 发酵条件的控制生产漆酶的过程中，发酵条件的控制至关重要。

pH值、温度、发酵时间等条件都需要严格控制。

此外，发酵过程中的氧气供应也需要控制在适宜范围内。

目前，通常采用气体补给技术和在线监测技术来保证氧气供应的平衡。

3. 收割和提取技术收割和提取技术也是影响漆酶生产效率的重要因素之一。

通常采用离心法或超滤法来收集菌体，然后使用水解酶或超声波等技术来提取漆酶。

这些方法不仅能提高漆酶的产量，还能改善漆酶的纯度和活性。

三、漆酶生产工艺的改进在不断改进的过程中，科学家们提出了很多新的漆酶生产工艺。

常见的改进方法包括：1. 基因工程改造利用基因工程技术，可以通过改造菌株的代谢途径和调节酶基因的表达来提高漆酶的产量。

研究表明，通过基因工程改造，可以将漆酶的产量提高一到两倍。

2. 大规模化生产技术目前，漆酶的生产工艺已经转移到了大规模化生产阶段。

通过使用发酵罐、气体补给器、离心机和超滤器等设备，可以在短时间内生产出大量的漆酶。

此外，使用自动化控制技术也能够提高漆酶生产效率。

3. 生化反应工程生化反应工程是现代生物技术的重要组成部分。

通过研究发酵条件、酶的稳定性和保护因子等因素，可以实现漆酶的高效生产。

一株产漆酶菌株的筛选鉴定和发酵条件的研究

一株产漆酶菌株的筛选鉴定和发酵条件的研究
一株产漆酶菌株的筛选鉴定和发酵条件的研究
以愈创木酚为底物,采用平板筛选法筛选得到一株产漆酶菌株WS1-2,形态学特性表明该茵属于绿色木霉.对产酶条件的初步研究结果表明,WS1-2菌株的产酶高峰期出现在接种培养后的第4d.与蔗糖、乳糖、半乳糖和可溶性淀粉相比,以葡萄糖为碳源时,发酵上清液的漆酶活力明显要高,最大值达230U/L.以NH4Cl为氮源,最有利于WS1-2漆酶的产生,漆酶活力最高可达到234U/L.0.01mmol/L的愈创木酚和ABTS 对WS1-2产漆酶有明显的诱导作用,3～5mg/L的Tween-80可以明显提高WS1-2的产酶水平.
作者：刘敏张明 LIU Min ZHANG Ming 作者单位：安徽农业大学生命科学学院,合肥,230036 刊名：生物学杂志 ISTIC 英文刊名：JOURNAL OF BIOLOGY 年，卷(期)：2008 25(3) 分类号：Q935 关键词：绿色木霉愈创木酚形态学特征酶活力。

产漆酶真菌的筛选及发酵产酶条件的优化

产漆酶真菌的筛选及发酵产酶条件的优化作者：王雪刘太林杨焜梅王志成湛莹薛兆淞李永佳来源：《安徽农学通报》2019年第23期摘要：从4种白腐真菌（金针菇Flammulina velutipes、秀珍菇Pleurotus geesteranus、鸡腿菇Coprinus comatus、黑木耳Auriculariaheimuer）中通过愈创木酚与漆酶形成显色圈时间、大小、颜色深浅的方式筛选出产漆酶能力最强的菌株为金针菇。

研究了碳源、氮源、各种理化因素等培养条件对漆酶分泌的影响，并通过正交实验设计优化产酶条件。

单因素结果表明：pH 为5时，漆酶分泌最高，酶活分别为235U/mL;培养温度28°C时，漆酶分泌最高，酶活分别为269U/mL;培养时间7d，漆酶分泌最高，酶活分别为311U/mL;蔗糖作碳源、豆粕作氮源，且碳氮总量不变时，碳氮比为10∶1时漆酶分泌最高，酶活为309U/mL。

正交试验表明：蔗糖10g/L，豆粕1g/L，在250mL的三角瓶中，pH为6，温度28°C时，金针菇在第5天达产酶高峰，峰值酶活为330U/mL。

关键词：漆酶;筛选;金针菇;培养条件中图分类号; TQ92 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）23-0031-04Screening of Laccase-producing Fungi and Optimization of Fermentation Conditions for FermentationWang Xue et al.（Food Engineering College，Tianshi College，Tianjin 301700，China）Abstract：From four species of white rot fungi，Flammulina velutipes，Pleurotus geesteranus，Coprinus comatus，Auriculariaiaheimuer，the strains with the highest laccase production capacity were selected as Flammulina velutipes by comparing the formation cycle time，size and color of guaiacol and laccase.The effects of culture conditions such as carbon source，nitrogen source and various physical and chemical factors on laccase secretion were studied，and the conditions for enzyme production were optimized by orthogonal experimental design. The single factor results showed that the laccase secretion was the highest at pH 5 and the enzyme activity was 235 U/mL. The laccase secretionwas the highest at 28°C，and the enzyme activity was 269 U/mL. The laccase secretion was reached at 7 days. The peak activity was 311 U/mL;sucrose was used as carbon source and soybean meal was used as nitrogen source. When the total carbon and nitrogen specific gravity was unchanged，the laccase secretion was the highest at 10：1，and the enzyme activity was 309 U/mL. Orthogonal test showed that：sucrose 10g/L，soybean meal 1g/L，in a250mL volumetric flask，pH is 6，the temperature of 28 °C，Flammulina velutipes reached the peak of enzyme production on the 5th，the peak enzyme activity was 330U/mL.Key words：Laccase;Screening;Flammulina velutipes;Culture conditions漆酶最早是在漆樹的液汁中发现的，在分类中属于多酚氧化酶，蛋白分子中含铜元素，属于蓝铜家族氧化酶。

产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究

产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究一、引言漆酶是一种重要的酶类，具有较宽的应用领域。

它能够氧化各种酚类物质，具有氧化还原作用，广泛应用于染料、造纸、医药等工业领域。

而细菌资源是一种潜在的产漆酶资源。

对产漆酶细菌的筛选鉴定及固体发酵条件的研究具有重要的理论和应用价值。

二、产漆酶细菌的筛选鉴定1. 筛选菌种产漆酶细菌的筛选是通过对大量的细菌进行筛选和鉴定，以找到高产漆酶的菌株。

筛选菌种的方法有多种，最常见的是通过对土样、水样、沉积物等环境中的微生物进行分离培养，通过酶活性的检测和分析来判断细菌的产酶能力。

近年来，随着分子生物学技术的发展，常规分离培养方法的不足逐渐显现出来。

也可以通过PCR扩增和基因测序的方法对微生物进行鉴定，找到潜在的高产漆酶菌株。

2. 鉴定菌种对于通过分子生物学技术找到的潜在高产漆酶菌株，还需要进行鉴定验证。

鉴定菌种的方法有生理生化鉴定和分子生物学鉴定两种。

生理生化鉴定主要通过对细菌在不同培养基、不同温度、不同pH等条件下的生理生化特性进行鉴定，分子生物学鉴定主要通过对菌株的16S rRNA基因进行测序和比对，从而确定其分类地位和亲缘关系。

三、固体发酵条件的研究1. 发酵基质的选择发酵基质的选择对漆酶的产量和质量有着重要影响。

常见的发酵基质有玉米芯、小麦麸、大豆皮等，这些基质均为农副产品废弃物，具有丰富的碳源和氮源，适合用于漆酶的生产。

目前，常见的固体发酵基质优化方法包括改变基质成分比例、添加辅料等，以提高漆酶的产量。

2. 发酵条件的优化固体发酵对于漆酶的生产有着重要的影响，包括温度、pH值、湿度、通气等条件都会影响漆酶的产量和质量。

常见的发酵条件优化方法包括响应面法、单因素试验法、正交试验法等，通过对各个发酵参数进行调整，找到最适合漆酶生产的发酵条件。

四、结语产漆酶细菌的筛选鉴定及固体发酵条件的研究是一个复杂而又重要的课题。

通过对有效菌种的筛选鉴定和固体发酵条件的研究，为漆酶的产业化生产提供了理论基础和技术支撑。

产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究

产漆酶细菌筛选鉴定及固体发酵条件研究1. 研究背景漆酶是一类能分解漆酚的酶，具有广泛的应用前景。

目前，产漆酶的菌株主要有放线菌、细菌、真菌等。

其中，细菌产漆酶的效率较高，且易于工业化生产。

因此，筛选和鉴定高效产漆酶的细菌株，并对其进行固体发酵条件研究，具有重要的意义。

2. 筛选鉴定产漆酶细菌2.1 筛选菌株来源从野外土壤、河流水样、废弃物等样品中筛选，收集到的样品应多样性、覆盖面积广，可增加筛选到合适菌株的概率。

2.2 筛选方法2.2.1 选择富含漆酚的培养基常用的培养基有Potato Dextrose Agar（PDA）培养基、Czapec-Dox培养基、Mineral Salt Medium（MSM）培养基等。

其中，富含漆酚的选择性培养基可增加筛选到产漆酶菌株的几率。

2.2.2 测定漆酶活性将潜在菌株接种在含有漆酚的培养基上，培养一定时间后取样测定漆酶活性。

活性高的菌株可以被选择用于后续研究。

2.2.3 16S rRNA序列分析选择漆酶活性高的菌株进行16S rRNA序列分析，依据序列相似度、系统发育关系等参数，确定其分类学地位。

3. 固体发酵条件研究3.1 基质选择从可获得性、成本低、未对环境造成污染等方面考虑，选择米糠、玉米秸秆等当地廉价自然资源作为基质。

3.2 酸碱条件在漆酶的适宜pH范围内选择适宜的酸碱调节剂，使固体发酵过程中的pH值稳定，不影响菌株的生长及漆酶产生。

3.3 湿度控制在不影响氧气传递的前提下，控制固体基质中的湿度。

可通过加水或旋转鼓的调节实现。

3.4 温度调节根据菌株的生长特性，将其生长温度控制在适宜的范围内。

培养室可安装自动温控仪，实现对温度的控制。

4. 结论筛选鉴定高效产漆酶的细菌株，并对其进行固体发酵条件研究，可为产漆酶的工业化生产提供重要的理论和实践基础。