RACE不用试剂盒
5-RACE经验
5 Race(2007-11-18 21:37:08)转载▼分类：核酸技术如果您顺的话，一个礼拜足矣！同意，5'-RACE确实比较难，但也有顺利的时候，我上周做5'-RACE也一次就成功了，我觉得关键还是RNA 的质量，如果RNA模板质量不好，后面做得再认真也是白费！当时要克隆基因的5'GC含量达到了80%，一般的反转录酶和PCR都拿不到，后来加了海藻糖60度反转录一个小时后，用TaKaRa的GC-Buffer和LA-Taq才扩出来，当时就为了这个5端，很是费了力气。
如果RCR产物不是很特异或没有目的条带的话，建议用nest PCR。
在做5‘时，对RNA要求比较高，最好用新鲜的组织提，随即做逆转录，扩增。
做RACE PCR条带单一的不多，尽可能的回收与目的片段大小相近的条带。
克隆的时候，一般kit上建议挑8-10个克隆，多一个，多一份希望，因为RACE，尤其是5’太难了，我作了约6个月。
偶没有买试剂盒，自己合成了3条引物，买了反转录酶。
然后一次就出来了。
RACE的盒子最常用的是CLONTECH和INVITROGEN的，这个方法我也试过很多次了，方法很简单，但是作出来效果非常的不理想。
PCR出来的东西都是杂七杂八的东西，更多的时候是弥散的条带。
SmartRace 既然称之为Smart，因为它的引物能特异的识别5'端帽子位点，因此排除了所有非完全的逆转录。
再加上使用基因特异性引物，使其做出来的可能性更大。
这个方法省钱，但是我不是很看好，祝好运。
另，建议你不要用oligodT进行逆转录，在基因mRNA300bp处设计一条或几条基因特异性逆转录引物更好。
希望你能有好结果。
我刚做过5’、3‘ RACE，我个人的经验如下：1、首先，提的RNA必须完整，最好跑个RNA电泳来验证一下；2、设计引物时要注意：Tm最好大于70度，两引物间要有100-200bp的重叠区；3、用巢氏PCR相对容易出结果；4、如果出现多个条带，要分别验证；5、PCR过程中，我一般分两次，第一次用touchdowm PCR，后产物稀释50倍，作二次，72度尽量长一点，我们一般用2-3min；6、结果分析，最好是重叠区吻合，否则，应重新做。
5'race具体方法和实验流程
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RACE的简介.
通过PCR的方法获得全长cDNA：
利用胶回收试剂盒回收cDNA。此试剂 盒适合回收2.5kb以下的RACE产物； 对于长的片段，可以通过电洗脱获得好 的结果。如果你选择使用其他的纯化方 法，最后用Tricine－EDTA buffer 30μl重新悬浮DNA样品。 将全长的cDNA克隆到T/A型的 PCR克 隆载体中。
对于5‘端的RACE产物，我们建议挑取至 少8－10个不同的克隆以获得5‘端的最大 可能性的序列。（反转录并不总是进行到 mRNA模板的5’末端，尤其是长模板。 另外，T4 DNA聚合酶会移走5‘末端的0 －20个碱基。） 一旦鉴定了含有插入片断的克隆，应该获 得多的序列信息。理想的是，可以对整个 开放读码框进行测序。包括5‘和3‘的非翻 译区。
通过PCR的方法获得全长cDNA：
在1.2%的琼脂糖凝胶上分析5μl的样品。 通常情况下，可以见到一条单一带，如果 这样，利用胶来纯化全长的cDNA。 制备1.2%的TAE buffer制备琼脂糖凝胶。 不使用TBE buffer，TBE的胶很难制备全 长的cDNA。 将剩下的45μl反应物点样，选用适当的 marker。 利用长波紫外观察cDNA（≧300nm）切 下全长的cDNA。注意：应该尽量减少紫 外对cDNA的照射。
谢谢大家！
如果要用重叠片段来检测设计的引物， GSp1和GSp2之间至少是100－200碱基。 只有这样才可以用扩增的产物来鉴定设计 的引物是否正确。 降落PCR可以明显的增加RACE PCR产物 的特异性。在最开始的循环中，退火温度 高于AP1引物的Tm值，可以增加对特异性 条带的扩增。随后的退火和延伸的温度降 回到AP1的温度，可以进行随后的PCR循 环。
RACE技术原理
RACE的基本概念 不同厂家RACE试剂盒的介绍 RACE技术的关键环节
存在的问题及解决办法
RACE的基本概念
cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术是基于PCR技术由已知的部分
cDNA序列来获得完整cDNA序列的一种方法，
在PCR反应中有足够的全长产物能被探测。
TdT加尾反应及其替代反应
第三，若目的cDNA中含有与多聚尾互补的几个核苷酸同 聚区，则在合成第二条cDNA链时引物的延伸会从内部序 列而不是末端序列开始，产生非全长的第二条cDNA链。
我们所使用Invitron公司的RACE试剂盒，采用PCR介导的
连接反应，在一定程度上避免了以上的问题。
RACE试剂盒中末端转移的是多聚C尾，这样在反转录合 成第一链时5’端多聚G的二级结构影响反转录的彻底进行，
会产生提前终止反应。我们改进了加尾的程序，用TdT酶 加上多聚T尾，结果降低了反转录的难度，两个基因最终 均获得了完整的5’末端。
RACE引物的设计
在实验过程中总结如下经验：
1.
2.
引物不能设计在保守区简并引物区。
2.
反转录提前终止
模板中有特殊的二级结构，反转录提前终止。通过提高 反转录的温度，加大反转录的反应体系以及反转录过程 中一直保持已变性的RNA模板处于50℃以上，避免以解
开二级结构的RNA再恢复原来的结构，以达到5’末端。
提供一种改进的反转录方法
1. 2.
3. 4.
5. 6.
7.
在RNase-free的0.2 mL Eppendorf 管中加入以下成分： Oligo(dT)(0.5μg) 1μL Total RNA(4~5μg) 3μL DEPC-H2O To 25 μL 混匀，70℃保温10min；50℃保温5min；稍微离心一下。 在混合物中，依次加入以下成份： 10X SSⅡ（ SSⅢ ）Buffer 5.0μL 10mM dNTP mix 1.0μL 0.1M DTT 2.0μL RNase Inhibitor(40U/μL) 1.0μL DEPC-H2O To 24 μL 轻轻混合，在50℃保温5min后，在50℃下将3号管中的混合成分移入 2号管中。 每个反应加入1μL SuperScriptTM Ⅱ（SSⅢ ），轻轻混匀，50℃反应 50min。 70℃放置15min以终止反应。 -20℃保存。
race心得
我做RACE两年了，个人觉得基因特异性引物对结果的影响还是很大的。
我用的是BD SMART RACE试剂盒，一共扩出三个基因全长（用了不到一年的时间，现在快毕业了，在做后期的工作）。
我用的是师兄剩下的试剂盒，当时盒子带的DNA聚合酶已经用完了，老板当然不愿意花那么多钱买新的，我觉得只要反转录酶还有，用普通的Taq酶应该没问题，于是开始下力气作RACE，可是将近半年一无所获。
在快要开题的时候，终于云开雾散，见了晴天，三个目的基因的3’端都得到了，其中一个基因的5’也出了结果。
回头看看，发现什么都没换过，反转录产物一直用的都是同一批，不同的只有引物（试过将近20个基因特异性引物啊，之前真的都要绝望了），可见引物设计的好坏是有决定性影响的。
现在将我做RACE的一些经验和大家谈谈，也当回答楼上几位的问题：1. 作3’RACE用TaKaRa的盒子足够了，还能省点钱；5’RACE难一些，SMART RACE比较好2. RNA的质量要好，否则一切无从谈起。
3. RACE前，最好做个RT-PCR验证一下反转录产物的质量（当然是在已知序列长度允许的前提下），如果能得到预期长度的条带，要是通过测序再确定以下当然更好，这时再开始做RACE才会比较放心——自己要的鱼在水里了，才钓得出来，要不然再好的鱼竿、再好的诱饵也白搭。
4. 不要迷信各种引物设计和分析软件，那些都是辅助工具，用那些东西搞出来的引物常常不灵的，做RACE引物设计最要命的是Tm值，如果Tm足够高，退火温度就可以设的很高，那样什么发夹结构，什么在非目的位点的错配，基本上可以灰飞烟灭。
正所谓做大事不拘小节，试验试验，很多时候就是要试的，不要被这个那个软件的结果弄得缩手缩脚，在我的实验中，有几个被软件认为很糟糕的引物（错配碱基达到十个，但不在3’端，明显而稳定的发夹结构）都在实战中被证明是非常优秀的。
5. 第一轮什么都没有，或者弥散都不要害怕和灰心，一个锚定引物，一个基因特异性引物一轮就出特异条带，那才稀奇，做个二次PCR，或者巢式PCR经常会有惊喜，我的一个目的基因3’做了三轮才出来，所以千万别灰心。
RACE说明
TaKaRa Code：D3155’-Full RACE Kit(10次量)目录内容页码●制品说明 1 ●制品内容 1 ●保存 2 ●试剂盒原理 2 ●特异性引物的设计要求 3 ●试剂盒特点 3 ●RNA样品制备 3 ●试剂盒使用注意 4 ●使用Control HL60 Total RNA时的5′RACE实验例 4 ●实验样品的5′RACE操作方法 8 ●实验例 11 ●Q&A 11●制品说明本试剂盒是高灵敏度、高特异性扩增cDNA 5′末端全长的试剂盒。
使用RT-PCR方法扩增目的DNA时，一般很难得到全长的cDNA片段，在基因工程研究中，分析遗传基因的全长cDNA序列十分重要。
RACE （Rapid Amplification of cDNA Ends）法能有效解决这一问题。
TaKaRa 5′-Full RACE Kit能够通过已知的cDNA序列，高灵敏度、高特异性地扩增cDNA的5′末端的全长序列。
本试剂盒应用了“去帽法”原理，Tobacco Acid Pyrophosphatase（TAP）可以去掉mRNA的5′帽子结构，使用T4 RNA Ligase将5′RACE Adaptor连接到mRNA的5′端后，可以使用5′RACE Adaptor 上的引物与已知序列部分的引物进行RT-PCR反应，高特异性地扩增cDNA 5′末端的全长序列。
本试剂盒中含有完成5′RACE操作的主要试剂。
试剂盒中使用的Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）经过了本公司的特殊改良，反转录性能良好，无RNase H活性，大大增加了反转录性能。
结合使用TaKaRa LA Taq®（TaKaRa Code：DRR02AM）进行PCR扩增时，其5′RACE的扩增性能大大优于其他同类产品。
本试剂盒应用了套式PCR原理，增加了PCR扩增的特异性与灵敏度，可以对少量样品或低丰度的基因进行5′RACE实验，并且对长片段的5′RACE扩增具有明显优势。
RACE技术2解析
基因特异性引物（GSPS）应该是
23－28nt 50－70％GC Tm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果 需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和 3‘RACE反应的基因特异性引物（GSP1和 GSP2).由于两个引物的存在，PCR的产物是特 异性的。
反应中涉及到的一些事项
引物(根据已知序列设计)和PolyT引物PCR即
可。大多实验者反映一次PCR可以搞定。
SMARTTM 3‘-RACE的原理
5'-RACE ：5'-RACE相对较难，目前流行几种5'RACE。其一为加接头(传统)，根据接头引物和自 己设计特异引物PCR，可以设计巢式PCR二次扩 增。另外，有利用反向PCR技术，连接成环在 PCR。还有，GENE公司一种 smartRACEPCR，利 用反转酶末断加C特点,直接加上多G接头，转换模 板而无需用连接酶加接头。利用mR原理图
SMARTTM 5'-RACE的原理
先利用mRNA的3‘末端的poly（A）尾巴作为 一个引物结合位点，以Oligo（dT）30MN作 为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转 录合成标准第一链cDNA.利用该反转录酶具 有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链 的5’末端时自动加上3-5个（dC）残基，退 火后（dC）残基与含有SMART寡核苷酸序列 Oliogo（dG）通用接头引物配对后，转换为 以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接 头。
RACE 是采用PCR技 术由已知的部分 cDNA 顺序来扩增出 完整cDNA5’和3’ 末端,是一种简便而有 效的方法, 又被称为 锚定 PCR (anchoredPCR)和单边 PCR(one2side PCR)。
RACE技术主要分类
RACE实战经验(节省新手时间)一、我刚做过5、3RACE,我个人的
RACE实战经验（节省新手时间）一、我刚做过5'、3 ‘ RACE我个人的经验如下：1、首先，提的RNA必须完整，最好跑个RNA电泳来验证一下；2、设计引物时要注意：Tm最好大于70度，两引物间要有100-200bp 的重叠区；Tm最好大于70度的原因如下：a）T m 大于70 度，好做touchdown PCR ；b）相应加长引物，可以更有效地扩增，尤其是针对丰度低、比较难扩的产物。
插曲：为什么要做Touchdown PCR?touchdown PCR是退火温度一步一步降低，指第一阶段PCR时退火温度在每一个循环都降低一定的值如此扩几个循环，然后进入正常PCR。
这样开始的是特异性高的目的片断，到后来目的片断增加后，降低退火温度来提高产量。
非特异带再开始高温扩增少，后面温度降低时，特异带产量已高于非特异产物，最后特异产物再最终产物中占优势。
3、用巢氏PCR相对容易出结果；4、如果出现多个条带，要分别验证；5、PCR过程中，我一般分两次，第一次用touchdowm PCR，后产物稀释50倍，作二次，72度尽量长一点，我们一般用2-3min ；6、结果分析，最好是重叠区吻合，否则，应重新做。
二、花了2, 3个月，我的5 ‘ RACE试验总算成功了，有些心得体会与大家分享。
我用的是Gen eRacer Kit，约5000人民币/kit，可做5次。
本人用过GenRacer, Oligo-capping 等全长cDNA合成方法。
除了作过不同的方法之比较外，也有诸多实战经验。
希望同仁们能对下面两篇敝作予以指正。
特别提醒，在用Gen Racer时，还碰到过一bug, 多次对产物测序结果竟然显示引物内的序列与说明书中不一致，在上海博亚公司重新合成引物后，作对比实验，发现试剂盒中引物bug的真实存在。
各位可要小心。
最初我严格按照说明上的要求，总RNA取其要求的最大量即5ug （非常少，沉淀后几乎看不到），再进行RNA脱磷酸反应，反应后用苯酚：录仿等沉淀rna ;再进行mRNA脱帽反应，反应后用苯酚：录仿等沉淀rna;再用T4 RNA ligase连接脱帽mRNA 至Gen eRacer RNA OLIGO 上，反应后再次用苯酚：录仿等沉淀rna ；最后用superscript III 进行RT 反应，最后用Gen eRacer 5' primier 及我的下游GSP用高保真酶进行PCR。
RACE(rapid-amplification_of_cDNA_ends)
RACE技术的简介RACE技术的简介cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要。
完整的cDNA 序列可以通过文库的筛选和末端克隆技术获得。
末端克隆技术是20世纪80年代发展起来的。
RACE(rapid-amplification of cDNA ends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。
RACE的优点:与筛库法相比较，有许多方面的优点1）此方法是通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。
2）节约了实验所花费的经费和时间。
3）只要引物设计正确，在初级产物的基础上可以获得大量的感兴趣基因的全长。
实验室常用的RACE试剂盒的简介RACE是一种从一个相同的cDNA模板进行5‘和3‘末端快速克隆的方法。
此方法会产生较少的错误条带。
此过程中使用的酶混合物非常适合长链PCR。
使用此方法的要求是必须知道至少23－28个核苷酸序列信息，以此来设计5’末端和3‘末端RACE反应的基因特异性引物（GSPs）。
RACE引物的设计：基因特异性引物（GSPs）应该是：23－28 bp50－70％ GCTm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE反应的基因特异性引物（GSP1和GSP2)。
由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。
注意事项：1、cDNA的合成起始于polyA+RNA。
如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高。
2、RACE PCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。
3、在进行5‘和3’RACE PCR的时候应该使用热启动。
4、重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。
另外，重叠的引物可以为PCR反应提供一个对照。
并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。
5、引物GSP中的GC含量要在50－70％之间。
这样可以使用降落PCR。
避免使用自身互补性的引物序列，否则会产生回折。
RACE技术的原理和操作
RACE技术的原理和操作RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）技术是一种用于扩增cDNA末端序列的方法，广泛应用于克隆和鉴定未知基因的研究中。
下面将详细介绍RACE技术的原理和操作步骤。
一、原理：RACE技术是通过逆转录反应将RNA转录成cDNA，然后利用特殊的引物设计，通过聚合酶链式反应（PCR）进行扩增，最终得到所需的cDNA末端序列。
RACE技术主要包括5'-RACE和3'-RACE两个步骤。
5'-RACE：用于扩增未知序列的5'端操作步骤：1.提取总RNA，并进行逆转录反应，得到第一链cDNA。
2.利用聚dT载体和逆转录酶进行第二链合成。
3.利用内源引物（如具有较高表达的基因的已知序列）和外源引物A 进行PCR扩增。
4. 应用Nested PCR进行第二轮扩增，内嵌引物（nested primer）会在前一轮PCR反应的基础上扩增更长的特异性产物。
5.得到扩增的特异性产物后，纯化PCR产物并进行测序分析，获得5'端的未知序列。
3'-RACE：用于扩增未知序列的3'端操作步骤：1.提取总RNA，并进行反转录反应。
2.利用特异性引物（如基因的已知3'端序列）和逆转录酶进行第一轮PCR扩增。
3. 利用Nested PCR进行第二轮扩增，内嵌引物（nested primer）会在前一轮PCR反应的基础上扩增更长的特异性产物。
4.纯化PCR产物并进行测序分析，获得3'端的未知序列。
二、操作：1. 提取总RNA：一般使用RNAiso Plus试剂或类似试剂从细胞或组织中提取总RNA。
2. 逆转录反应：利用逆转录酶将RNA转录成cDNA。
逆转录酶一般有M-MLV逆转录酶和SuperScript III等。
3.第一链合成：利用聚克隆酶将逆转录的cDNA合成第一链，即得到第一链cDNA。
4.第二链合成：利用特殊的引物和逆转录酶将第一链cDNA合成第二链。
race实验原理
race实验原理摘要：一、引言二、race 实验的原理1.实验基本概念2.实验主要步骤3.实验关键器材与试剂三、实验应用与意义1.在医学诊断中的应用2.在生物学研究中的应用3.社会影响与意义四、结论正文：一、引言Race 实验，全称为Restriction Fragment Length Polymorphism，中文意为限制性片段长度多态性实验，是一种分子生物学实验技术。
该技术通过检测DNA 分子的特定核苷酸序列，分析个体间的遗传多态性，为遗传病的诊断、生物学研究以及法医学等领域提供了有力的工具。
二、race 实验的原理1.实验基本概念Race 实验利用限制性内切酶对DNA 分子进行切割，产生不同长度的DNA 片段。
这些片段在电泳过程中，因大小不同而形成不同的带状图案，从而表现出遗传多态性。
2.实验主要步骤（1）DNA 提取：从样本中提取DNA。
（2）限制性内切酶消化：将提取到的DNA 与限制性内切酶混合，进行切割。
（3）电泳：将切割后的DNA 片段进行电泳，根据大小分离出不同的片段。
（4）染色与观察：利用荧光染料对DNA 片段进行染色，在紫外灯下观察带状图案。
3.实验关键器材与试剂（1）器材：电泳仪、离心机、PCR 仪等。
（2）试剂：DNA 提取试剂盒、限制性内切酶、荧光染料等。
三、实验应用与意义1.在医学诊断中的应用Race 实验广泛应用于遗传病的诊断，如地中海贫血、血友病等。
通过检测患者的基因型，可以对疾病进行准确诊断，为治疗和遗传咨询提供依据。
2.在生物学研究中的应用Race 实验在生物学研究中发挥着重要作用，如基因克隆、基因突变分析、基因表达研究等。
此外，Race 实验还可以用于动植物的遗传多样性研究，为保护濒危物种提供数据支持。
3.社会影响与意义Race 实验技术的发展，推动了遗传学、分子生物学等领域的进步，为人类认识生命规律、攻克疾病提供了有力武器。
同时，在法医学领域，Race 实验为DNA 鉴定提供了可靠手段，为刑事案件的侦破提供了有力支持。
5'race 现在的通用方法是根据CLONTECH SMART RACE kit 改进而来的方法
5'race 现在的通用方法是根据CLONTECH SMART RACE kit 改进而来的方法那个试剂盒很坑爹的，价格高的离谱。
其实在实验过程中完全没有必要买试剂盒，下面我来告诉你怎么玩。
原理：5'race的关键目的就是要克隆出已知片段上游的未知片段。
方法就是在反转录的过程中人为的在5'端加上接头，然后利用接头上面的特异序列作为引物和你已知序列上面的一段引物扩增cDNA片段，就能得到5'未知序列片段。
方法：在反转录的过程中加入5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG–3'这个接头引物。
在反转录之后这段序列就会位于整个mRNA反转录出来的cDNA的最前端。
为什么？？MMLV反转录酶有一种特性就是在反转录到序列末端的时候加上三个C来终止这个反转录过程，利用这添加上去的CCC和上面给你的那个接头引物的GGG碱基配对，MMLV 就会以上面那个引物为模版将反转录出来的第一链继续延伸出接头引物的互补链，从而形成一个带接头的cDNA 5'-末端。
这个就是RACE的核心原理。
具体不明白的看看这篇说明书就好，GOOGLE一搜，结果满天飞的，我就不给你传文件了。
SMART™ RACE cDNA Amplification Kit User Manual你肯定有一下问题1.上面给你的那个接头引物能不能换掉。
上面那个引物看起来好像很普通，其实里面大有玄机，如果你用DNAMAN软件预测一下引物的二级结构就可以发现，这个引物自身能形成一个类似老虎钳子的形状，而且仅仅只有GGG三个核苷酸暴露在外面用来和MMLV添加出来CCC配对。
所以这个引物的设计是非常巧妙的。
不建议你更换，而且你换掉以后自己要在你实验动物的基因组中验证是否存在相同或互补序列，这也是另一个问题。
2.是不是用普通的方法合成该接头引物即可。
答曰，可以。
clontech公司提供的试剂盒里面的这段引物其实并非全是单链DNA，用于配对的那关键的GGG用的是RNA单链，为什么？原因是DNA-RNA的结合能力强于DNA-DNA。
RACE原理及实验步骤
RACE原理及实验步骤RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增和克隆未知DNA序列的两端。
通过RACE技术，研究人员可以对未知基因的序列进行扩增和鉴定，从而了解该基因的结构和功能。
RACE技术主要包含两个步骤：首先是逆转录，将RNA转录为cDNA，然后是扩增，利用特定的引物扩增未知序列。
下面将详细介绍RACE技术的步骤和操作方法。
实验步骤：1.RNA提取：首先需要从组织或细胞中提取RNA。
可以使用常见的RNA提取试剂盒，按照厂家提供的操作指南进行操作。
2.逆转录：使用逆转录酶将RNA转录为cDNA。
逆转录可以选择两种方法：随机引物逆转录和基因特异引物逆转录。
-随机引物逆转录：在反应体系中添加随机引物，以确保逆转录反应能逆转录所有RNA分子。
将RNA与随机引物一起孵育，使得引物能够与RNA序列互相结合，并成为逆转录反应的起始点。
逆转录反应通常在37-42°C进行，持续1-2小时。
-基因特异引物逆转录：如果已知目标基因的部分序列，可以使用基因特异引物逆转录。
在逆转录反应系统中添加特异引物，使其与目标基因序列互补结合。
该方法提高了逆转录的特异性，从而只逆转录目标基因。
3.RACE扩增：使用扩增反应将目标序列扩增出来。
扩增过程通常使用PCR技术。
-5'RACE：首先进行5'RACE，即扩增未知基因序列的5'端。
为了扩增未知基因的5'端，需要将cDNA的3'端进行特定的修饰，以便进行扩增。
修饰通常包括尾修饰和连接转录片段引物。
然后使用尾修饰的cDNA和一个基因特异引物进行PCR扩增。
PCR反应条件根据实际情况进行优化，反应体系中应包括模板cDNA、引物、dNTPs和热稳定DNA聚合酶等。
- 3' RACE：进行3' RACE，即扩增未知序列的3'端。
在逆转录反应中添加一段poly(A)尾修饰，将逆转录产物转录为cDNA。
5-RACE经验汇总
5 Race(2007-11-18 21:37:08)转载▼分类：核酸技术如果您顺的话，一个礼拜足矣！同意，5'-RACE确实比较难，但也有顺利的时候，我上周做5'-RACE也一次就成功了，我觉得关键还是RNA 的质量，如果RNA模板质量不好，后面做得再认真也是白费！当时要克隆基因的5'GC含量达到了80%，一般的反转录酶和PCR都拿不到，后来加了海藻糖60度反转录一个小时后，用TaKaRa的GC-Buffer和LA-Taq才扩出来，当时就为了这个5端，很是费了力气。
如果RCR产物不是很特异或没有目的条带的话，建议用nest PCR。
在做5‘时，对RNA要求比较高，最好用新鲜的组织提，随即做逆转录，扩增。
做RACE PCR条带单一的不多，尽可能的回收与目的片段大小相近的条带。
克隆的时候，一般kit上建议挑8-10个克隆，多一个，多一份希望，因为RACE，尤其是5’太难了，我作了约6个月。
偶没有买试剂盒，自己合成了3条引物，买了反转录酶。
然后一次就出来了。
RACE的盒子最常用的是CLONTECH和INVITROGEN的，这个方法我也试过很多次了，方法很简单，但是作出来效果非常的不理想。
PCR出来的东西都是杂七杂八的东西，更多的时候是弥散的条带。
SmartRace 既然称之为Smart，因为它的引物能特异的识别5'端帽子位点，因此排除了所有非完全的逆转录。
再加上使用基因特异性引物，使其做出来的可能性更大。
这个方法省钱，但是我不是很看好，祝好运。
另，建议你不要用oligodT进行逆转录，在基因mRNA300bp处设计一条或几条基因特异性逆转录引物更好。
希望你能有好结果。
我刚做过5’、3‘ RACE，我个人的经验如下：1、首先，提的RNA必须完整，最好跑个RNA电泳来验证一下；2、设计引物时要注意：Tm最好大于70度，两引物间要有100-200bp的重叠区；3、用巢氏PCR相对容易出结果；4、如果出现多个条带，要分别验证；5、PCR过程中，我一般分两次，第一次用touchdowm PCR，后产物稀释50倍，作二次，72度尽量长一点，我们一般用2-3min；6、结果分析，最好是重叠区吻合，否则，应重新做。
RACE引物设计原则
RACE引物设计原则用于RACE引物设计的原则引物设计的优劣对于做RACE是至关重要的，如果引物的特异性不好，就会给实验带来许多麻烦，甚至扩增不到我们这实验预期想的目的产物。
以下是结合一些网上的资料和我们在多次实验中总结出的引物设计的原则。
兼并引物的设计用兼并引物扩增，一般是我们想克隆的物种中没有我们想要克隆的目的基因的信息，但在其它物种中是存在的，我们就可以将其它物种该基因的序列进行序列同源性比较，同源性高的区域就是兼并引物设计的侯选区；或是假如这些基因的核酸序列的同源性不高，没有合适的选择区域，则我们可以用将其它物种该基因的序列翻译成氨基酸序列，然后进行序列同源性比较，同源性高的区域一般是保守区，再用保守区氨基酸对应的核酸序列设计兼并引物，但兼并引物兼并度（即单条引物上各兼并碱基之和的乘积）应小于1000 ，且兼并引物的3’端应尽量减少兼并性，并使3’端最后6个碱基的G或C的含量大于50%，以提高特异性；此外，假如我们只知道氨基酸序列，则可根据不同物种密码子的偏好性来设计引物。
有部分碱基序列的引物设计对于用差异显示(Differential Display Reverse Tranion ,DDRT)或者抑制减法杂交（Suppressive Subtractive Hybridization ，SSH）、RNA指纹、EST芯片及兼并引物扩增等方法得到DNA片断，要克隆全长cDNA，或者用同源序列克隆其他物种中的同源基因，3'端的扩增一般都不成问题，难就难在5'端的片断扩增。
利用SMART技术将SMART引物自动加入cDNA的5'端，不但能避免加接头或者加一串碱基的麻烦，而且能得到全长的cDNA 5'端。
只要少至25个碱基的已知序列即可克隆出全长的cDNA[4]。
如你欲克隆的基因在GenBank已列出的26种生物中，且是多基因家族的一个成员，则应先上网进行BLAST(/BLAST)，为了提高扩增的特异性，应选择没有同源性的区域设计引物。
race扩增原理
race扩增原理Race扩增原理Race扩增是一种常用的基因扩增技术，广泛应用于分子生物学、遗传学和生物医学研究领域。
它是通过DNA聚合酶在模板DNA上的连续合成过程，使得DNA片段在特定的温度条件下反复复制，从而实现DNA的扩增。
Race扩增是基于聚合酶链反应（PCR）技术的改进，PCR是一种通过酶催化链式反应来扩增特定DNA片段的方法。
而Race扩增则是针对某个已知DNA片段的末端序列未知的情况下，通过一系列特定的引物设计和PCR反应来扩增该DNA片段的未知序列，从而获得该DNA片段的完整序列。
Race扩增的基本原理是利用已知序列的引物和一系列特定的引物设计来扩增目标DNA片段的未知序列。
其步骤如下：1. 通过已知序列设计外向引物（3'末端向外）和反向引物（5'末端向外），并合成引物。
2. 利用外向引物进行PCR扩增，得到目标DNA片段的一个部分序列。
3. 通过已得到的部分序列设计内向引物（在已知序列的3'末端内部），并合成引物。
4. 利用内向引物进行PCR扩增，得到目标DNA片段的另一个部分序列。
5. 通过已得到的两个部分序列设计新的外向引物和反向引物，继续PCR扩增，直到得到目标DNA片段的完整序列。
Race扩增的关键在于引物设计。
对于未知序列的DNA片段，可以通过已知序列的末端部分设计引物，从而扩增未知序列。
由于PCR 反应的高度特异性，只有与引物序列完全匹配的DNA片段才能被扩增，因此引物的设计必须准确。
Race扩增还可以结合其他技术来增加扩增效率和准确性。
例如，可以利用聚合酶链反应实验中的链延伸反应（anchored PCR）来进行Race扩增，通过在反向引物的3'末端添加一个特定的序列，从而增加PCR的特异性和扩增效率。
此外，还可以利用引物的嵌合反应（nested PCR）来进行Race扩增，通过两对引物的连续扩增，进一步提高PCR的特异性和扩增效率。
race方法
race方法Race方法是一种常用的研究方法，可以用于探索不同种族之间的差异和相似之处。
这种方法在社会科学、医学、心理学等领域得到广泛应用。
我们需要明确race方法的定义。
Race方法是一种研究方法，通过比较不同种族之间的特征和行为来揭示种族间的差异和相似之处。
它通常使用定量和定性的研究方法，如问卷调查、实验研究、观察研究等，来收集和分析数据。
在社会科学领域，race方法被广泛用于研究种族间的社会经济差距、教育机会不平等、就业歧视等社会问题。
通过分析不同种族之间的收入、教育程度、职业选择等指标，可以揭示不同种族在社会经济方面的差异。
同时，race方法也可以帮助我们了解种族与社会地位、社会认同等因素之间的关系。
在医学领域，race方法被用于研究不同种族之间的健康差异和疾病风险。
研究发现，不同种族在患某些疾病的风险上存在差异，如高血压、糖尿病等。
通过race方法，研究人员可以探索不同种族之间的遗传、环境和行为因素对疾病风险的影响，从而为预防和治疗提供指导。
在心理学领域，race方法被应用于研究种族与个体心理健康、认知能力等之间的关系。
研究发现，种族对个体的心理健康和认知能力有一定影响。
通过race方法，研究人员可以探索不同种族之间的心理特征、心理压力和应对方式等因素，进而为心理健康干预和治疗提供依据。
当然，race方法也存在一些限制和争议。
首先，种族并不是一个精确的科学概念，种族之间的差异往往是多维度的，包括遗传、文化、社会经济等因素的综合影响。
其次，race方法在研究中可能存在样本偏见和测量问题，需要慎重解读研究结果。
此外，race方法也容易引发种族主义和歧视的风险，需要研究人员在设计和执行研究时充分考虑伦理和道德问题。
race方法是一种重要的研究方法，可以帮助我们了解不同种族之间的差异和相似之处。
它在社会科学、医学、心理学等领域的应用为我们提供了丰富的研究成果，同时也需要我们在使用时注意其局限性和潜在的风险。
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5'race 现在的通用方法是根据CLONTECH SMART RACE kit 改进而来的方法
那个试剂盒很坑爹的，价格高的离谱。
其实在实验过程中完全没有必要买试剂盒，下面我来告诉你怎么玩。
原理：5'race的关键目的就是要克隆出已知片段上游的未知片段。
方法就是在反转录的过程中人为的在5'端加上接头，然后利用接头上面的特异序列作为引物和你已知序列上面的一段引物扩增cDNA片段，就能得到5'未知序列片段。
方法：在反转录的过程中加入5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG–3'
这个接头引物。
在反转录之后这段序列就会位于整个mRNA反转录出来的cDNA的最前端。
为什么？？
MMLV反转录酶有一种特性就是在反转录到序列末端的时候加上三个C来终止这个反转录过程，利用这添加上去的CCC和上面给你的那个接头引物的GGG碱基配对，MMLV就会以上面那个引物为模版将反转录出来的第一链继续延伸出接头引物的互补链，从而形成一个带接头的cDNA 5'-末端。
这个就是RACE的核心原理。
具体不明白的看看这篇说明书就好，GOOGLE一搜，结果满天飞的，我就不给你传文件了。
SMART™ RACE cDNA Amplification Kit User Manual
你肯定有一下问题
1.上面给你的那个接头引物能不能换掉。
上面那个引物看起来好像很普通，其实里面大有玄机，如果你用DNAMAN软件预测一下引物的二级结构就可以发现，这个引物自身能形成一个类似老虎钳子的形状，而且仅仅只有GGG三个核苷酸暴露在外面用来和MMLV添加出来CCC配对。
所以这个引物的设计是非常巧妙的。
不建议你更换，而且你换掉以后自己要在你实验动物的基因组中验证是否存在相同或互补序列，这也是另一个问题。
2.是不是用普通的方法合成该接头引物即可。
答曰，可以。
clontech公司提供的试剂盒里面的这段引物其实并非全是单链DNA，用于配对的那关键的GGG用的是RNA单链，为什么？原因是DNA-RNA的结合能力强于DNA-DNA。
明白了把，所以那个用来坑中国人钱的试剂盒提供的引物是很容易降解的，一旦那三个G降解掉了，好了，这8K+盒子就报销了。
值得庆幸的是用全DNA引物是完全能满足RACE需求的。
所以，随便找个单位合成一下这引物就可以了。
3.是不是所有的反转录酶都可以
答曰，不是。
RACE的核心技术就是MMLV延伸的CCC。
别的酶不具有这种特性。
4.其他方法
其他方法有很多，例如传统的方法，那种利用5'帽子结构筛选完整mRNA然后去帽子加接头的方法肯定是最好的。
因为严格的说只有这种方法做出来的才真正称得上是准确的RACE。
但是，同学，这方法麻烦，而且，价格不菲。
这个贵是很有道理的，里面那么多种酶呀…………
5.实验要求
RNA的质量一定要好，越少的末端降解你得到的5'RACE结果就是越准确的。
6.中间已知序列特异性引物的设计，这个很容易，用primer 5 在已知序列里面随便挑一个分数高点的一般就行，实在不放心的话可以和接头引物配下对，看看有无引物二聚体，根据经验，一般没有。
3-RACE相对来说要好做的多，以前我也用宝生物的试剂盒，没出过问题。
但现在都是直接合成引物，反转录后直接扩增，现在告诉楼主一种新方法：
QT：CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGCTTTTTTTTTT TTTTTTT
Q0：CCAGTGAGCAGAGTGACG
Q1：GAGGACTCGAGCTCAAGC
因为RNA的3末端加有polyA尾巴，，用上面加一通用引物的QT引物做反转录，也即取代之前的Oligo dT，得到的cDNA除了有poly(T)外，还有两个通用引物，然后用Q0作外向PCR，Q1做内向PCR，上游引物用你的基因特异性引物就行了。
SMART 5′-RACE的原理是先是利用mRNA的3′末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo(dT)18MN作为锚定引物在反转录酶
M-MLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA。
利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5′末端时自动加上3一5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)
通用接头引物（例如5’ AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGC GGG3’）配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头。
然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM（Universal Primer）（例如5’ AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 3’）作为上游引物，用一个基因特异引物2（Gene Specific Primer 2，GSP2）作为下游引物，以SMART 第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5′末端的cDNA片
段扩增出来。
最终，从2个有相互重叠序列的3′ / 5′-RACE产物中获得全长cDNA，或者通过分析RACE产物的3′和5′端序列，合成相应引物扩增出全长cDNA。