一种简易的制备和纯化质粒DNA的方法
质粒DNA的提取和纯化实验报告
质粒DNA的提取和纯化实验报告实验一、质粒DNA的提取和纯化一、实验目的：1、学习并掌握碱裂解法小量制备质粒DNA的方法。
2、初步了解DNA纯化的原理。
二、实验原理1、细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
2、质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。
目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。
3、碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
4、纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。
对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
三、实验步骤1、挑取单菌落接种到含Amp的LB液体培养基试管内（3.5ml/管）2、将试管放入恒温震荡培养箱中，37℃，200r/min培养12-16h。
3、将菌落转入1.5ml离心管中（尽量倒满）1200r/min，离心30s（沉淀菌体）4、重复一次第三步的过程5、弃掉上清液并扣干，加入预冷的Solution1 100微升，剧烈震荡打散菌体6、加入新配置的Solution2 200微升，温和颠倒试管6-7次混匀，室温放置5min，使液体由浑浊变为透明粘稠7、加入预冷的Solution3 150微升，温和颠倒离心管2-3次，震荡7-8次，之后在1200r/min离心7min8、小心将含有质粒DNA的上清液转移到另一离心管中（400-500微升）9、加等体积的氯仿，轻微震荡，1200r/min，离心2min,之后将上清液转移至另一离心管10、加入2倍体积冰冷无水乙醇，轻轻颠倒离心管混匀，室温放置2min，1200r/min 下离心10min11、弃上清，加入70%乙醇洗涤沉淀，12000r/min，离心2min，弃上清12、弃上清，液体尽量倒净，并在吸水纸上扣干，室温静置15min干燥13、加入1*TE 40微升溶解质粒，用于定量分析、电泳检测等实验二、DNA琼脂糖凝胶电泳一、实验目的1、学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术2、掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。
质粒DNA的提取和纯化
质粒DNA的提取和纯化一、实验目的掌握碱法小量提取质粒DNA。
二、实验内容质粒DNA的小量提取。
三、实验原理所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤：培养细菌扩增质粒；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。
将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，将质粒DNA释放到上清液中。
碱性溶剂使碱基配对完全被破坏，闭环质粒DNA双链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。
当pH值恢复到中性时，重新形成完全天然地超螺旋结构。
在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，与PDS一起沉淀。
离心除去变性剂，从上清液中回收复性的质粒DNA。
四、实验方法与步骤㈠细菌培养和收集将带有pUC19质粒的大肠杆菌接种在LB固体培养基（含100μg/ml Amp）中，37℃培养12～24小时。
在超净工作台中用无菌的牙签挑取平板培养基上的单菌落接种到25ml LB液体培养基（含100μg/ml Amp）中，37℃振荡培养（220rpm）约18小时至对数生长后期（OD600=0.6）。
㈡碱法小量提取质粒DNA1、将菌液倒入1.5ml的微量离心管中，于4℃12000rpm离心30秒，弃去上清液，将剩余的培养物贮存于4℃。
重复3次，以得到较多的细菌沉淀（视具体情况而定）。
2、将微量离心管开口倒置在卫生纸上，使离心管底部的液体流尽。
3、加入100μl用冰预冷的溶液I，在涡旋振荡器上剧烈振荡，将沉淀彻底悬浮，然后室温放置5分钟。
4、加入200μl现配的溶液II，盖紧管口，轻轻快速颠倒离心管（不要振荡，以避免DNA断裂），使混合物混匀，冰浴2～5分钟。
5、加入150μl预冷的溶液III，盖紧管口，温和颠倒混匀，使粘稠地细菌裂解物均匀地分布于溶液III中，冰浴2～5分钟。
6、4℃,12000rpm离心10分钟。
将上清液转入另一只1.5ml离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，室温放置10分钟。
质粒DNA提取及纯化
质粒DNA 提取纯化、DNA 电泳检测实验目的1．掌握质粒DNA 的制备的原理和方法2．了解质粒琼脂糖凝胶电泳分离二、实验原理1．质粒DNA 的制备方法质粒(Plasmid) 是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA 分子，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。
细菌质粒大小介于1～200Kb 之间，是应用最多的质粒类群，在细菌细胞内它们利用宿主细胞的复制机构合成质粒自身的DNA 。
质粒DNA 的制备包括3 个步骤：①培养细菌，使质粒DNA 大量扩增；②收集和裂解细菌；③分离和纯化质粒DNA 。
主要方法包括：碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS ；煮沸裂解法：沸水煮沸40 秒；SDS 裂解法：10%SDS ，一般用于质粒大量提取。
在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA 的用途进行选择。
本实验选择碱裂解法提取质粒DNA 。
2．碱裂解法质粒DNA 具特定的形态结构，在特殊的环境条件下，如加热、极端pH 值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等会导致质粒DNA 变性，去除变性条件又可以使DNA 复性。
碱裂解法根据共价闭合环状质粒DNA 和线性染色体DNA 在拓扑学上的差异来分离质粒DNA 。
SDS 是一种阴离子表面活性剂，它既能裂解细菌细胞，又能使细菌蛋白质变性。
SDS 处理细菌细胞后会导致细菌细胞壁破裂，从而使质粒DNA 及细菌基因组DNA 从细胞中同时释放出来。
细菌环状基因组DNA 在操作过程中会断裂成线状DNA 分子，在pH 值介于12.0 ～12.5 这个狭窄的范围内，线性的DNA 双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA 的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕结合在一起。
当加入pH4.8 乙酸钾缓冲液时，pH 恢复至中性，因为共价闭合环状的质粒DNA 的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA 的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们相互缠绕形成不溶性网状结构，而复性的质粒DNA 恢复原来构型，保持可溶性状态。
质粒提取原理和方法
质粒提取原理和方法质粒提取是从细菌基因组中提取出质粒DNA的一种方法。
它是分子生物学和遗传工程中常用的技术，可用于质粒的纯化和制备。
质粒提取的原理主要基于以下几个步骤：1.细菌培养：首先，我们需要将含有目标质粒的细菌培养在适当的培养基上，通过高速离心将细菌收集起来。
2.细菌溶解：将培养物进行离心，分离菌落。
然后采用一定的细胞破碎方法，如超声波震荡、冻融等，将细菌细胞壁破坏，使质粒DNA释放到溶液中。
3.质粒分离：通过离心将细菌碎片、蛋白质等杂质与质粒DNA分离。
一般是通过两次离心来完成，第一次较低速离心用于去除细菌碎片和细胞蛋白质，第二次较高速离心用于沉淀质粒DNA。
4.DNA纯化：将质粒DNA从上一步得到的沉淀物中提取出来。
可以使用酚/氯仿法、硅胶柱法、商用试剂盒等方法进行纯化。
其中酚/氯仿法是较为常用的方法，它可以将DNA溶于水相，而蛋白质和其他的污染物则溶于有机相。
5.DNA沉淀：将纯化得到的DNA溶液加入适量的酒精沉淀剂（如乙醇或异丙醇），再次进行高速离心，使DNA沉淀到离心管底部。
6.DNA洗涤：将离心管底部形成的DNA沉淀用70%乙醇洗涤，去除酒精沉淀剂和其他杂质。
然后用空气吹干，最后用一定体积的纯水或缓冲液溶解。
质粒提取的方法根据实验需求不同和实验室条件的不同可以有所差异，常用的方法有以下几种：1.酚/氯仿法：这是一种经典的DNA提取方法，它将质粒DNA溶于三氯甲烷和酚的混合物中，蛋白质和其他污染物则溶于酚相。
离心去除酚相，再用异丙醇沉淀DNA，最后用70%乙醇洗涤。
2.硅胶柱法：这是一种基于硅胶柱的离心柱技术，可用于高通量的质粒提取。
DNA样品在硅胶柱中被结合，杂质被洗掉，最后用纯水或缓冲液洗提质粒DNA。
3.磁珠法：这是一种基于磁性珠子的质粒提取方法，通过在磁性珠子表面修饰DNA结合物，使质粒DNA与磁性珠子结合。
通过外加磁场将磁性珠子与DNA一起沉淀，然后去除上清液，最后用纯水洗提DNA。
质粒DNA的提取、纯化及验证
质粒DNA的提取、纯化及验证姓名：肖风学号：2 2010级生物工程一、【实验目的】1、掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用，掌握碱变性法提取质粒DNA 的方法。
2、掌握质粒DNA的纯化方法，即用酚、氯仿抽提法除去质粒中的蛋白质。
3、学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理，凝胶的制备及电泳方法及凝胶中DNA的分离纯化方法。
二、【实验原理】1、碱变性提取法提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB一氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。
其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。
该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。
提取的质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。
碱变性提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。
在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。
细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。
在pH值高达12．0的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。
当用pH值4．6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质一SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。
这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。
溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。
由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。
质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚／氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。
质粒dna的提取方法
质粒dna的提取方法质粒DNA提取是分子生物学实验中非常常见的操作，用于从细菌中提取质粒DNA进行后续的实验分析。
下面我将介绍一种常用的质粒DNA提取方法——碱裂解法（alkaline lysis method），该方法简单、快速、成本低且适用于大规模提取。
实验原理：碱裂解法是利用碱性溶液来破坏细菌细胞壁和细胞膜，释放出其中的质粒DNA。
在碱性条件下，细菌细胞壁和细胞膜会被溶解，质粒DNA则在此过程中被保护在碱性溶液中。
接着，通过中和和沉淀步骤，可从碱性溶液中纯化出质粒DNA。
实验步骤：1. 首先，从含有目标质粒的细菌培养物中制备菌液。
将培养物转移到离心管中，以12000 rpm离心10分钟。
2. 弃去上清液，将菌体沉淀重悬于缓冲液中。
缓冲液的配制：用10 mM Tris-HCl缓冲溶液溶解10 mM EDTA（pH 8.0），并加入0.1 mg/mL的蛋白酶K。
3. 加入缓冲液至菌体重悬菌液中，混匀。
4. 加入等量的0.2 M NaOH-1% SDS（含SDS版本）或0.2 M NaOH-0.5% SDS （不含SDS版本），轻轻翻转混匀。
5. 在室温下孵育5-10分钟，将混合物中的碱裂解酶活化。
6. 加入等体积的3 M醋酸钠（pH 5.5）以中和混合物。
7. 在室温下孵育5-10分钟，使沉淀物凝结。
8. 离心上述混合物，12000 rpm，10分钟。
9. 弃去上清液，加入适量的75%乙醇洗涤沉淀。
10. 再次离心，弃去上清液。
11. 干燥质粒DNA沉淀，通常可以在室温下自然干燥，不要使用高温或吹风机等加热工具。
12. 使用适量的Tris-EDTA缓冲液（pH 8.0）溶解质粒DNA沉淀，以得到浓度适宜的质粒DNA溶液。
实验注意事项：1. 在实验操作过程中，尽量避免使用手部直接接触NaOH和SDS，以免引起刺激。
2. 防止质粒DNA受到外源DNA（例如基因组DNA）的污染，可在处理前使用DNase酶或RNase酶处理样品。
小量大肠杆菌质粒DNA的提取和纯化
10
实验方法
9. 将收集管中的废液倒掉，加入600ulPW液，12000rpm， 离心1min 。 10. 将收集管中废液倒掉，将柱子放入收集管中空转 2min。
11. 将柱子转移到一个新的1.5mlEP管中，静臵2min,等 待乙醇挥发完全。
12. 在 柱 子 中 加 入 5 0 u l 预 热 的 E B 溶 液 ； 静 臵 2 m i n ， 12000rpm离心2min，得到的溶液即是提取的质粒DNA。 13. DNA产物应保存在-20℃。
质粒DNA的提取
小量大肠杆菌质粒DNA的提取和纯化 ——碱变性法
2
实验目的
• 学习提取基因工程中的运载基因的载体DNA的原
理；
• 掌握最常用的提取和纯化质粒DNA的方法； • 学会操作和使用离心机。
3
质粒DNA
• 质粒(Plasmid)主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，是一
种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭 环的DNA分子,以超螺旋状态存在于宿主细胞中。 贝数,并表达所携带的遗传信息。
9
•
实验方法
5. 往4中溶液加250ul溶液p2，轻轻上下颠倒6-8次使之混匀 至澄清。（千万不要剧烈振荡，以防基因组DNA污染，不 能超过5分钟）。P2：NaOH; SDS。 6. 往5中溶液加350ul溶液p3，立即轻轻颠倒6-8次，使溶液 中产生尽量多的白色沉淀；12000rpm，离心10min。（P3 加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀；千万不要剧烈 振荡，以防基因组DNA污染 ）。P3：KAc。 7. 小心吸上清，转入柱子中。静臵2min， 12000rpm，离心 1min。（如果上清中还有微小颗粒，可再次离心） 8. 将收集管中的废液倒掉，加入600ulPW液，12000rpm，离 心1min。
小量提取质粒DNA的简易方法
小量提取质粒DNA的简易方法——酶切验证连接结果适用
1．摇好的菌液6000g离心30s
2．弃上清，将离心管倒置于吸水纸上吸干多余水分。
3．加入250微升STET（STET:Lysozyme=10:1 V/V），震荡重悬。
4．置于100°中煮沸1~1.5 min（视菌体量而定），17000g离心5 min。
5．将上清转移至一个新的离心管中。
6．加入250微升异丙醇，颠倒混匀后，17000g离心5 min。
7．去上清，倒置于吸水纸上10 min左右（无明显异丙醇气味即可）。
8．加入TE（TE：RNase=1000:1 V/V）20~50微升（视沉淀量而定）。
9．直接取1微升进行酶切。
电泳等后续步骤略。
试剂配制
1.STET:
10 mM Tris-Hcl (pH8.0) 5 ml
1 mM EDTA (pH8.0) 1 ml
Nacl 2.93g
5% Triton X-100 25 ml
加超纯水定容至500 ml。
配置好后，4°保存，用前加溶菌酶。
2.溶菌酶（10 mg/ml）
1 M Tris-HCl (pH8.0) 100 微升
溶菌酶 0.1g
加超纯水至10 ml，混匀，分装后保存于-20°。
3.RNaseA （10mg/ml）
RNase A 0.1g
3M NaAC (pH5.2) 33微升
加超纯水至9ml，100° 15min，冷却至室温后加入1M Tris-HCl （pH7.4）1 ml，分装-20°保存。
质粒dna提取方法
质粒dna提取方法质粒DNA提取是一种常见的实验操作，主要目的是从细菌中提取质粒DNA，以进行后续实验操作，比如质粒转化、质粒测序等。
下面将详细介绍质粒DNA 提取的步骤及方法。
质粒DNA提取的步骤：1. 细菌培养：选择适当的培养基，将所需的细菌接种培养。
培养时间可以根据需要而定，一般为12-18小时。
2. 细菌收获：培养至合适的细菌株数量后，通过离心将菌体沉淀下来。
取出超上清液，保留细菌沉淀。
3. 打断细菌细胞：将细菌沉淀用适当的缓冲液悬浮均匀，加入裂解酶及改性蛋白酶K等酶，使细菌细胞壁及细胞膜打断。
4. 裂解细胞膜：加入裂解液，如碱性SDS溶液或绝对醇等，使细胞膜破裂。
5. 分离细胞核酸：通过盐析法或有机溶剂法，将细胞核酸与其他杂质分离开来。
6. 质粒DNA纯化：使用离心管柱或硅胶膜柱等纯化方法，将纯化后的质粒DNA 获取。
7. DNA沉淀：用乙醇沉淀纯化后的质粒DNA，并通过离心去除沉淀液。
8. 质粒DNA溶解：用适当的缓冲液溶解提取的质粒DNA，并进行质量分析和浓度测试。
以上是一般常用的质粒DNA提取步骤，下面将介绍几种常见的质粒DNA提取方法：1. 碱裂解法（Alkaline lysis）：使用碱性溶液裂解细菌细胞，破坏细胞壁以释放质粒DNA。
该方法简单快速，适用于提取小规模的质粒DNA。
缺点是提取的质粒DNA纯度较低。
2. 硅胶膜柱法（Silica membrane column）：将裂解后的细胞溶液加载到硅胶膜柱上，通过离心和洗涤步骤去除杂质，然后将纯化的质粒DNA洗脱。
该方法纯化效果好，适用于提取高品质的质粒DNA。
3. 盐析法（Salt precipitation）：通过加入高盐溶液使丙酮沉淀蛋白质，并用乙醇沉淀质粒DNA。
该方法适用于大规模质粒DNA提取，但质量稍逊于硅胶膜柱法。
4. 酚-氯仿法（Phenol-chloroform extraction）：将细菌溶解液加入含酚和氯仿的混合溶液中，破坏细菌细胞膜，并使DNA降解酶失去活性。
实验十一 质粒DNA的提取与纯化
实验十一质粒DNA的提取与纯化一、实验目的与原理质粒多为一些双链、环状的DNA分子，是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。
质粒是进行分子生物学实验操作，进行遗传工程改良物种等工作时最主要的DNA载体。
提取质粒的基本步骤分为三步：①细菌的培养和质粒的扩增，②细菌菌体的裂解，③质粒DNA的纯化。
本实验采取的菌体裂解方法为碱解法，质粒纯化方法为梯度离心法。
二、材料与试剂1、材料：大肠杆菌2、仪器：超净工作台，培养箱，摇床，恒温水浴锅，台式离心机，取液器一套，低温冰箱，冷冻真空干燥机，电泳仪，水平电泳槽，紫外观测仪3、试剂：Solution I 25 mM Tris-Hcl(pH7.4)10 mM EDTA(pH8.0)50 mM葡萄糖高压灭菌，4℃保存Solution II 0.2 M NaOH, 1%SDS 现配现用Solution III 5 N KAc pH4.8高压灭菌，4℃保存3 M NaAc PH5.2, 高压灭菌，4℃保存。
异丙醇，溶菌酶（8 mg/ml），酚/氯仿，无水乙醇，70％乙醇，LB培养基，电泳试剂三、操作步骤1、细菌繁殖LB培养基，2 ml/20ml，37℃，200rpm，摇一摇，过夜2、离心10 min，5000 rpm, 4℃；弃上淸液3、沉淀（菌体细胞）预冷的TES缓冲液洗涤，离心10 min，5000 rpm, 4℃加入预冷的1 ml Solution I，冰浴，10 min4、重新悬浮，加入150 ul溶菌酶母液，室温放置5 min5、加入1.2 ml Solution II, 冰浴，5 min6、加入0.9 ml预冷乙酸钾，混匀，离心10 min，12000 rpm, 4℃7、加入1.5 ml异丙醇，-20℃冰箱内放置15 min8、离心10 min，12000 rpm, 4℃9、取沉淀，悬于400 ul TE缓冲液中10、加入40 ul，3 M NaAc11、酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀12、离心10 min，12000 rpm, 4℃13、取沉淀，冷冻干燥，再悬浮于50 ul TE缓冲液中。
磁珠法质粒dna快速提取试剂
磁珠法质粒dna快速提取试剂磁珠法质粒DNA快速提取试剂是一种用于从细菌培养物中快速、高效提取质粒DNA的试剂。
质粒DNA是细菌中存在的一种环状DNA分子，通常含有一些特定基因的编码序列，可以用于基因工程研究中的基因克隆、蛋白表达等实验。
磁珠法质粒DNA快速提取试剂采用了磁珠吸附技术，能够快速、高效地将目标质粒DNA纯化出来，提供了一个方便、可靠的质粒DNA提取方法。
磁珠法质粒DNA快速提取试剂的原理是基于磁珠的生物非特异性结合作用。
磁珠是一种带有特定功能团的微米级磁性颗粒，经过特殊处理后，可以与靶物质（如DNA、蛋白等）的特定结构或配体发生有效的结合。
在磁场的作用下，磁珠与靶物质结合形成复合物，然后通过磁力的作用，将复合物沉淀到底部或侧壁上，从而实现目标物质的快速分离和富集。
磁珠法质粒DNA快速提取试剂的操作简单、方便。
通常包括以下几个步骤：第一步，细菌培养。
将质粒DNA感兴趣的宿主菌株进行培养，通常使用平板法或液体培养法。
第二步，细胞破碎。
将培养得到的细菌样品进行离心收集，然后使用磁珠法质粒DNA快速提取试剂中的细胞破碎缓冲液快速破碎细胞释放目标质粒DNA。
第三步，DNA结合。
将磁珠颗粒加入到破碎的混合物中，与质粒DNA结合形成复合物。
磁珠与质粒DNA的结合是非特异性结合，因此不受质粒DNA的长度、GC含量以及其他杂质的影响。
第四步，洗涤。
用磁珠法质粒DNA快速提取试剂中的洗涤缓冲液反复洗涤复合物，去除杂质和非特异性结合物。
第五步，洗脱。
使用低盐缓冲溶液洗脱目标质粒DNA，并且保持其完整性和纯度。
通过以上几个步骤，磁珠法质粒DNA快速提取试剂可以从细菌培养物中快速、高效地提取出质粒DNA。
相比传统的提取方法，磁珠法具有操作简单、提取效率高、结果稳定等优点。
此外，由于磁珠法不需要使用有机溶剂，因此对环境和操作人员的安全性更高。
总之，磁珠法质粒DNA快速提取试剂是一种便捷、高效的质粒DNA 提取方法，适用于基因工程和分子生物学领域的实验。
一种质粒DNA的制备方法[发明专利]
![一种质粒DNA的制备方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/7375840a524de518974b7d9d.png)
专利名称：一种质粒DNA的制备方法专利类型：发明专利
发明人：刘铮
申请号：CN201410435796.3
申请日：20140831
公开号：CN105368813A
公开日：
20160302
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：一种质粒DNA的制备方法属于DNA的制备方法技术领域，尤其涉及一种质粒DNA的制备方法。
本发明提供一种纯度高的质粒DNA的制备方法。
本发明包括以下步骤。
1)挑取含有质粒的单菌落接种到具有相应抗性的LB培养基中,振荡培养过夜.取过夜培养的菌液,接种到具有相应抗性
的LB培养基中,振荡培养；2)转移菌液至离心瓶中,离心,去上清；3)将细菌沉淀重悬溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀；4）加溶液Ⅱ，将离心瓶温和颠倒数次混匀，并将离心瓶放置于冰上，使细菌裂解；5）加入预冷的溶液Ⅲ，将离心瓶温和颠倒数次混匀，在冰上放置；离心10min。
申请人：刘铮
地址：110168 辽宁省沈阳市浑南新区浑南中路19号陆军总院分院东侧正大江南水乡6#761国籍：CN
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质粒dna的纯化原理
质粒dna的纯化原理
质粒DNA的纯化是通过一系列的实验步骤来获得高纯度的DNA样本。
以下是一种常用的质粒DNA纯化方案：
1. 细菌培养：将含有目标质粒DNA的细菌菌落接种到富含营
养物的培养基中，使其迅速生长扩增。
2. 细菌菌体裂解：通过使用裂解缓冲液，细菌菌体进行裂解，释放出内含的DNA分子。
3. 蛋白质去除：使用蛋白酶进行消化，去除细菌细胞的蛋白质。
4. DNA的沉淀：将DNA溶液加入含有盐和酒精的缓冲液中，使DNA分子形成沉淀。
5. 洗涤：用酒精溶液来洗涤DNA沉淀，去除杂质。
6. 干燥：通过将DNA溶液置于V型试管中，用离心机将溶液
中的酒精去除，进一步浓缩DNA。
7. 溶解：将干燥的DNA沉淀溶解在合适的缓冲液中，使其重
新溶解为溶液。
以上是一种常用的质粒DNA纯化方案，通过这些步骤可以得
到高纯度的质粒DNA样本，用于进一步的实验研究或应用。
质粒DNA的 小量制备与纯化
三、原理
质粒：是染色体以外能自主复制的双链、 闭合、环状DNA分子。
存在部位：广泛存在于细菌中，在一些动、 植物细胞中也发现有质粒存在。
质粒是基因工程中最常用的载体，作 为载体的质粒必须具备以下 六个特点：
① 能自主复制； ② 具有一种或多种限制性内切酶的 单一切割位点，并且在位点中插入外源 基因后，不影响其复制功能； ③ 具有1-2个筛选标记； ④ 分子量小，多拷贝，易于操作； ⑤ 是非接合性质粒，即不含有结合 转移基因，在自然条件下不能从一个细 胞转移到另一个细胞中去； ⑥转化效率高。
溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液（ KAc 和冰醋 酸），pH 4.8。
作用：酸液，中和NaOH，使质粒DNA、 小分子RNA复性（可溶），染色体 DNA、高分子量RNA、K+/SDS/蛋 白质/膜复合物不能复性而沉淀。 注意：此时溶液出现大量絮状沉淀。
5.7 15,000rpm 离心5分钟，将上清400ul
3 质粒的分离和纯化
在反应体系中加入酸性溶液使裂解 液的PH值 恢复到中性，此时，小分子 质粒DNA迅速复性为可溶性质粒DNA， 小分子RNA亦为可溶状态，而变性的染 色体DNA、高分子量RNA以及K+/SDS/ 蛋白质/膜复合物则在0℃孵育时形成沉 淀，经离心可去除。
然后，再采用酚、氯仿等蛋白质变 性剂抽提去除残留蛋白质，用RNase去 除残留RNA，即可得到质粒的粗制品。 以后，可用超速离心法、电泳法、离子 交换层析法或排阻层析法等进一步纯化 质粒。
裂解细菌的方法：SDS法、碱裂解法、煮沸法
它们各有利弊，应根据所提质粒的 性质、宿主菌的特性及纯化质粒的方法 等因素加以选择。
本实验采用碱裂解法:
（1）用EDTA破坏细菌的细胞壁和细胞 外膜； （2）用SDS使细胞裂解，与此同时用 NaOH提高溶液的PH值，破坏碱基配对， 使染色体DNA变性成为单链DNA，但闭 环状的质粒DNA因处于缠绕状态而不能 彼此分开。
质粒DNA的碱裂解法提取与纯化
质粒DNA的碱裂解法提取与纯化（撰弄人：newdragon）1 原理碱法应用最广，不失为一种有效的经典方式。
该法利用NaOH及1% SDS混合液作用于细菌悬浮液，将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。
虽然碱性溶剂使碱基配对完全破坏，完备环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，这因为它们在拓扑学上是彼此缠绕的。
只要OH-处置的强度和时间不要太过，当pH值恢复到中性时，DNA 双链就会再次形成。
在裂解进程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA 会彼此缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包盖。
当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。
离心除去变性剂后，就可以够从上清中纯化并回收复性的质粒DNA。
2 试剂准备溶液I：50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH ；高压灭菌后于4℃贮存溶液II：N NaOH / 1% SDS（新鲜配制）；溶液III：，冰乙酸，加蒸馏水至100ml配制；乙醇酚：氯仿：异戌醇（25：24：1，V/V/V）氯仿：异戌醇（24：1，V/V）TE（）含10mg/ml RNase A100ml 3mol/l NaAc: 称取•3H20，溶入90ml重蒸水中，用浓盐酸调pH至,并定容至100ml。
10mg/mlRNase：称取100mgRNase溶入10ml 10mmol/l Tris•Cl ,15mmol/lNaCl中，于100℃加热15min,缓慢冷却至室温，分装后于—20℃3 实验操作3．1 小量制备（1）挑取单菌落，接种到3-5ml含适当抗生素的液体培育基中，37℃，250r/min留宿震荡培育至菌液浑浊（OD600=）。
（2）将菌液倒入微量离心管中，12000g离心6min，倒去培育液。
相同操作再搜集一次菌体，尽可以吸干培育液。
（3）将细菌沉淀重悬于200μl冰预冷的溶液Ｉ中，猛烈振荡，使细菌完全分散，将离心管置于冰上。
质粒DNA的抽提、纯化与检测
Hind Ⅲ
0有插入的目的片段。如 果用EcoRⅠ和Hind Ⅲ同时切割重组质粒（含两个单一酶切 位点），就产生两条带相应酶切位点的线性DNA分子。
使用限制性内酶切的原则
限制酶的热不稳定性，选择合适的条件； 避免反复冻融，保持低温（冰浴）下进行； 酶的用量可参照酶单位的定义确定； 两种以上的酶切割DNA时应选择合适的缓冲液； 酶切反应必须使用无菌离心管及吸头号，避免交叉污染。
心5min，弃上清。 8. 加1mL冰预冷70%乙醇漂洗沉淀，12000rpm离心5min。 9. 弃上清，室温放置5-10min，晾干沉淀。 10. 加20μL含RNase（无DNase）的TE溶解DNA，37℃水浴消化 15-30min以去
除RNA。
步骤5、6中吸取上清液时应避免将交界面的蛋白、染 色体DNA也吸走。
质量的DNA片段在凝胶 中泳动速度不一样，因 而可依据DNA分子的大 小或构型来使其分离。
质粒的三种构型
超螺旋DNA
在细胞内质粒常以共价闭环
（CCC DNA）
的超螺旋形式存在
最快
开环DNA （OC DNA）
线状DNA (L DNA)
如果两条链中有一条的一处或多处 断裂，分子就能发生旋转而消除链
的张力，形成松弛型的环状分子
基本步骤 培养细菌使质粒扩增
收集和裂解细菌 分离、纯化质粒
碱裂解法分离纯化质粒DNA
基本原理：利用质粒DNA与染色质DNA变性与复性的 差异。
当 菌 体 在 NaOH 和 SDS 溶 液 中 裂 解 时 ， 蛋 白 质 与 DNA发生变性；当加入中和液后，质粒DNA分子能够 迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与 染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
一种快速简单的质粒DNA纯化方法
一种快速简单的质粒DNA纯化方法
周天鸿;李月琴
【期刊名称】《微生物学通报》
【年(卷),期】1993(020)001
【摘要】本文介绍一种快速获取高纯度质粒DNA的方法。
本法对煮沸提取法进行改良后,快速提取质粒DNA粗制品,然后用国产滤纸从琼脂糖凝胶中回收纯化质粒DNA。
同时对本法所提取的质粒DNA的回收率、浓度、纯度及可能的用途进行验证和讨论,证明此法简易,所得样品纯度高,可直接用于转化、酶切和基因克隆。
【总页数】3页(P51-52,63)
【作者】周天鸿;李月琴
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】Q93－33
【相关文献】
1.一种简单快速分离纯化小型猪胰岛的方法 [J], 马昭杰;蔡德鸿;张桦;孙嘉;王先宝;陈宏
2.一种改良的纯化质粒DNA方法 [J], 吴斌华;李祥勇;周克元
3.一种快速简单的质粒DNA纯化方法 [J], 王自春;俞萍
4.一种简单快速分离鉴定少量质粒DNA方法 [J], 史步君;邱并生
5.简单快速分离无RNA的大肠杆菌质粒DNA的方法 [J], 赵晓祥;杨志兴
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质粒DNA提取方案
质粒DNA提取方案碱裂解法的原理是利用碱性溶液来打断细菌细胞壁和细胞膜，从而释放质粒DNA。
以下是一种常用的碱裂解法质粒DNA提取方案：材料和试剂：1.细菌培养物（含有质粒的细菌株）2.稀释缓冲液（例如TE缓冲液，pH8.0）3.碱性溶液（例如10%SDS和0.2NNaOH的混合液）4.中和缓冲液（例如3M醋酸和5MNaCl的混合液）5.离心管和离心机6.微量移液器和离心管管盖7.筛网或滤纸（用于分离细菌细胞碎片）步骤：1.将适量的细菌培养物加入离心管中。
2.离心管离心，收集细菌细胞沉淀。
3.弃去上清液。
4.加入适量的稀释缓冲液，悬浮细菌细胞。
5.离心管离心，收集细菌细胞沉淀。
6.弃去上清液。
7.加入适量的碱性溶液，充分混匀。
8.将离心管放入70°C水浴中，孵育5分钟。
9.在离心机中以最大转速离心10分钟，以沉淀细菌细胞碎片。
10.弃去上清液。
11.加入适量的中和缓冲液，充分混匀。
12.在离心机中以最大转速离心10分钟，收集质粒DNA沉淀。
13.弃去上清液。
14.用适量的冷稀释缓冲液溶解质粒DNA沉淀。
15.使用微量移液器将溶解的质粒DNA转移到干净的离心管中。
16.使用筛网或滤纸分离细菌细胞碎片。
17.将离心管盖盖好，储存质粒DNA在-20°C冰箱中。
注意事项：1. 操作过程中尽量保持洁净和细菌污染的最小可能性，并勿让细菌接触到DNase。
2.在所有步骤中尽量避免剧烈振荡和搅拌，以防止DNA的破坏。
3.稀释缓冲液、碱性溶液和中和缓冲液的配方可以根据实验需求进行调整。
以上是一种常用的碱裂解法质粒DNA提取方案，该方法简单可行，适用于实验室中常见的质粒DNA提取需求。
在实际操作过程中，可以根据实验要求和具体样本进行一定的调整和优化。