纳升级反相液相色谱-串联质谱法分析锦灯笼提取物中的蛋白质
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数据 库下 载 于 ｈ ｔ ｔ ｐ： ／ ／ ｗｗｗ． ｎ ｃ ｂ ｉ ． ｎ ｌ ｍ． ｎ ｉ ｈ ． ｇ ｏ ｖ ／
Ｓ ｕ ｒ ｖ ｅ ｙ ｏ ｒ液 相 色 谱 泵 和 Ｌ Ｔ Ｑ 线 性 离 子 阱 质 谱
（ Ｔ ｈ ｅ ｒ ｍｏ — ｅ ｌ ｅ ｃ ｔ ｒ ｏ ｎ Ｆ ｉ ｎ ｎ ｉ ｇ ａ ｎ 公 司 ）组 成 ，Ｍａ ｇ ｉ ｃ
数据 依 赖 模 式 （ ｄ ａ ｔ ａ — ｄ ｅ ｐ ｅ ｎ ｄ ｅ ｎ ｔ ｍｏ ｄ ｅ ） 对 ＭＳ和 ＭＳ ／ ＭＳ进 行 图 谱 采 集 ， 扫描 模式 为全 扫描 （ ｍ／ ｚ ４ ５ ０ ． ０ ０～１ ８ ０ ０ ． Ｏ ０ ） ， 紧接着 进 行 全扫 描 中丰度 最 高
胰 蛋 白酶 （ ｔ ｒ ｙ ｐ ｓ ｉ ｎ） 、 三氟 乙酸 （ Ｔ Ｆ Ａ） 、 乙 腈
（ Ａ Ｃ Ｎ） 、 牛血清 白蛋 白（ Ｂ Ｓ Ａ） 购自Ｓ ｉ ｇ ｍａ公 司 。二
ｇ ／ Ｌ， 取１ ０ Ｌ进行质谱 分析 。 设置 离子 传输 毛 细 管 的 温度 为 ２ ０ ０ ｏ Ｃ， 电喷 雾 电压 为 １ ． ８ ｋ Ｖ， 归 一 化 碰撞 能 量 为 ３ ５ ． ０ ％。均 使 用
机 械式搅 拌 器 （ Ｉ Ｋ Ａ Ｒ Ｗ２ ０ ） ， 恒 温水 浴 锅 （ 龙口 先科 仪 器公 司 ） ，Ｕ Ｖ ／ ｖ ｉ ｓ － 分光 光 度 计 （ Ｖ 一 ５ ５ ０， Ｊ Ａ Ｓ —
Ｃ Ｏ公 司 ） ，ｎ ａ ｎ ｏ — Ｒ Ｐ Ｌ Ｃ — ＭＳ ／ ＭＳ 系 统 由 Ｆ ｉ ｎ ｎ ｉ ｇ ａ ｎ
Байду номын сангаас
购 自辽 宁省 铁 岭 市 西 丰 县 的新 鲜 锦 灯 笼 果 实 ，
一
８ ０℃储 藏备用 。
ｍｉ ｎ ， ２ ０ ％Ａ～１ ０ ０ ％ Ａ；１ ０ ７～１ ２ ０ ｍｉ ｎ ，１ ０ ０ ％ Ａ。将 １ ． ４节 中冷 冻干燥 后 的样 品 用 ０ ． １ ％ 甲酸配 制 为 ０ ． １
第 ４期
于海洋， 等： 纳升级反相液相色谱一 串联质谱法分析锦灯笼提取物中的蛋白质
・ ３ ６ ３・
糖 类 等活 性物 质 ， 表 现 为调 节 免 疫 力 、 抗菌 、 抗 氧 化、 降 血糖 、 降血 脂等 活性 ” ， 但 是鲜 见关 于 锦灯 笼 中蛋 白质 的研究 。本 文 通 过水 提 取 、 酸 沉 淀法 得
冲液将 尿 素 浓 度 稀 释 至 １ ｍｏ ｌ ／ Ｌ 。按照 ｍ（ 酶） ：
ｍ（ 蛋 白质 ）： １ ： ２ ５的 比例 加入胰 蛋 白酶 ， 于３ ７℃下 酶解 ２ ０ ｈ， 加入 １ ０ ％ Ｔ Ｆ Ａ终 止酶 解反 应 。酶 解后 的
到 锦灯 笼果 实 中水 溶 性 提 取 物 ， 再将 提 取 物用 纳 升
的 ６ 个 离 子 峰 的 ＭＳ ／ ＭＳ 扫 描 ， 其 中 动 态 排 除 （ ｄ ｙ ｎ ａ ｍｉ ｃ ｅ ｘ ｃ ｌ ｕ ｓ ｉ ｏ ｎ） 设 置为： 重复 次数 （ ｒ ｅ ｐ ｅ ａ ｔ ｃ ｏ ｕ ｎ ｔ ） 为２ ， 重 复容 忍 时 问 （ ｒ ｅ ｐ ｅ ａ ｔ ｄ ｕ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ） 为３ ０ Ｓ ， 动 态排 除 时 间 （ ｅ ｘ ｃ ｌ ｕ ｓ ｉ ｏ ｎ ｄ ｕ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ） 为９ ０ Ｓ 。利 用 Ｘｃ ａ ｌ ｉ ｂ ｕ ｒ 软件 （ Ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｏ ｎ １ ． ４） （ Ｔ ｈ ｅ ｒ ｍｏ公 司 ） 进 行 系 统控 制和 数据 收集 。 对 实验 得 到 的质 谱 数 据结 果在 茄 科 （ Ｓ ｏ ｌ ａ ｎ ａ ｃ ｅ — ａ ｅ ） 蛋 白质 数据 库 （ Ｓ ｏ ｌ ａ ｎ ａ ｃ ｅ ａ ｅ ． ｆ ａ ｓ ｔ ａ ） 中进 行 检 索 ，
级 反 相 液 相 色 谱一 质谱 （ ｎ ａ ｎ ｏ — Ｒ Ｐ Ｌ Ｃ — ＭＳ ／ ＭＳ ） 系 统 检 测及 数据 库 检索 分 析 ， 鉴 定 了该 提 取 物 中的蛋 白
质 种类 ， 为进 一 步研 究 锦 灯 笼 中蛋 白质 的 生物 活性
奠 定 了基 础 。
样 品经固相萃取 （ Ｓ Ｐ Ｅ） 柱除盐 ， 冷冻干燥后 备用 。
Ｃ １ ８ Ａ Ｑ 反 相 色谱 填 料 （ ５ ｍ ，１ ０ ｎ ｍ）购 自 Ｍｉ —
ｃ ｈ ｒ ｏ ｍ Ｂ ｉ ｏ Ｒ ｅ ｓ ｏ ｕ ｒ ｃ ｅ ｓ 公司 ， 石英 毛 细 管 （ １ ２ ０ ｍｍ × ７ ５ ｍ） 购自Ｐ ｏ ｌ ｙ ｍｉ ｃ ｒ ｏ Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｅ ｓ 公司。
硫 苏糖 醇 （ ｄ ｉ ｔ ｈ ｉ ｏ ｔ ｈ ｒ ｅ ｉ ｔ ｏ ｌ ，ＤＴ Ｔ） 、 碘 代 乙酰胺 （ ｉ ｏ —
ｄ ｏ ａ ｃ ｅ ｔ ａ ｍｉ ｄ ｅ ， Ｉ Ａ Ａ） 购 自Ｂ ｉ ｏ — Ｒ ａ ｄ公 司 。药 品和 试 剂 均为 分析 纯 或色谱 纯 。实验 用水 均经 双 蒸处 理并 用 Ｍｉ ｌ ｌ ｉ — Ｑ水 处理 系统 （ Ｍｉ ｌ ｌ ｉ ｐ ｏ ｒ ｅ公 司 ） 进 行 纯化 。
１ 实 验 部 分
１ ． １ 材 料 与 试 剂
酸） ， 流速 为 ２ ０ ０ ｎ Ｌ ／ ｍｉ ｎ 。梯度 洗脱 程序 ： ０～ ２ ｍｉ ｎ ，
９ ８ ％ Ａ ；２ ～ ９ ２ ａｉ ｒ ｎ，９８ ％ Ａ ～６ ５ ％ Ａ ；９２ ～ ９ ５ ｍ ｉ ｎ，
６ ５ ％ Ａ ～２ ０ ％ Ａ； ９ ５ ～ １ ０ ５ ｍ ｉ ｎ，２ ０％ Ａ ； １ ０ ５ ～１ ０ ７
１ ． ５ Ｒ Ｐ Ｌ Ｃ ． ＭＳ ／ Ｍ Ｓ分 析
将 毛细管 的一端 拉成 内径 约 为 ５ ｍ 的尖端 ， 通
过气 压将 Ｃ １ ８ Ａ Ｑ填料压入柱 内， 填充柱长度在 １ ２
ａ ｍ 左 右 。将毛 细管的尖端 与质谱相连 。所用 的流动
相 Ａ为 ０ ． １ ％ 甲酸 溶液 ， 流动相 Ｂ为 乙腈 （ 含０ ． １ ％甲
Ｓ ｕ ｒ ｖ ｅ ｙ ｏ ｒ液 相 色 谱 泵 和 Ｌ Ｔ Ｑ 线 性 离 子 阱 质 谱
（ Ｔ ｈ ｅ ｒ ｍｏ — ｅ ｌ ｅ ｃ ｔ ｒ ｏ ｎ Ｆ ｉ ｎ ｎ ｉ ｇ ａ ｎ 公 司 ）组 成 ，Ｍａ ｇ ｉ ｃ
数据 依 赖 模 式 （ ｄ ａ ｔ ａ — ｄ ｅ ｐ ｅ ｎ ｄ ｅ ｎ ｔ ｍｏ ｄ ｅ ） 对 ＭＳ和 ＭＳ ／ ＭＳ进 行 图 谱 采 集 ， 扫描 模式 为全 扫描 （ ｍ／ ｚ ４ ５ ０ ． ０ ０～１ ８ ０ ０ ． Ｏ ０ ） ， 紧接着 进 行 全扫 描 中丰度 最 高
胰 蛋 白酶 （ ｔ ｒ ｙ ｐ ｓ ｉ ｎ） 、 三氟 乙酸 （ Ｔ Ｆ Ａ） 、 乙 腈
（ Ａ Ｃ Ｎ） 、 牛血清 白蛋 白（ Ｂ Ｓ Ａ） 购自Ｓ ｉ ｇ ｍａ公 司 。二
ｇ ／ Ｌ， 取１ ０ Ｌ进行质谱 分析 。 设置 离子 传输 毛 细 管 的 温度 为 ２ ０ ０ ｏ Ｃ， 电喷 雾 电压 为 １ ． ８ ｋ Ｖ， 归 一 化 碰撞 能 量 为 ３ ５ ． ０ ％。均 使 用
机 械式搅 拌 器 （ Ｉ Ｋ Ａ Ｒ Ｗ２ ０ ） ， 恒 温水 浴 锅 （ 龙口 先科 仪 器公 司 ） ，Ｕ Ｖ ／ ｖ ｉ ｓ － 分光 光 度 计 （ Ｖ 一 ５ ５ ０， Ｊ Ａ Ｓ —
Ｃ Ｏ公 司 ） ，ｎ ａ ｎ ｏ — Ｒ Ｐ Ｌ Ｃ — ＭＳ ／ ＭＳ 系 统 由 Ｆ ｉ ｎ ｎ ｉ ｇ ａ ｎ
Байду номын сангаас
购 自辽 宁省 铁 岭 市 西 丰 县 的新 鲜 锦 灯 笼 果 实 ，
一
８ ０℃储 藏备用 。
ｍｉ ｎ ， ２ ０ ％Ａ～１ ０ ０ ％ Ａ；１ ０ ７～１ ２ ０ ｍｉ ｎ ，１ ０ ０ ％ Ａ。将 １ ． ４节 中冷 冻干燥 后 的样 品 用 ０ ． １ ％ 甲酸配 制 为 ０ ． １
第 ４期
于海洋， 等： 纳升级反相液相色谱一 串联质谱法分析锦灯笼提取物中的蛋白质
・ ３ ６ ３・
糖 类 等活 性物 质 ， 表 现 为调 节 免 疫 力 、 抗菌 、 抗 氧 化、 降 血糖 、 降血 脂等 活性 ” ， 但 是鲜 见关 于 锦灯 笼 中蛋 白质 的研究 。本 文 通 过水 提 取 、 酸 沉 淀法 得
冲液将 尿 素 浓 度 稀 释 至 １ ｍｏ ｌ ／ Ｌ 。按照 ｍ（ 酶） ：
ｍ（ 蛋 白质 ）： １ ： ２ ５的 比例 加入胰 蛋 白酶 ， 于３ ７℃下 酶解 ２ ０ ｈ， 加入 １ ０ ％ Ｔ Ｆ Ａ终 止酶 解反 应 。酶 解后 的
到 锦灯 笼果 实 中水 溶 性 提 取 物 ， 再将 提 取 物用 纳 升
的 ６ 个 离 子 峰 的 ＭＳ ／ ＭＳ 扫 描 ， 其 中 动 态 排 除 （ ｄ ｙ ｎ ａ ｍｉ ｃ ｅ ｘ ｃ ｌ ｕ ｓ ｉ ｏ ｎ） 设 置为： 重复 次数 （ ｒ ｅ ｐ ｅ ａ ｔ ｃ ｏ ｕ ｎ ｔ ） 为２ ， 重 复容 忍 时 问 （ ｒ ｅ ｐ ｅ ａ ｔ ｄ ｕ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ） 为３ ０ Ｓ ， 动 态排 除 时 间 （ ｅ ｘ ｃ ｌ ｕ ｓ ｉ ｏ ｎ ｄ ｕ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ） 为９ ０ Ｓ 。利 用 Ｘｃ ａ ｌ ｉ ｂ ｕ ｒ 软件 （ Ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｏ ｎ １ ． ４） （ Ｔ ｈ ｅ ｒ ｍｏ公 司 ） 进 行 系 统控 制和 数据 收集 。 对 实验 得 到 的质 谱 数 据结 果在 茄 科 （ Ｓ ｏ ｌ ａ ｎ ａ ｃ ｅ — ａ ｅ ） 蛋 白质 数据 库 （ Ｓ ｏ ｌ ａ ｎ ａ ｃ ｅ ａ ｅ ． ｆ ａ ｓ ｔ ａ ） 中进 行 检 索 ，
级 反 相 液 相 色 谱一 质谱 （ ｎ ａ ｎ ｏ — Ｒ Ｐ Ｌ Ｃ — ＭＳ ／ ＭＳ ） 系 统 检 测及 数据 库 检索 分 析 ， 鉴 定 了该 提 取 物 中的蛋 白
质 种类 ， 为进 一 步研 究 锦 灯 笼 中蛋 白质 的 生物 活性
奠 定 了基 础 。
样 品经固相萃取 （ Ｓ Ｐ Ｅ） 柱除盐 ， 冷冻干燥后 备用 。
Ｃ １ ８ Ａ Ｑ 反 相 色谱 填 料 （ ５ ｍ ，１ ０ ｎ ｍ）购 自 Ｍｉ —
ｃ ｈ ｒ ｏ ｍ Ｂ ｉ ｏ Ｒ ｅ ｓ ｏ ｕ ｒ ｃ ｅ ｓ 公司 ， 石英 毛 细 管 （ １ ２ ０ ｍｍ × ７ ５ ｍ） 购自Ｐ ｏ ｌ ｙ ｍｉ ｃ ｒ ｏ Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｅ ｓ 公司。
硫 苏糖 醇 （ ｄ ｉ ｔ ｈ ｉ ｏ ｔ ｈ ｒ ｅ ｉ ｔ ｏ ｌ ，ＤＴ Ｔ） 、 碘 代 乙酰胺 （ ｉ ｏ —
ｄ ｏ ａ ｃ ｅ ｔ ａ ｍｉ ｄ ｅ ， Ｉ Ａ Ａ） 购 自Ｂ ｉ ｏ — Ｒ ａ ｄ公 司 。药 品和 试 剂 均为 分析 纯 或色谱 纯 。实验 用水 均经 双 蒸处 理并 用 Ｍｉ ｌ ｌ ｉ — Ｑ水 处理 系统 （ Ｍｉ ｌ ｌ ｉ ｐ ｏ ｒ ｅ公 司 ） 进 行 纯化 。
１ 实 验 部 分
１ ． １ 材 料 与 试 剂
酸） ， 流速 为 ２ ０ ０ ｎ Ｌ ／ ｍｉ ｎ 。梯度 洗脱 程序 ： ０～ ２ ｍｉ ｎ ，
９ ８ ％ Ａ ；２ ～ ９ ２ ａｉ ｒ ｎ，９８ ％ Ａ ～６ ５ ％ Ａ ；９２ ～ ９ ５ ｍ ｉ ｎ，
６ ５ ％ Ａ ～２ ０ ％ Ａ； ９ ５ ～ １ ０ ５ ｍ ｉ ｎ，２ ０％ Ａ ； １ ０ ５ ～１ ０ ７
１ ． ５ Ｒ Ｐ Ｌ Ｃ ． ＭＳ ／ Ｍ Ｓ分 析
将 毛细管 的一端 拉成 内径 约 为 ５ ｍ 的尖端 ， 通
过气 压将 Ｃ １ ８ Ａ Ｑ填料压入柱 内， 填充柱长度在 １ ２
ａ ｍ 左 右 。将毛 细管的尖端 与质谱相连 。所用 的流动
相 Ａ为 ０ ． １ ％ 甲酸 溶液 ， 流动相 Ｂ为 乙腈 （ 含０ ． １ ％甲