第二发酵工业菌种与种子的扩大培养
发酵工程(2)第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养
华根霉 ( Rhizopus chinentis )
酿酒所必须的重要霉菌，也是 酸性蛋白酶和腐乳生产中的重要菌 种。
2、毛霉 ( Mucor )
鲁氏毛霉 ( Mucor rouxianus ) 能糖化淀粉且能生成少量酒精；能产生
6、醋酸菌 (Acetobacter)
➢ 不形成芽孢，G－，好气性 ➢ 可生产醋酸.
7、棒状杆菌 (Corynebacterium) ➢ 是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌.
8、短杆菌 (Brevibacterium)
氨基酸、核苷酸工业生产中常用的菌种，也是酶法 合成生产辅酶A的菌种.
9、黄单胞菌 (Xanthomonas)
5、假丝酵母 (Candida)
➢能形成假丝，液体培养时能 形成浮膜。 ➢可生产SCP、甘油、脂肪酶。
6、红酵母 (Rhodotorula)
➢有明显的红色或黄色色 素，很多种因生荚膜而形 成粘质状菌落。 ➢可由菌体提取大量脂肪、 -胡萝卜素。
7、棉病针孢酵母 ( Nematspora gossypii )
2、葡萄汁酵母 (Saccharomyces uvarum)
与酿酒酵母相似，主要的区别在于葡萄汁酵母能发酵 棉子糖和蜜二糖。
3、汉逊酵母 (Hansenula)
此属酵母多能产生乙酸乙酯，从而增加产品的香 味，可用于酿酒和食品工业。
4、球拟酵母 (Toruiopsis)
此属酵母有些种能产生不同比例的甘油、赤藓 糖、阿拉伯糖；有的能利用烃类生产蛋白质。
复筛 不纯 第四次平板分离
第三次菌种保藏
第四次原种斜面
初步工艺条件摸索
再复筛
菌种扩大培养的一般流程
菌种扩大培养的一般流程菌种扩大培养是微生物学实验中常见的一项操作，其目的是在较小的培养基中培养并扩大菌种数量，以满足后续实验的需要。
下面将介绍一般的菌种扩大培养流程，以帮助读者了解和掌握这一技术。
第一步：选择适当的培养基菌种扩大培养的第一步是选择适当的培养基。
不同的菌种对培养基的要求不同，因此选择合适的培养基是非常重要的。
一般来说，培养基应包含适当的营养物质，如碳源、氮源、矿物质和水等，以满足菌种生长的需要。
第二步：制备培养基制备培养基是菌种扩大培养的关键步骤之一。
一般情况下，制备培养基需要将适量的培养基粉末溶解在适量的蒸馏水中，并进行加热煮沸，以杀灭其中的细菌和其他微生物。
然后，将煮沸的培养基倒入无菌培养皿或试管中，并在冷却后加入适量的菌种。
第三步：接种菌种接种菌种是菌种扩大培养的关键步骤之一。
接种菌种时，首先需要将菌种从原始培养基中转移到新的培养基中。
这可以通过采用无菌的接种环、接种针等工具，将菌种从原始培养基中接种到新的培养基中完成。
为了确保接种的无菌性，可以在接种后进行密封和贴标。
第四步：培养菌种在接种菌种后，需要将培养基置于适当的环境条件下进行培养。
一般来说，菌种的生长需要适宜的温度、湿度和氧气条件。
因此，在培养过程中需要注意保持适宜的培养环境，并定期观察菌落的生长情况。
第五步：检测菌种的生长情况在培养一定时间后，需要检测菌种的生长情况。
这可以通过肉眼观察菌落的形态、颜色和大小等特征来判断。
同时，也可以采用显微镜观察菌落的细胞形态和结构，以进一步确定菌种的生长情况。
第六步：收获菌种在菌种生长到一定程度后，可以进行菌种的收获。
一般来说，菌种可以通过离心、过滤和冻干等方法进行收获。
收获后的菌种可以用于后续的实验操作或保存在冷冻库中。
菌种扩大培养的一般流程包括选择适当的培养基、制备培养基、接种菌种、培养菌种、检测菌种的生长情况和收获菌种等步骤。
通过掌握和熟练操作这一流程，可以有效地扩大菌种数量，并满足后续实验的需要。
发酵菌种的扩大培养实验报告
发酵菌种的扩大培养实验报告本次实验是为了扩大培养发酵菌种，得到足够的菌量用于后续的研究。
在实验室里，方便的是可以通过人工控制条件，提供最适宜的环境来培养菌种。
下面，本人将会对本次实验的步骤、结果及问题进行详细的叙述。
首先，我们需要准备培养基。
培养基是为细菌及真菌提供营养、促进生长的基础，它有重要的意义，在培养基中加入的各种营养物质可以为微生物的生长提供养分。
常用的培养基有肉汤、大理石蓝、Lysogeny Broth(简称LB)等。
在本次实验中，我们使用的是LB培养基，这是菌落多且生长迅速的培养基。
其次，我们需要挑选合适的发酵菌种。
在挑选菌种时，我们应该考虑到不同菌种的特点，包括生长环境、生长速度、需氧程度、工业上的生产效率等等因素。
在本次实验中，我们挑选的菌种为大肠杆菌，因为它是广泛应用于科学研究和工业生产中的一种常见细菌，能够产生很多有用的代谢产物，如酶、物质、药物等。
接着，我们需要对菌种进行预处理。
首先，需要将菌种从保存状态中取出，经过扩大培养使细胞数增加，并进一步观察其生长情况。
前期的处理过程包括常规的消毒操作和种接的准备工作，以确保操作环境的干净卫生。
在本次实验中，我们采用的是液体发酵法进行扩大培养，之后用DDA600（光密度）检测其生长状况，并根据结果调整富营养的生长环境或继续进行培养。
在预处理结束后，我们需要将菌液分装，并进行密闭培养。
整个过程需要严格控制菌液中的温度、氧气、培养基的成分等因素。
在温度方面，我们应将温度保持在合适的范围内，以促进菌种的生长。
同时，要保持培养环境的平衡，使其能在理想的环境下快速扩大生长。
我们本次实验中为了保证菌种的生长速度，采用了20L摇床培养，密闭培养2天。
本次实验结果比较好，我们得到了大量的发酵菌种，在DDA600检测的结果中，吸光度值为1.510，表明其细胞密度非常高，每毫升培养液中菌体数量达到了5.21X10的8次方CFU/mL。
在整个过程中，最值得注意的问题是要保持好实验环境的清洁和无菌，并及时调整培养环境以使菌种的生长速度最佳。
菌种的扩大培养
菌种的扩大培养、污染的检测与判别种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。
这些纯种培养物称为种子。
微生物工业自从采用纯种发酵以来，产率有了很大的提高，然而防止杂菌污染的要求也更高了。
人们在与杂菌污染的斗争中，积累总结出很多宝贵的经验。
规范了管理措施，设计了一系列设备(例如密闭式发酵罐，培养基灭菌设备，无菌空气制备设备等)和管道，应用了无菌室甚至无菌车间，建立了无菌操作技术，因而大大降低了发酵染菌率。
但是某些发酵工业还遭受着染菌的威胁，染菌后轻者影响产率、产物提取收得率和产品质量，重者造成“倒罐” ，不但浪费大量原材料，造成严重的经济损失，还会对周围环境造成破坏。
凡是在发酵液或发酵容器中侵入了非接种的微生物统称为杂菌污染，及早发现杂菌并采取相应措施，对减少由杂菌污染造成的损失至关重要。
因此检查的方法要求准确、快速。
发酵污染可发生在各个时期。
种子培养期染菌的危害最大，因严格防止。
一旦发现种子染菌，均应灭菌后弃去，并对种子罐及其管道进行彻底灭菌。
发酵前期养分丰富，容易染菌，此时养分消耗不多，应将发酵液补足必要养分后迅速灭菌，并重新接种发酵。
发酵中期染菌不但严重干扰生产菌株的代谢，而且会影响产物的生成，甚至使已形成的产物分解。
由于发酵中期养分已被大量消耗，代谢产物的生成又不是很多，挽救处理比较困难，可考虑加入适量的抗生素或杀菌剂。
如果是发酵后期染菌，此时产物积累已较多，糖等养分已接近耗尽，若染菌不严重，可继续进行发酵;若污染严重，可提钱放罐。
染菌程度越重，危害越大;染菌少，对发酵的影响就小。
所以，实际生产中，应当根据污染程度和发酵时期区别对待。
器材与试剂1.器材高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、带摇床的培养箱、显微镜、天平、三角瓶、试管、移液管、培养皿、接种针、平板涂布器、酒精灯、载玻片2.试剂营养琼脂、葡萄糖、磷酸二氢氨、七水合硫酸镁、氯化钠、磷酸氢二钾、牛肉膏、蛋白胨、0.4%酚红溶液、蒸馏水、番红染液、香柏油、擦镜液3.培养基(1)营养琼脂培养基：直接称量营养琼脂粉4.5g，溶于100mL蒸馏水配制，pH 7.2，分装到试管中，灭菌后摆成斜面。
发酵菌种扩大培养的一般工艺流程
发酵菌种扩大培养的一般工艺流程
发酵菌种扩大培养是生物制药、食品工业和农业等领域中常见的一项技术。
下面是一般的发酵菌种扩大培养的工艺流程。
1. 菌种前处理：选择合适的菌株并进行预处理。
这包括接种菌株到适宜的培养基中，以及优化培养条件，如温度、pH值和培养基成分等。
预处理的目的是为了提高菌种的生长速度和产量。
2. 发酵罐的选择：根据菌种的特性和生产需求选择合适的发酵罐。
常见的发酵罐有批式发酵罐、连续式发酵罐和固定床发酵罐等。
3. 发酵罐装载和接种：将预处理好的菌种接种到发酵罐中。
接种时要注意保持无菌操作，以避免杂菌的污染。
4. 发酵过程的控制：在发酵过程中，需要对温度、pH值、氧气供应、搅拌速度和营养物质等进行控制和调节。
这些参数的控制可以通过自动化系统进行，以保证菌种的最佳生长条件。
5. 发酵罐内的生物反应：菌种在发酵罐中进行生长和代谢活动，产生所需的物质。
不同的菌株和产品需要不同的发酵时间，一般需要几天到几周不等。
6. 产物的回收和纯化：发酵结束后，需要对发酵液进行回收和纯化。
这包括离心、过滤、浓缩和柱层析等步骤，以获得纯度较高的产物。
7. 发酵罐的清洗和消毒：发酵结束后，需要对发酵罐进行清洗和消毒，以准备下一轮的发酵。
以上是发酵菌种扩大培养的一般工艺流程。
在实际应用中，还需要根据具体的菌株和产品进行优化和调整。
发酵菌种扩大培养技术的发展，为生物制药和食品工业的发展提供了强大的支持，也为我们生活带来了更多的便利和好处。
发酵工程第一章 种子扩大培养
培养温度
❖ 温度过低，菌种生长发育缓慢 ❖ 温度过高会使菌丝过早自溶
在制备土霉素生产种子过程中，高于37℃培养时， 孢子接入发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨
基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。
❖ 但考虑能否在一定时间内获得优质、足量的 种子以满足发酵的需求
一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时， 工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数
谷氨酸：三级发酵 一级种子（摇瓶）→二级种子 （小罐）→发酵
青霉素：三级发酵 一级种子 （小罐）→二级种子（中罐）→发酵
发酵级数确定的依据
级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响
高的细胞。为了使细胞迅速进行分裂 或菌丝快速生长。
种子培养基特点
❖ 有较完全和丰富的营养物质，糖分少，需充足 氮源和生长因子，无机氮源比例大； ➢ 各种营养物质的浓度不必太高； ➢ 供孢子用的种子培养基，可添加易被吸收利 用的碳源和氮源；
➢ 应考虑与发酵培养基的主要成分相近。
pH
❖ 选择最适种子培养pH的原则是获得 最大比生长速率和适当的菌量
❖ 丝状微生物不宜剧烈搅拌。
斜面冷藏时间
❖ 对孢子的生产能力有较大影响 ❖ 冷藏时间越长，生产能力下降越多
链霉素生产中，斜面孢子在6℃冷藏两 个月后的发酵单位比冷藏一个月的降低18％， 比冷藏3个月的降低35％。
培养基
❖ 培养种子的目的：
➢ 扩大培养，增加细胞数量； ➢ 同时也必须培养出强壮、健康、活性
种子质量的判断方法
❖ 通常检测的培养液中参数 ➢ pH是否在种子要求的范围之内 ➢ 糖、氨基氮、磷酸盐的含量 ➢ 菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观 ➢ 有无杂菌污染
2发酵工业菌种制备原理和技术(2)(精)
作为种子扩大培养的方法： ① 表面培养法 ② 固体培养法 ③液体培养法（三角瓶摇床震荡或转式培养）； ④载体培养法
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固体培养法（曲法培养）
浅盘固体培养 深层固体培养
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优点：
（1）酶活力高。 （2）生产过程中无菌程度要求不很严格。 （3）对于固体发酵，由于产物浓度大，易于分离，可以 有效的降低产品分离成本。
NICPB 卫生部药品生物制品监察所
IV
CIVBP
中国医学科学院病毒研究所
中国兽医药品监察所
CVCC
YM
兽医微生物菌种保藏管理中心
云南省微生物研究所
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国外重要菌种保藏机构
1、ATCC：美国模式培养物（菌）保藏中心
2、NRRL：美国农业部北方开发利用研究部
3、CSH：美国冷泉港研究所
4、IAM：日本东京大学应用微生物研究所
9
微生物菌种保藏机构名称和缩写
中 国 缩写 ACCC SH IA CCGMC AS-IV CAF IFFI ID 名称 中国农业微生物菌种保藏管理中心 上海市农业科学院食用菌研究所 中国医学科学院抗菌素研究所 普通微生物菌种保藏管理中心 中国科学院武汉病毒研究所 中国林业科学院菌种保藏管理中心 轻工业部食品发酵工业科学研究所 中国医学科学院皮肤病研究所 缩写 ISF CACC SIA AS CFCC CICC CMCC 名称 中国农业科学院土壤肥料研究 所 抗菌素菌种保藏管理中心 四川抗菌素工业研究所 中国科学院微生物研究所 林业微生物菌种保藏管理中心 工业微生物菌种保藏管理中心 医学微生物菌种保藏管理中心
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（5）接种量
移入种子的体积 接种量＝ ————————— 接种后培养液的体积
发酵工程(2)第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养
单细胞真核，主 分布于含糖质较多的 偏酸性环境中，如水 果、蔬菜、花蜜和植 物叶子上，以及果园 土壤中。
1、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)
又称啤酒酵母。细胞多为圆形、 卵形，能产生子囊孢子。能发酵 葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和半乳糖 等多种糖类，但不发酵乳糖和蜜 二糖。
5、白地霉 ( Geotrichum candidum )
➢ 节孢子单个或连接成链。
➢ 白地霉菌体蛋白营养价值很高，可供食用和饲 料用，也可用来提取核酸，在废料废水的利用上很 用价值。
6、产黄头孢霉 ( Cephalosporium chrysogen ) 头孢霉素、先锋霉素
3、游动放线菌属 （Actinoplanes）
➢ 一般不形成气生菌丝，孢子球形，有时端生1-40 根鞭毛，能运动。 ➢ 济南游动放线菌生产创新霉素(creatmycin; 1964).
4、诺卡氏菌属 (Norcadia)
➢ 菌落较小，边缘多呈树根 毛状。 ➢ 生产利福霉素、蚊霉素等
5、孢囊链霉菌属 (Streptosporangium)
4、青霉 ( Penicillum )
产黄青霉 ( Penicillum chrysogenum ) 生产青霉素，也可用来生产葡萄
糖氧化酶、葡萄糖酸、柠檬酸和抗坏 血酸。
娄地青霉 ( Penicillum roqueforti ) 属不对称青霉组，具有分解油
脂和蛋白质的能力，用于制造干酪； 该菌孢子能将甘油三酯氧化为甲基 酮。
第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养
第一节 发酵工业常用微生物 第二节 菌种来源 第三节 菌种选育 第四节 种子扩大培养 第五节 菌种保藏
种子的扩大培养
☆（2）接种量的确定 ◆与该菌在发酵罐中生长繁殖的速度、种子质量和发酵条件 等有关。 a.接种量过多，菌丝生长过快、过稠，培养液粘度增加， 营养基质缺乏或溶解氧不足，影响产物的合成。 b.接种量过小，引起发酵前期菌体生长缓慢，使发酵周期 延长，菌丝量少，还可能产生菌丝团，导致发酵异常。
生产上多以大接种量和丰富培养基作为高产措施
（2）注射接种 用于种子罐接种，在罐顶接种管口压 盖一层橡胶膜，将注射器针嘴插入橡胶膜进行接种。
（3）摇瓶直接进罐法 适合种子罐接种，一般需三人 配合操作。
二、注意事项
（1）按照无菌操作
（2）消毒灭菌一定要彻底、干净
（3）在接种操作中，一定要严格按照无菌操作进行，规范生 产操作，严禁误操作带来的杂菌污染，经常提醒，建立严格 的无菌概念，避免出现二次污染。
如果将一级种子接入体积较大的种子罐内，经过培养形成更 多的菌丝——二级种子；将二级种子转入发酵罐内发酵，称为 三级发酵。
使用三级种子的发酵，称为四级发酵。
◆接种 将孢子或菌落，或试管、三角瓶或种子罐中 菌体接入培养容器的操作过程。
◆接种量 移种的种子液体积和培养液体积之比。
◆接种龄 种子罐中培养的菌体开始移种到下一级种 子罐或发酵罐的培养时间。
1．实验室种子制备 （1）斜面种子培养 活化菌种，同时也培养一定数量的斜面 种子。 （2）液体培养 包括液体试管和三角瓶摇床震荡或回旋式培 养。
①液体试管培养 无菌条件下，用接种针自斜面试管挑取 一环斜面种子菌体，接入装有液体培养液的试管，摇匀后，置 培养箱培养，待培养成熟后，再接入三角瓶培养。
②三角瓶液体培养（摇瓶种子）
（4）生产中使用的斜面菌种不宜多次移接，一般只移接三次 (三代)，以免由于菌种的自然变异引起菌种不纯。因此，要 经常进行菌种的分离纯化，不断提供新的斜面菌株供生产使 用。
发酵工程中对菌种扩大培养的方法
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发酵工程第二章发酵工业微生物菌种
方法，实际发酵工业上菌种分离的步骤要有很多 步骤。
新种分离与筛选的步骤
定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长 培养特性。
采样：有针对性地采集样品。 增殖：人为的通过控制养分或培养条件，使所需
菌种增殖培养后，在数量上占优势。 分离：利用分离技术得到纯种。 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包
工业上常用的微生物菌种
③ 霉菌： 工业上常用的霉菌有根霉、毛霉、红曲 霉、青霉等，主要生产酶制剂、抗生素、有机酸 和甾体激素等。
④ 放线菌： 工业上常用的有链霉菌属、小单胞菌 属和诺卡菌属，主要用于生产多种抗生素。
⑤ 担子菌： 即常说的蕈菌，主要用于生产多糖、 药物开发。
⑥ 藻类： 工业上常用的藻类有螺旋藻、单烈藻等， 主要用于生产食品，替代能源等。
新种分离与筛选的步骤
（三）培养分离 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物
的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在 这一步，增殖培养的选择性控制条件还应进一 步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分 离的方法有划线分离法、稀释分离法。
施加选择性压力分离法
施加选择性压力分离法：利用不同种类微生物生 长繁殖对环境和营养要求不同，人为控制这些条 件，使之利于某类或者某种微生物生长，不利于 其他微生物生存，以达到使目的菌占优势，从而 快速分离纯化的目的。
括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、 发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生 长和发酵最适温度、最适值、提取工艺等。
新种分离与筛选的步骤
从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要和基础的 步骤。
到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示一个试样 中所包含的所有微生物总数和种类。
发酵生产的过程及控制
死亡期
2、补料分批培养
在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足而导致 的发酵过早结束的缺点。 在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，所以发酵结束 时发酵液体积比发酵开始时有所增加。在工厂的实际生产中 采用这种方法很多。
简单的过程，培养基中接入菌种以后，没有物料的加入和取出， 除了空气的通入和排气。整个过程中菌的浓度、营养成分的浓 度和产物浓度等参数都随时间变化。
优点： 操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量 容易掌握 缺点： 产率低，不适于测定动力学数据
分批培养中微生物的生长
迟滞期 对数生长期
稳 定期
发酵级数确定的依据
级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响。
级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一 般2-4级。
在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要 的一个方面。
3、接种量的确定
移入种子的体积 接种量＝ —————————
接种后培养液的体积
过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为7-15%。 但是一般认为大一点好。
7 种子的质量标准
• 菌丝形态、菌体浓度和培养基外观（色素、颗粒等）； • pH； • 糖氮代谢速度； • 其它参数,如接种前的抗生素含量、某种酶活等。
8 影响种子质量的因素：
1）原材料的质量:
一般选择一些有利于孢子发芽和菌丝生长的培养基，在营养 上容易被菌体直接吸收利用，营养成分要适当地丰富和完全， 氮源和维生素含量较高，这样可以使菌丝粗壮，并且具有较 强的活力。
另一方面，种子培养基中的营养成分要尽可能和发酵培养基 接近以适合发酵的需要，这样的种子移入发酵罐后能比较容 易适应发酵罐的培养条件如微量元素Mg、Ca、Ba能刺激孢子 的生长。 2）、培养温度：过低？过高？
发酵菌种扩大培养的一般工艺流程
发酵菌种扩大培养的一般工艺流程
发酵菌种扩大培养的一般工艺流程如下：
1. 菌株的预处理：选择合适的菌株并将其保存在培养基中。
菌株可以来自于已有的菌种库，也可以从自然环境中分离得到。
在预处理中，需要将菌株经过悬浮培养、鉴定和活化等步骤。
2. 培养基的制备：制备适合菌株生长的培养基，根据不同菌种的需求，确定培养基的配方和pH值。
培养基的主要成分包括碳源、氮源、无机盐和生长因子等。
3. 菌种接种：将经过预处理的菌株接种到培养基中，通常使用无菌的接种针或接种环进行接种。
接种时需要注意接种量的控制，以避免菌株的过度生长或过少生长。
4. 发酵条件的控制：对接种后的菌株进行适宜的发酵条件控制，包括温度、pH值、氧气供应和搅拌速度等。
不同菌株对这些条件的要求不同，需要根据具体情况进行调整。
5. 发酵过程的监测：通过定期取样，对发酵过程中的生物量、代谢产物和酶活等指标进行监测和分析。
这些指标的变化可以反映菌株的生长状况和产物合成情况。
6. 发酵过程的控制：根据监测结果，及时调整发酵条件，以提高菌株的生长速率和代谢产物的产量。
可能的调整包括增加培养基中的营养物质，调节pH值和温度等。
7. 菌种的收获和保存：发酵过程结束后，收获培养物中的菌种。
可以通过离心、过滤或其他分离方法将菌株与培养基分离。
分离后，
菌种可以通过冷冻保存或制备菌种存储液进行长期保存。
以上是发酵菌种扩大培养的一般工艺流程，具体操作步骤和条件应根据具体的菌株和实验要求进行调整。
种子的扩大培养
液体深层种子罐从底部通气，送入的空气由搅拌桨叶分散成 微小气泡以促进氧的溶解。该法容易按照生产菌种对于代谢 的营养要求一级不同生理时期的通气、搅拌、温度与培养基 中氢离子等条件，选择最佳培养条件。
四、种子质量的控制
（二）影响种子质量的因素及控制
培养基
（1）营养成•分种适龄合：种是子指培种养子的罐需中要培养的菌丝体开始移入
种子培养要求一定量的种子，在适宜的培养基中，控制一定的培养条 件和培养方法，从而保证种子正常生长。
工业微生物培养法分为静置培养和通气培养两大类型。
❖静置培养即将培养基盛于发酵容器中，在接种后，不通空气进行培养。 ❖通气培养法的生产菌种以需氧菌和兼性需氧菌居多，它们生长的环境必须供给 空气，以维持一定的溶解氧水平，使菌体迅速生长和发酵，又称好气培养法。
（1）放线菌孢子的制备
a) 放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含 有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白 胨和一些无机盐等。
b) 碳源和氮源不要太丰富（碳源约为1％，氮源不超过0.5 ％），干燥和限制营养可直接或间接诱导孢子形成。
c) 放线菌斜面的培养温度大多数为28℃，少数为37℃，培 养时间为5～14天。
菌种细胞的生长活力强，转种至发酵罐后能迅速生 长，延滞期短。
菌种生理状态稳定，如菌丝形态、菌丝生长速率和 种子培养液的特性等符合要求。
菌体浓度及总量能满足大容量发酵罐接种量的要求。 无杂菌污染，保证纯种发酵。 菌种适应性强，能保持稳定的生产能力。
二、种子制备的过程
从工业发酵的角度来说，种子制备分成两个 阶段：
摇瓶培养基配方和培养条件与种子罐相似。
常采用母瓶、子瓶两级培养。种子培养基要求比 较丰富和完全，易被菌体分解利用，氮源丰富有 利于菌丝生长。原则上各种营养成分不宜过浓， 子瓶培养基浓度比母瓶略高，更接近于种子罐的 培养基配方。
第二章-种子的扩大培养
(2)培养条件 • 接种量：0.8~1.0％ • 培养温度：32~34℃ • 培养时间：7~8h • 通风量： • 50L种子罐1:0.5 • 搅拌转速340r／min； • 250L种子罐1:0.3 • 搅拌转速300r／ min • 500L种子罐1:0.25 • 搅拌转速230r／ min
(3)二级种子的质量要求 • 种龄：7~8h • pH：7.2左右 • OD值净增0.5左右 • 无菌检查(-) • 噬菌体检查(-)
种子罐培养：
获得足够的菌种数量； 种子罐的培养基接近发酵罐培养的醪液成分和 培养条件，使菌体适应发酵环境。
种子罐级数的确定
种子扩大的级数：制备种子需逐级扩大培养的次 数
种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制，并 减少由于多次转种而带来的染菌机会以及减少因 种子罐生长异常而造成的发酵波动 但考虑能否在一定时间内获得优质、足量的种子 以满足发酵的需求
（5）pH
●
pH影响菌体的生长和代谢
（6）通气搅拌
影响培养基中的溶氧，通气过大或搅拌速度过快容易导致某些酶失 活或菌体细胞破裂。
●
3、接种量和种龄的影响
移入种子的体积 接种量＝ ————————— 接种后培养液的体积
接种量大小最终以实践定。
接种量过多：菌丝生长过快、溶 氧不足，衰老细胞增加等，发酵 后劲不足 种量过少：延长发酵周期，形成 异常形态，而且易造成染菌。 以生产菌种在发酵罐中的繁殖速 度为依据 接种量的大小直接影响发酵周期。
碳源和氮源不太丰富（ 碳源约1%，氮源不超过
0.5%）。碳源丰富易造成生理酸性的营养环境，不 利于放线菌孢子形成；氮源丰富有利于菌丝繁殖不 利于孢子形成。
发酵工程思考题含答案解析
发酵工程课后思考题第一章绪论1、发酵及发酵工程定义？答：它是应用微生物学等相关的自然科学以及工程学原理，利用微生物等生物细胞进展醐促转化，将原料转化成产品或提供社会性效劳的一门科学。
由于它以培养微生物为主，所以又称为微生物工程。
2、发酵工程根本组成局部？答：从广义上讲分为三局部：上游工程、发酵工程、下游工程3、发酵工业产业化应抓好哪三个环节？答：发酵工程产业化就是将有关应用微生物的科学研究成果转化为发酵产品，并投向市场的过程。
三个环节：投产试验、规模化生产和市场营销。
①投产试验：涉及到〃上、中、下三游〃工作，即研究成果的验证、小试、中试和扩大试验。
②规模化生产：值得注意的是产品质量问题，其检测必须符合相应产品标准。
③市场营销：市场开拓对技术本身影响不大，但参与市场竞争却是产业化成败的决定因素。
4、当前发酵工业面临三大问题是什么？答：菌种问题纯种，遗传稳定性，平安，周期短、转化率高产率高抗污染能力强：噬菌体、蛭弧菌；适宜的反响器生产规模化原料利用量大，并且具有一定选择性，节能，构造多样化、操作制动化，节劳力。
基质的选择价廉原料利用量大，并且具有一定选择性易被利用、副产物少，满足工艺要求。
5、我国发酵工业应该走什么样的产业化道路？发酵过程的组成局部？答第一步为技术积累阶段、第二步为产业崛起阶段、第三步为持续开展阶段典型的发酵过程可划分成六个根本组成局部：(1)繁殖种子和发酵生产所用的培养基组份设定；(2)培养基、发酵罐及其附属设备的灭菌；(3)培养出有活性、适量的纯种，接种入生产容器中；(4)微生物在最适合于产物生长的条件下，在发酵罐中生长；(5)产物别离和精制;(6)过程中排出的废弃物的处理。
第二章菌种的来源(1)1、自然界别离微生物的一般操作步骤？答：标本采集，预处理，富集培养，菌种别离(初筛，复筛)，发酵性能鉴定，菌种保藏2、从环境中别离目的微生物时，为何一定要进展富集？答：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。
第五章种子的扩大培养
玉米淀粉双酶糖 4.0， 玉米浆 1.5 ，甘蔗糖 12 / 20 蜜 1.0, 液氨，复合维生素 01 mg/L， 无机 m3 盐等
玉米淀粉双酶糖 13-14， 玉米浆 0.06-0.08 ， 154 / 240 甘蔗糖蜜 1.0, 液氨，维生素 50 g， 无机盐 m3 等
三级种子的特点： ① 种量更大，生长速度快：
采用被孢霉进行Υ亚麻酸发酵时接种量可以明显影响菌丝体
采用被孢霉进行Υ亚麻酸发酵时接种量可以明显影响菌丝体 的形态，从而影响菌体干重和Υ亚麻酸产量。
不同接种量影响菌体的生长和发酵
发酵前期发酵液作为种子，发酵指数明显提高 发酵后期菌体自溶明显，影响提炼收率
20%种子罐＋10%发酵罐前期发酵液效果最好
活力旺盛
二、青霉素生产的种子制备
制备过程
安瓿管 → 斜面孢子 → 大米孢子 → 一级种子 → 二级种子
→ 发酵
1. 斜面孢子
培养基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等 培养条件：25℃、7天，注意湿度50%左右
培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细
2. 大米孢子
培养基：大米及氮源（玉米浆） 培养条件：25℃、7天，控制湿度
接种后培养液的体积
过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素 为7-15%。但是一般认为大一点好。
双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。
倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发 酵罐。
接种量对菌体形态和产Υ亚麻酸的影响
杨博， 中国油脂，2002
Υ亚麻酸是人体必需多价不饱和脂肪酸，是人体前列 腺素的前体，在预防与治疗心脑血管疾病、糖尿病治 疗、增强免疫力、抗癌和保护皮肤等方面具有重要作 用。发酵法生产Υ亚麻酸成了当今研究的一个热点。
发酵菌种的扩大培养实验报告
发酵菌种的扩大培养实验报告引言发酵技术在生物工程和食品工业中起着重要作用。
发酵菌种的培养是发酵过程中的关键步骤之一，其目的是通过扩大菌种的数量，为后续的发酵过程提供足够的微生物原料。
本实验旨在探讨发酵菌种的扩大培养方法，并评价其对发酵产物的影响。
材料与方法1.发酵菌株的选择：选择适合的目标菌株，确保其具有良好的发酵性能和产量。
2.培养基的配置：按照菌株的需求，配置合适的发酵培养基，包括碳源、氮源、矿物盐等。
3.菌种的预培养：将初始菌种接种到含有适当量培养基的试管中，通过摇床培养预培养菌种。
4.发酵罐的选择：根据菌株特性和产量要求，选择合适的发酵罐，包括体积、通气性等。
5.发酵条件的控制：控制发酵温度、pH、氧气供应等条件，以提高发酵产物的质量和产量。
结果与讨论选取合适的菌株合适的菌株是成功发酵的关键。
通过对多个菌株的筛选和对比，我们最终选择了菌株X。
该菌株具有较高的酶活性和耐受性，适合用于发酵生产。
优化培养基配方培养基的配方对菌种的生长和代谢活动有重要影响。
我们通过调整碳源、氮源和矿物盐的种类和浓度，对培养基进行优化。
最终确定的配方为：A：Xg碳源，B：Yg氮源，C：Zg矿物盐。
该配方不仅满足了菌株的营养需求，还能够促进菌种的生长和产物的积累。
菌种的预培养为了获得足够的菌株数量，我们实施了菌种的预培养工作。
将初始菌种接种到含有适当量培养基的试管中，通过摇床培养预培养菌种。
预培养的时间和培养条件应根据菌株的特性进行优化，以尽量提高菌种的活性和生长速度。
发酵罐的选择选择合适的发酵罐对发酵过程的成功与否至关重要。
考虑到菌株X的产量较高，我们选择了一个具有较大容积和良好通气性能的发酵罐。
罐体的材料应具有良好的耐腐蚀性和热传导性能，以保证发酵过程的稳定性和安全性。
发酵条件的控制发酵条件的控制直接影响到发酵产物的质量和产量。
我们通过监测和调整温度、pH、氧气供应等因素，来优化发酵条件。
在菌株X的发酵过程中，最适宜的温度为T摄氏度，最适宜的pH值为pH值，最适宜的氧气供应速率为S。
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产生菌及其ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ物的毒性必须考虑（在分类学 上最好与致病菌无关）
生产特性要符合工艺要求
二、已工业化产品生产菌的介绍
1. 抗生素生产有关的微生物 抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复 杂的代谢，目前发现的生物来源如下：
放线菌（链霉 素四环素；红 霉素等） 真菌（青霉素、头孢等）
一些产芽孢的细菌 植物或动物来源
二、已工业化产品生产菌的介绍
2. 氨基酸生产有关的微生物 50、60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控 制发酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点： 代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改 变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这 种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸 发酵中得到成功应用。
第二章 发酵工业菌种 与种子的扩大培养
第一节
发酵工业菌种概述
菌种在发酵工业中起着重要作 用，它是决定发酵产品是否具有产
业化价值和商业化价值的关键因素、
是发酵工业的灵魂。
一、发酵工业用菌种的特点及要求
能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高 效地合成产物 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌 种改造的可操作性要强
一、菌种的来源 根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂 或菌种保藏部门索取或购买； 从大自然中分离筛选新的微生物菌种。
二、新种分离与筛选的步骤 定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长 培养特性。 采样：有针对性地采集样品。 增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌 种增殖培养后，在数量上占优势。
二、已工业化产品生产菌的介绍
4. 常用的基因表达系统 （2）真核细胞表达系统 中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统
具有准确的转录后修饰功能； 具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化； 具有重组基因的高效扩增和表达能力； 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长； CHO很少分泌自身的内源蛋白。
二、已工业化产品生产菌的介绍
问题： 生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？
微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产 我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生 产对于某一种特定的产品，只有特定的微生 物才具有大量表达的潜力。
例： 礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40 万株微生物中，发现了三种有潜力的新 抗生素。
生长迅速、蛋白产量高; 表达蛋白的纯化、分离及分析快速； 外源基因的导入相对容易； 已建立了整套表达理论及技术.
二、已工业化产品生产菌的介绍
4. 常用的基因表达系统 （2）真核细胞表达系统 酵母(既是微生物又是真核细胞)
生长迅速，营养要求不高，易培养； 安全性好； 比哺乳动物细胞操作简单； 具有一定的修饰蛋白的能力。
二、新种分离与筛选的步骤 2. 增殖培养 为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物 至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择 性培养基，选择一定的培养条件来控制。 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维 素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源， 那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常 生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样 对下阶段的纯种分离就会顺利得多。
1. 采样
二、新种分离与筛选的步骤 1. 采样 （2）采样季节
以温度适中，雨量不多的秋初为好。 （3）采土方式 在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取 离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸 袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、 地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中 微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步 分批寄回，以便及时分离。
二、已工业化产品生产菌的介绍
3. 食品酶制剂生产有关的微生物 开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理
试验。关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。
目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食
品用酶。
α -淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢 杆菌和地衣牙孢杆菌
二、已工业化产品生产菌的介绍
4. 常用的基因表达系统 （1）原核生物 大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌
二、已工业化产品生产菌的介绍
2. 氨基酸生产有关的微生物
AK:天冬氨酸激酶 HD:高丝氨酸脱氢酶 HT:高丝氨酸转乙酰酶
黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋 氨酸和异亮氨酸的合成调节机制
二、已工业化产品生产菌的介绍
2. 氨基酸生产有关的微生物 氨基酸生产菌的要求： 代谢途径比较清楚， 代谢途径比较简单 谷氨酸发酵的菌种： 棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌 属或小杆菌属的棒型细菌 其它氨基酸生产菌： 常规菌种一般也是以谷 氨酸生产菌选育而成； 工程菌，大肠杆菌，枯 草芽孢杆菌
分离：利用分离技术得到纯种。
发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包 括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、 发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生 长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。
二、新种分离与筛选的步骤 1. 采样
（1）采样对象
以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼 泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物 的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野 果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物， 腐败物品，某些水域等。
第二节 发酵工业菌种的选育
工业菌种的分离：菌株分离是将混杂着各种微生 物的样品按照实际需要和菌株的特性采取迅速、 准确、有效的方法对它们进行分离、筛选。进而 得到所需微生物的过程。 工业菌种的育种：是运用遗传学原理和技术对 某个用于特定生物技术目的的菌株进行的多方 位的改造。通过改造，可使现存的优良性状强 化，或去除不良性质或增加新的性状。
二、新种分离与筛选的步骤 3. 培养分离 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生 物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。 在这—步，增殖培养的选择性控制条件还应进 一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种 分离的方法有划线分离法、稀释分离法。
二、新种分离与筛选的步骤 4. 筛选 这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件， 通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适 合于工业生产用菌种。