RNA的制备及纯度的鉴定-PPT精品文档
实验七酵母rna的提取及鉴定.doc
实验七酵母rna的提取及鉴定.doc一、实验原理RNA是核酸的一种，在细胞中负责遗传信息的传递和蛋白质的合成。
RNA可分为信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)和转运RNA(tRNA)等多种类型，酵母菌中大部分RNA是rRNA 和tRNA，也存在少量的mRNA。
提取酵母RNA需要破解细胞壁和细胞膜等结构，并且细胞内含有大量核酸酶，因此提取纯度较高的RNA比较困难。
RNA的提取可以通过化学方法和物理方法两种方式实现。
化学方法主要是利用离子交换、酚-氯仿提取、硅胶柱层析等技术，较为复杂且需要一定的技术经验；物理方法主要是利用超声波、玻璃珠破碎法等技术，可以快速有效地提取RNA。
本实验采用物理法加化学法结合的方法提取酵母RNA，并通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的纯度和完整性。
二、实验步骤2.1 材料准备(1) 酵母菌法国版工业菌株(Saccharomyces cerevisiae);(2) TRIzol试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司);(3) 稀释HCl溶液(3 mol/L);(4) 75%(w/v)的酸性酚;(5) 氯仿;(6) 层析级异丙醇;(7) 等电聚丙烯酰胺缓冲液(pH 7.0，0.025 mol/L Tris/HCl，0.192 mol/L草酸二钠，0.0025 mol/LEDTA)。
2.2 RNA提取(1) 取一支含3 mL YPD液体培养基的酵母菌液，在恒温摇床上培养至OD600=0.8-1.0。
收集菌体，迅速离心10 min，将菌体沉淀在低温下保存。
(2) 在无菌条件下，向2mL微离心管中加入500μl冰冻的脚本称重的玻璃珠，加入250μl TRIzol试剂，加入500μl氯仿混合液(高速离心样品质量的20%)。
(3) 用冰缓慢振荡离心管10次，将离心管放置于室温下2min，加入250μl乙醇混合液(浓度为75%)搅拌溶解沉淀。
(4) 将悬液转到色谱柱上(色谱柱预先加入2 g等体积的硅胶)，离心管内加入250μl TRIzol试剂并重复以上操作，将悬液转移到同一色谱柱上。
RNA提取,RT-PCR实验报告
RNA 制备及其鉴定实验目的初步掌握组织总RNA 制备的原理及其基本方法，掌握RNA 纯度鉴定的基本方法。
实验原理细胞内的RNA 通常与蛋白质结合，以核蛋白（RNP ）的形式存在。
分离制备RNA 时，首先必须破碎细胞，使RNP 释放到溶液中并与蛋白质分离，释放到溶液中并与蛋白质分离，然后将然后将RNA 同其他的细胞成分分离开并保证RNA 的完整性。
本次实验我们选用了Trizol 法分离提取小鼠肝组织的总RNA ，Trizol 法分离提取的RNA 产率高、纯度好且不易降解。
评价RNA 质量的标准是RNA 的均一性和完整性。
均一的RNA 取决于有效的去除RNA 提取物中的DNA 、蛋白质和其他杂质；完整的RNA 取决于最大限度地避免纯化过程中内源性及外源性RNA 酶对RNA 的降解。
通常采用紫外分光光度法测定RNA 的浓度和纯度，纯RNA 的A260/A280=2.0，但由于所用的标本不同，此比值有一定的变化，此比值有一定的变化，一般在一般在1.8~2.0之间，低于改值表明有蛋白污染，需进一步用酚/氯仿抽提。
RNA 的完整性可通过琼脂糖电泳法进行鉴定。
完整的RNA 电泳时，28S 和18SrRNA 经EB 染色后，两条电泳条带的显色强度近似为2比1。
本实验中几个重要试剂的作用：Trizol 试剂：Trizol 的主要成分是苯酚、异硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸钠、β-巯基乙醇、醋酸钠、柠檬酸钠。
它的主要作用是1、裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释放。
2、使蛋白质变性，有利于DNA 和RNA 与蛋白质的分离。
3、抑制内源和外源RNase 。
氯仿：氯仿的作用有多个方面，一、作为有机溶剂变性蛋白，使其沉淀并通过离心除去。
二、通过变性作用抑制RNase 活性；三、通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提掉；四、作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质（比如油脂、脂溶性色素等），起到一定除杂作用。
异丙醇：异丙醇是沉淀核酸用的，作用和乙醇一样。
总RNA 的提取电泳检测及浓度和纯度的测定
总RNA 的提取、电泳检测及浓度和纯度的测定撰写人：黄晶一、实验原理1、总RNA的提取见分子克隆（第三版）上册P522 “用一步法从细胞和组织中同时制备DNA、RNA和蛋白质”2、RNA的电泳见分子克隆（第三版）上册P540 “按大小分离RNA: 在含有甲醛的琼脂糖凝胶上进行的RNA电泳”3、RNA的浓度及纯度测定见分子克隆（第三版）下册P1695 “DNA或RNA的分光光度法测定”二、实验准备1、配制0.1%的DEPC水，37℃培养箱内放置过夜，之后灭菌两次。
2、准备大、中、小进口枪头各一盒，1.5ml进口离心管、0.2ml 进口PCR管各一瓶，灭菌两次（公用）3、准备研钵（n）、勺子（n+1）、50ml、100ml量筒各一个，180℃烤4小时以上（n=提取RNA的个数）4、10×MOPS缓冲液、甲醛、30％双氧水、胶布、氯仿（sigma）、异丙醇（sigma）、75％乙醇（以上试剂及物品公用，实验前请确定其是否齐备）三、实验步骤（一）总RNA的提取1．液氮研磨组织，取100mg组织，加入1ml Trizol，室温放置5min2．加入200ul氯仿，剧烈振荡混匀，室温放置3min，之后4℃，12000g,离心15min 3．上清移入新管，加入1/5体积的氯仿，剧烈振荡混匀，室温放置3min, 之后4℃，12000g,离心15min4．上清移入新管，加入等体积的异丙醇，混匀，室温放置10min,之后4℃，12000g,离心15min5．弃上清，加入1ml 75%乙醇，振荡，4℃，7500g,离心5min6．弃上清，室温晾干，之后加入40ul DEPC水溶解（RNA不要完全干燥，否则不利于溶解）（二）RNA的电泳1．用3％-30％的双氧水浸泡RNA专用的电泳槽及胶板、梳子10分钟以上2．之后用0.1%的DEPC水洗涤3．配制1.2%的含有甲醛的琼脂糖凝胶1）称取0.36g RNA专用的琼脂糖，加入24ml DEPC水，熔化后冷却到60℃2）加入3ml 10×MOPS，混匀后再加入3ml甲醛，之后再加入3ul EB4．用DEPC水配制1×MOPS 100ml作为电泳缓冲液，55V 预电泳30-40min5. RNA电泳样品的制备1）将6ul RNA样品、1ul 10×MOPS、1ul甲醛、2ul RNA上样缓冲液混匀2）65℃加热10min,之后冰浴2min,短暂离心后可上样6．60V 电泳30-40min7．紫外检测（三）RNA浓度及纯度的测定1. 运行分光光度计中测定RNA的程序2. 200ul DEPC水作为空白, 5ul RNA样品+295ul DEPC水作为测量样品3. 测量的RNA样品的OD260/280应在1.8-2.0之间4. RNA样品的实际浓度等于分光光度计显示浓度ｘ60四、注意事项1. 整个实验过程中要戴口罩、一次性手套，一次性手套应经常更换，防止污染RNase2. 实验试剂及物品大多数为公用，请养成良好的实验习惯，用毕放回原处，试剂或物品用完或快用完，告知负责人，及时补充3．烤箱不能过夜工作，以免发生火灾4．DEPC为疑似致癌物，操作时应戴口罩、手套，小心吸取，避免污染实验台及物品注：10×MOPS的配制方法0.627g MOPS溶于12ml DEPC水中，加入1.2ml 1M NaAc (DEPC水配制)，用2M NaOH 调pH 7.0, 加入0.75ml 0.2M EDTA, 之后加入DEPC水定容为15ml。
TRIZOL法提取总RNA PPT课件
• RNase inhibitor
0.5μl
• 逆转录酶
1μl（200U）
• Oligo(dT)15引物
1μl
• 总RNA
1பைடு நூலகம்g
• 加无核酶水至总体积 20μl
• 涡旋混匀，42℃反应15分钟，95℃加热5分钟，0-5℃5分 钟。
2.PCR:
GAPDH (sense)
cDNA rTaq
GAPDH
AAAAAAAAAA-3’ TTTTTTTTTT-5’
TRIZOL法提取总RNA
简介
• 研究基因的表达和调控时常常要从组织和 细胞中分离和纯化RNA。
• RNA 质 量 的 高 低 常 常 影 响 cDNA 库 ， RTPCR和Northern Blot等分子生物学实验的 成败。
• Trizol是直接从细胞或组织中提取总RNA 的 试剂，内含异硫氰酸胍，酚等物质，异硫氰 酸胍能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎。 核酸由于核蛋白二级结构的破坏而解离下来。 异硫氰酸胍同时抑制细胞释放出的核酸酶， 保持RNA 的完整性。在酚和氯仿作用下离 心，样品分成水样层和有机层。RNA存在 于水样层中。收集上面的的水样层后，用异 丙醇沉淀火的RNA
• 故根据OD 260 /OD 280的比值可以估 计核酸的纯度：
DNA样品的比值为1.8， RNA样品的比 值为2.0。若DNA样品的比值高于1.8，说明 样品中含有RNA污染， 若RNA样品比值高 于2.0，则提示RNA 有降解。RNA、DNA溶 液中含有酚和蛋白质将导致比值降低。
实验步骤
• 取适当体积（2ul）核酸样品，加水或（TE） 至100ul，混匀。
（约50℃）倒入，室温冷却凝固。
（4）将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖 凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。
rna的鉴定实验报告
rna的鉴定实验报告RNA的鉴定实验报告引言：RNA（核糖核酸）是一种重要的生物分子，它在细胞内起着传递遗传信息和蛋白质合成的关键作用。
为了深入了解RNA的结构和功能，本实验旨在通过一系列鉴定实验，对RNA进行详细的分析和研究。
实验一：RNA的提取与纯化首先，我们从细菌或植物细胞中提取RNA。
这一步骤的关键是使用合适的缓冲液和酶来破坏细胞膜和核膜，释放出RNA。
随后，通过离心等手段，将RNA从其他细胞组分中分离出来。
最后，通过酒精沉淀法将RNA纯化，去除杂质。
实验二：RNA的电泳分析为了确定提取到的RNA的纯度和完整性，我们进行了RNA的电泳分析。
首先，将RNA样品与一定浓度的缓冲液混合，然后将混合物加载到琼脂糖凝胶上。
随后，通过电场作用，RNA在琼脂糖凝胶中移动，根据RNA分子量的不同，形成不同的条带。
最后，通过紫外光照射，观察和记录RNA的分离情况。
实验三：RNA的逆转录与扩增为了进一步研究RNA的表达情况，我们进行了RNA的逆转录与扩增实验。
逆转录是将RNA转化为DNA的过程，通过引入逆转录酶和适当的引物，将RNA的信息转录成相应的DNA序列。
随后，通过PCR（聚合酶链式反应）扩增DNA，使其数量增加，以便进行下一步的分析和研究。
实验四：RNA的序列测定为了确定RNA的具体序列，我们进行了RNA的序列测定实验。
通过使用高通量测序技术，我们能够快速、准确地测定RNA的碱基序列。
这一步骤的关键是将RNA转化为cDNA，并引入特定的DNA引物，然后通过测序仪对DNA进行测序。
最终，我们可以得到RNA的详细序列信息。
实验五：RNA的功能研究在了解RNA的序列后，我们进行了RNA的功能研究。
通过生物信息学分析和实验验证，我们可以确定RNA的功能和作用机制。
例如，我们可以通过敲除实验来验证某个RNA在细胞中的功能，或者通过RNA干扰技术来研究RNA对基因表达的调控作用。
结论：通过一系列的实验，我们对RNA进行了全面的鉴定和研究。
2024人教版化学《核酸》PPT完美课件新教材1
人教版化学《核酸》PPT完美课件新教材1contents •核酸概述与分类•核酸组成单位-核苷酸•DNA结构与功能解析•RNA结构与功能解析•核酸提取、纯化和鉴定方法•核酸在生物技术中应用前景目录核酸概述与分类核酸定义及功能核酸定义核酸功能核酸种类与结构特点核酸种类结构特点生物体内核酸分布及作用分布DNA主要分布在细胞核中，少量存在于线粒体和叶绿体中；RNA主要分布在细胞质中，包括mRNA、tRNA和rRNA等多种类型。
作用DNA作为遗传信息的载体，负责储存和传递遗传信息；RNA则参与蛋白质合成过程，包括转录和翻译等步骤。
此外，RNA还在基因表达调控、细胞信号传导等方面发挥重要作用。
02核酸组成单位-核苷酸磷酸基团五碳糖碱基030201核苷酸基本结构核苷酸种类与命名规则核苷酸种类命名规则核苷酸的命名通常由碱基名称、五碳糖类型和磷酸基团数目三部分组成，如腺嘌呤脱氧核糖核苷酸。
核苷酸间连接方式磷酸二酯键碱基配对DNA结构与功能解析DNA双螺旋结构特点双链反向平行碱基互补配对主链与碱基对之间的空间关系螺距与旋转角度遗传信息的编码遗传信息的稳定性遗传信息的多样性遗传信息的可变性DNA遗传信息储存原理复制和修复的意义DNA 复制和修复机制对于生物体的遗传信息传递、生物进化以及维持生命活动的正常进行具有重要意义。
DNA 复制以亲代DNA 为模板，在DNA 聚合酶的催化下，按照碱基互补配对原则合成子代DNA 的过程。
复制过程具有半保留性和半连续性。
DNA 修复生物体在进化过程中形成了一套完善的DNA 修复机制，包括直接修复、切除修复、重组修复和跨损伤修复等，以维持基因组的稳定性和完整性。
复制与修复的关系DNA 复制过程中可能出现错误配对或损伤，此时需要启动DNA 修复机制进行纠正。
同时，DNA 修复机制也可以保证复制过程的顺利进行。
DNA 复制和修复机制RNA结构与功能解析RNA单链结构特点作为信使RNA（mRNA），携带遗传信息并指导蛋白质合成作为转运RNA（tRNA），携带氨基酸进入核糖体并识别mRNA上的遗传密码作为核糖体RNA（rRNA），与核糖体蛋白共同组成核糖体，提供蛋白质合成的场所RNA在蛋白质合成中作用不同类型RNA功能介绍mRNA（信使RNA）tRNA（转运RNA）rRNA（核糖体RNA）其他非编码RNA核酸提取、纯化和鉴定方法核酸提取方法比较酚氯仿抽提法离心柱法磁珠法纯化策略及操作注意事项去除蛋白质使用蛋白酶K消化或有机溶剂去除蛋白质杂质。
实验1动物组织总RNA的制备及检测
实验1动物组织总RNA的制备及检测实验1 动物组织总RNA的制备及检测实验⽬的：使学⽣掌握从动物新鲜组织，采⽤Trizol抽提法制备总RNA的实验技术，以及⽤紫外分光光度法检测RNA的纯度及定量、⽤琼脂糖电泳法检测RNA的完整性及质量。
实验原理：Trizol是⼀种新型的总RNA即⽤型制备试剂，适⽤于从各种组织或细胞中快速分离总RNA。
Trizol内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
Trizol，在样品裂解或匀浆过程中，TRIzol能保持RNA完整性。
加⼊氯仿后，溶液分为⽔相和有机相，RNA在⽔相中。
取出⽔相，⽤异丙醇可沉淀回收RNA。
Trizol。
Trizol试剂可⽤于⼩量样品（50~100mg组织、5×106细胞），也可⽤于⼤量样品（≥1g组织或≥107个细胞），对⼈、动物、植物和细菌、⾎液提取都适⽤，可同时处理⼤量不同样品。
⼀个⼩时内即可完成反应，提取的总RNA没有DNA和蛋⽩质污染，可⽤于Northern blot、RT-PCR、Dot blot、RNase保护分析等。
实验材料：1、器械处理[1].⽤于RT-PCR的玻璃器⽫常规洗净后，在烤箱内180℃⼲烤10h。
[2].所有塑料器材（如Eppendorf管、Tips吸头、PCR薄壁管）均为新购产品，使⽤前⽤0.1%焦碳酸⼆⼄酯（DEPC）浸泡12h，⾼压消毒、烘⼲。
[3].⽤于提取RNA的氯仿、异丙醇均为新包装。
[4].75%的⼄醇由25ml 0.1% DEPC⽔与75ml⽆⽔⼄醇混匀配制⽽成，4℃保存。
2、试剂配制[1].0.1% DEPC⽔：1ml DEPC加⼊900ml双蒸⽔，定容⾄1000ml混匀，室温密封保存。
[2].⽆RNase⽔：0.1% DEPC⽔，37℃过夜，⾼压20min，去除DEPC。
[3].5×TBE缓冲液：0.45M Tris-硼酸，0.01 M EDTA。
配制：54g Tris，27g 硼酸，20ml 0.5MEDTA (pH8.0)，⽤双蒸⽔或⽆RNase⽔定容⾄1000ml，室温保存，⽤时10×稀释。
RNA完整性与纯度
高质量RNA的标准real time RT-qPCR 是检测样本中特定基因表达量的有效方法，包含逆转录步骤和定量PCR步骤。
好的开始是成功的一半，获得高质量的、能正确反应样品中转录情况的RNA，对于其后的定量结果，自然是非常重要的。
Mikael Kubista，教授, R%26amp;D TATAA Biocenter主任：RNA质量包含两个方面：样品的纯度和RNA的完整性。
样品纯度可以在样品稀释时得到改善。
我们通常通过Nanodrop测量吸光值来检测纯度。
260/280吸光值的比率应该在2至2.1的范围内，并且是%26ldquo;漂亮%26rdquo;的吸光光谱曲线。
230nm吸收峰应该低。
我们通过利用Experion (Bio-Rad)记录电泳图（electropherogram）检测RNA的质量。
当然，最理想的结果是得到很清晰的18S 和28S峰值。
但RNA的完整性是无法改善的，保存样品、固定样品和来源于富含降解酶的器官的样品RNA完整性通常不好。
检测RNA质量的两个原因，一是想要知道某一个实验得到的RNA质量，从而选择适当的RT-qPCR方法，二是识别出研究中的样品的质量是否比正常情况差，避免导致偏差或者不正确的结果。
Jo Vandesompele，根特大学医院（Ghent University Hospital）医学遗传学中心高质量的RNA应该是完整的、不含抑制剂的。
我们习惯利用毛细管凝胶电泳系统来评价28S和18S条带的比率，过程很快速并且只需要很少量的RNA。
值得注意的是，这个比率是组织或者细胞特异的，所以理想的是你应该将样品与一个同样细胞来源的完整对照比较。
在芯片分析（微阵列研究）中通常都要求进行RNA质量分析，现在许多定量PCR领域的人们开始考虑RNA质量这个因素。
我们最近在发表的文章说到评价用于PCR分析的RNA的质量尤为重要，这是由于并非每个基因降解水平都相同，严重时甚至可以使你的实验结果出错(Perrez-Novo et al., 2005)。
RNA的制备及纯度的鉴定
rna技术的挑战与展望
技术瓶颈
目前rna提取和纯化仍存在技术瓶颈，需要进一步优化和改进。
数据解读
随着测序数据的爆炸式增长，如何准确解读和分析rna数据成为一 大挑战。
伦理与法律问题
随着rna技术的广泛应用，涉及伦理、隐私和法律等方面的问题也 日益突出，需要引起重视和解决。
THANKS
感谢观看
通过rna测序技术，可以全面检测生物体在不同生理或病理条件下基因的表达水平，揭示基因表达的 差异和规律。
转录组学研究
rna测序可用于转录组学研究，分析特定组织或细胞类型中所有基因的表达情况，有助于深入了解生 命活动的调控机制。
蛋白质合成研究
翻译调控
rna是蛋白质翻译的直接模板，通过研究rna的结构和修饰，可以了解蛋白质合成的调 控机制，进一步探索生命活动的奥秘。
详细描述
在紫外光谱分析中，rna在260nm处有最大 吸收峰，而蛋白质在280nm处有最大吸收峰 。通过比较两个波长下的吸光度值，可以计 算出rna的浓度和纯度泳分析法
总结词
通过电泳分离rna片段，可以观察rna的完整性。
详细描述
纯度评估可以帮助排除其他杂质 对实验的影响，提高实验的准确 性。
02
紫外光谱分析
03
高效液相色谱
通过测量RNA在260nm和 280nm处的吸光度比值，可以评 估RNA的纯度。
高效液相色谱可以分离和检测 RNA中的各种杂质，从而评估 RNA的纯度。
04
CATALOGUE
rna的应用
基因表达分析
基因表达谱
沉淀方法
加入适量的乙醇或异丙醇，使rna从溶液中沉淀下 来。
洗涤目的
用洗涤剂和盐溶液洗涤沉淀，去除残留在rna上的 杂质和盐离子。
rna制备
rna制备
RNA制备是一种常见的实验技术，用于生成RNA分子的方法。
在RNA制备过程中，首先需要选择适当的模板DNA或RNA，然后通过体外转录或体内转录的方法来合成RNA。
体外转录是指将模板DNA或RNA与适当的反应物（如RNA聚合酶、核苷酸和缓冲溶液）混合，在一定的温度和时间条件下进行反应。
体内转录则是将选定的模板DNA或RNA 导入至细胞，利用细胞内的酶系统来合成RNA。
RNA制备过程中，需要注意控制反应的温度、反应时间以及所需的酶和反应物的浓度。
此外，还需保持反应体系的稳定性，避免杂质的污染。
为了纯化合成的RNA，还可以利用凝胶电泳、柱层析等技术进行分离和纯化。
RNA制备的应用非常广泛。
它可以用于研究基因表达调控、RNA 结构与功能、药物筛选以及某些疾病的诊断等领域。
通过RNA制备技术，科研人员可以获得足够数量和纯度的RNA样品，从而进行后续的分子生物学和生物化学实验。
总之，RNA制备是一项重要的实验技术，通过合成RNA，研究人员可以深入探究RNA的生物学功能及其在细胞过程中的作用。
RNA的提取和鉴定
该方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率 已很低。
2) 在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有 机相而RNA留在水相，而达到分离RNA的目的。
:: color, composition, and layout
根据所用蛋白质变性剂种类不一样分为以下两 种制备方法：
:: color, composition, and layout
200 ul RNA溶液 （冰上）
10ul RNA + 1.5 ul loading buf. 电泳观察
2ulRNA 测吸光度OD260/280
5 ul RNA 用于RT反应 （0.2ml PCR管）
简易TBE电泳观察RNA的完整度 1）制胶：琼脂糖凝胶粉 （0.7%），消毒TBE缓冲液， Goldview显色剂 2）上样：10ul样品（含上样缓 冲液）混匀后，加入凝胶孔中； 上样缓冲液（loading Buffer): 溴酚蓝、二甲苯青FF、蔗糖， 甘油 3）电泳：电泳110V，15min。 4）紫外灯下观察
:: color, composition, and layout
酚对蛋白质的变性作用远大于氯仿，为什么还要 加入氯仿？
:: color, composition, and layout
酚有一定的水溶性，单独用酚抽提会有酚溶解 到水相中，影响后续实验。氯仿是强有机溶剂， 加速有机相与水相分层，去除核酸水溶液中残 余的酚
:: color, composition, and layout
Trizol（异硫氰酸胍-苯酚法）
由苯酚和硫氰酸胍等配制而成的单相的快速抽 提试剂 可在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持 RNA的完整性
2019生物化学实验-酵母RNA的分离、组分鉴定及含量分析.ppt
检验项目
水 解 液 试 剂
嘌呤
1mL
核糖
1mL 苔黑-FeCl3 1mL
磷酸
1mL
NH3·H2O 2mL AgNO3 1mL
不振动 观察现象 白色絮状沉淀
定磷试剂 1mL SnCl2 1-2滴
振荡混匀 室温放置 兰色
反应条件 现 象
沸水浴约10min 鲜绿色
6.RNA含量测定 待测样品适当稀释（如量取100µL RNA水溶液，加2900µL 蒸馏水混匀），用紫外分光光度计分别测定其230nm、 260nm 和280nm 的吸光度值。 可根据自己的样品浓度调整稀释倍数。
酵母RNA的分离、组分鉴定 及含量测定
[实验目的]
1、掌握稀碱法分离酵母RNA的原理与操作过程。 2、了解RNA的组分并掌握定性鉴定的具体方法。 3、学习紫外分光光度法测定核酸含量的原理 和操作方法。
[原理] 1. 核酸分离
为何选用酵母为材料提取RNA? 酵母核酸中主要是 RNA(2.67-10.0% ）， DNA 含量很少，且菌体 易收集，RNA易分离。 从酵母中提取RNA常用方法 稀碱法:利用稀碱使细胞壁溶解,时间短，但RNA易分解。 浓盐法: 加热条件下，利用高浓度盐改变细胞膜的通透性，使
①磷酸与钼酸铵试剂作用产生黄色的磷钼酸铵沉淀 (1mL $ + 1mL定磷试剂)： (NH4)2MoO4 + H3PO4 → (NH4)3PO4·12MoO3↓(黄色) Mo6+
SnCL2
Mo4+
Mo(MoO4)2 (兰色)
② 核糖与地衣酚(orcin)试剂反应呈鲜绿色 (1mL $ + 1mL FeCl3 + 2mL orcin→水浴加热)
实验一、RNA提取及检测
六、注意事项：
1．所有实验过程均须避免Rnase的污染。 2．要避免沉淀完全干燥，否则RNA难以溶解。3.样品量和 Trizol的加入量一定要按步骤（1）的比例，不能随意增加样品 量或减少Trizol量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致 RNA降解。
(9)RNA浓度：用DEPC水稀释100倍，用紫外分光光度计 测定OD值（260nm、280nm 230nm），估算RNA浓度。-70 ℃保存。
总RNA定量方法 RNA在260nm波长处有最大吸收峰。OD值为1相当于
大约40μg/ml的单链RNA。如用1cm光径，用 ddH2O稀释 DNA样品n倍并以ddH2O为空白对照，根据此时读出的 OD260值即可计算出样品稀释前的浓度： RNA（mg/ml）=40×OD260读数×稀释倍数(n)/1000
实验一、RNA提取及检测
一、实验目的
掌握植物RNA RNA提取及检测方法
二、实验试剂及材料
水稻叶片、液氮、Trizol试剂、氯仿、异丙醇、DEPC 水
三、实验器材
恒温水浴锅、PCR仪、台式低温离心机、移液枪、研钵、紫外分 光光度计，一次性手套。
四、实验步骤
采用Trizol法提取RNA(50－100mg组织∕ml trizol)， 以加1ml Trizol为例，操作流程如下：
(1) 研钵加液氮数次至足够冷，加入样品，研磨至粉末。 加入Trizol（每100mg组织加1ml的Trizol），充分研磨， 放在室温下解冻。
(2) 除不溶性物质：2～8ºC下12000g离心10min，不溶性 物质沉淀，将RNA的上清移入1.5 ml离心管中。
RNA纯度的测定
1）检测RNA溶液的吸光度280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。
一般的，我们只看OD260/OD280（Ratio，R）。
~时，我们认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当你用Tris 作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是<的）。
当R<时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，你可以根据自己的需要决定这份RNA的命运。
当R>时，说明RNA已经水解成单核酸了。
如果RNA的量够，可在260nm（A260）用分光光度法测定RNA的得率，1个单位等于40ug/mlssRNA。
纯RNA的A260/A280的比值为。
A260/A230的比值还表明RNA的纯度，其值小于表明裂解液中有亚硫氰胍和belta-巰基乙醇残留，其值大于，需用乙酸盐，乙醇沉淀RNA。
2）RNA的电泳图谱一般的，RNA的电泳都是用变性胶进行的，但是根据我的经验，如果你仅仅是为了检测RNA 的质量是没有必要进行如此麻烦的实验的，用普通的琼脂糖胶就可以了。
电泳的目的是在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值，或者是mRNA smear的完整性。
一般的，如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且28S 的亮度在18S条带的两倍以上，我们认为RNA的质量是好的（见下图）。
以上是我们常用的两种方法，但是这两种方法都无法明确的告诉我们RNA溶液中有没有残留的RNA酶。
如果溶液中有非常微量的RNA酶，用以上方法我们很难察觉，但是大部分后续的酶学反应都是在37度以上并且是长时间进行的。
这样，如果RNA溶液中有非常微量的RNA 酶，那么在后续的实验中就会有非常适合的环境和时间发挥它们的作用了，当然这时你的实验也就完了。
下面，我们介绍一个可以确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法。
3）保温试验方法很简单的，按照样品浓度，从RNA溶液中吸取两份1000 ng的RNA加入至 ml的离心管中,并且用的Tris缓冲液补充到10 ul的总体积，然后密闭管盖。
RNA提取准备工作及注意事项
一、枪头和EP管等的消毒灭菌1、用去离子水配制0.1%（千分之一）的DEPC（剧毒物），须在通风橱中小心使用，避光，密闭4℃保存;DEPC水是用DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压消毒的MiliQ纯水。
经检测不含RNase、DNase和proteinase。
2、将枪头和EP管放入0.1%的DEPC内，保证枪头和EP管内都充满0.1%的DEP,3、避光、静置、过夜（12-24 h）4、装枪头和EP管的盒子不需要用DEPC浸泡，将枪头或者EP管内的DEPC水大致去除干后，装起，包好5、121摄氏度，30min6、180摄氏度，干燥数个钟头（至少3小时以上）。
注意：a、处理DEPC时需要戴乳胶手套、口罩！b、或者不用DEPC消毒，130℃，90min高压灭菌（许多实验室高温灭菌两次）二、RNA提取注意事项1、组织RNA 抽提失败的两大现象是：RNA 降解和组织内杂质的残留。
关于降解问题，首先看一下为什么从培养细胞中抽提RNA 不容易降解。
现有的RNA 抽提试剂，都含有快速抑制Rnase 的成分。
在培养细胞中加入裂解液，简单的混匀，即可使所有的细胞与裂解液充分混匀，细胞被彻底裂解。
细胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住细胞内的Rnase，所以RNA 得以保持完整。
也就是说，培养细胞由于很容易迅速与裂解液充分接触，所以其RNA 不容易被降解；反过来讲，组织中的RNA 之所以容易被降解，是因为组织中的细胞不容易迅速与裂解液充分接触所致。
因此，假定有一种办法，在抑制RNA 活性的同时能使组织变成单个细胞，降解问题也就可以彻底解决了。
液氮碾磨就是最有效的这样一种办法。
但是，液氮碾磨方法非常麻烦，如果碰到样品数比较多的时候更加会有此感觉。
这样就产生了退而求其次的方法：匀浆器。
匀浆器方法没有考虑细胞与裂解液接触前如何抑制Rnase 活性这个问题，而是祈祷破碎组织的速度比细胞内的Rnase 降解RNA 的速度快。
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实验原理
• 细胞内大部分RNA 均与蛋白质结合在一起，以核蛋白的 形式存在。因此分离RNA时必须使RNA 与蛋白质解离， 并除去蛋白质。 • 最常用含水的酚溶液除去蛋白质，去污剂和酚均能抑制 RNA酶活力，有利于制备核酸大分子，以酚水两相系统 分离RNA是将细胞或细胞器置于含有SDS的缓冲盐溶液 中，加等体积水饱和的酚，通过剧烈振荡，然后离心形成 上层水相和下层酚相。 • 实验所用的0.15mol/L缓冲盐溶液系统可使大部分核糖核 蛋白解离，在用酚处理时脱氧核糖核蛋白变性；在低温条 件下，从水相中除去，这样得到的RNA 制品中混杂的 DNA量极低
内共有三种RNA，即编码特定蛋白质序列的信使RNA；
能特异性解读mRNA中的遗传信息、将其转化成相应氨
基酸后加入多肽链中的转运RNA；直接参与核糖体中蛋
白质合成的核糖体RNA。
• mRNA的选择性拼接
合成类RNA
RNA的生物合成
RNA/DNA诊断仪
实验目的
• 1 掌握从动物组织中提取RNA的基本原理和操作
样品液 RNA 含量（ g/mL ） 总体积（ mL ） RNA 质量分数 100 % 6 新鲜肝重（ g ） 10
操作参照表
注意事项
• 1：在操作中当加入变性剂氯仿后，为了保证核酸样
品的完整性，操作要轻，尤其在提DNA时，更要避
免剧烈操作
• 2：在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要 强于异丙醇，所以一般用2V乙醇沉淀，但在多糖、 蛋白含量高时，用异丙醇沉淀可部分克服这种污染 ，尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白
RNA提取流程
2克动物肝脏组织
研碎
加氯仿异戊醇震荡 离心取上清液
加20mlSDS缓冲盐溶液
加2%乙酸钾乙醇溶液
倒入磨口具塞锥形瓶
放置沉淀离心
加同体积含水酚溶液
洗涤沉淀离心干燥
室温剧烈震荡10分钟
将RNA溶于蒸馏水
水浴分层并离心
得上清液
离心得粗品
• 二.实验过程
• 1.取2g动物肝脏组织，剪成小块，在乳钵种研碎，加 20mLSDS-缓冲盐溶液（见试剂1.）使成均浆，倒入磨口 具塞锥形瓶内，再加同样体积的含水酚溶液，室温下剧烈 振荡10分钟。 • 2.置冰浴中分层，在0-4℃下，以4000rpmn离心15分钟。 吸出上清液，加等体积氯仿－异戊醇，室温下剧烈振荡10 分钟，以4000rpm离心5分钟，或在室温下放置10分钟使 分层。吸出上清液（若有必要，该操作可反复多次），加 2倍体积2% 乙酸钾的乙醇溶液，在冰浴中放置1小时使 RNA沉淀，此沉淀液可在冰箱内较长期存放。
• 3.若要得到干燥制品，可将沉淀液以4000rpm离心10分钟 ，倾去上清液。沉淀用少许75%乙醇、95%乙醇、无水乙 醇各洗1次，同上法离心，倾去乙醇后，空气干燥。 • 4.将RNA（准确称取30mg左右RNA干燥制品）溶于5～10mL 蒸馏水中，离心除去不溶性杂质，得RNA粗品。 • 5.RNA纯度的鉴定 • 一、RNA标准曲线的制定 取8支试管，编号，按表加入试剂。加毕，摇匀，置沸水 浴中加热15min，冷却，测OD670值。以OD670值为纵 坐标，RNA含量（ug/ml）为横坐标绘制标准曲线。
二、制品的测定 取0.2~0.5ml制品液于试管中，加蒸馏水稀释至2ml，然后加 2ml地衣酚试剂摇匀，于沸水中煮沸15分钟，冷却，测OD670 。根据测得的吸光度，从标准曲线上查出相当该吸光度的RNA 的含量。 三、 RNA含量的计算 根据测得的光吸收值，从标准曲线上查出相当该光吸收值的 RNA含量。按下式计算出制品中RNA的百分含量： 样品液RNA含量(ug/ml)=标准曲线查到的值× 稀释倍数
生物制药09303 第七组 指导老师：陈芬
（一） 操 作 方 法
1.背景知识
6.思考问题
2.基本原理
RNA的制备及 纯度的鉴定
5.注意事项
3.仪器试剂
4.工艺过程
背景知识
核糖核酸，简称RNA，主要以单链的形式存在于生物体
内,其高级结构很复杂,它们既担负着储藏及转移遗传信
息的功能,又能作为核酶在细胞内发挥代谢功能。生形瓶 (500ml) 天平 、 离心 机（4000rpm）动物肝脏 、紫外可 见分光度计、恒温水浴锅
试剂：
1.SDS-缓冲盐溶液［0.3%SDS-0.1mol/L氯化钠 -0.05mol/L， pH5.0乙酸盐缓冲液］称取1.5gSDS，2.92g氯化钠，2.05g乙酸钠 溶于水中，用乙酸调至pH5.0，最后定容至 500ml。 2.含水酚液：使用前将苯酚重蒸(酚的沸点为181.8℃)并用SDS－缓 冲盐溶液使其饱和。 3.氯仿-异戊醇液：氯仿：异戊醇=24:1(V/V)。 4.含2%乙酸钾的95%乙醇溶液。 5.75%乙醇，95%乙醇、无水乙醇。 6.乙醚 7.RNA标准溶液（须经定磷确定其纯度）：取酵母RNA配成200 g/mL的溶液。 8.地衣酚试剂：先配制0.1%三氯化铁的浓盐酸（分析纯）溶液，实 验前用此溶液作为溶剂配成 0.1%地衣酚溶液。
实验步骤
• 一.实验前的准备 • mRNA的分子结构容易受到RNA 酶的攻击反应而 降解,加上RNA 酶极为稳定而且广泛存在,因此在 提取过程中应严格防止RNA 酶的污染并设法抑制 其活性。 • 所用的玻璃器皿需要置于干燥烘箱中 200.0° C烘 烤两小时以上,凡是不能用高温烘烤的材料如塑料 容器等可用0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶 液处理，再用蒸馏水冲净。
•
RNA制品继续用氯仿－异戊醇处理，可以进一步除去其 中含有的少量蛋白质。最后用乙醇使RNA自水溶液中沉 淀下来。
• 实验所得制品的核酸含量可用地衣酚显色法测定RNA含 量 。RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继 而转变为糠醛，后者与3，5-二羟基甲苯（地衣酚）反应 呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂，反应 产物在670nm处有最大吸收。RNA在20～250 g范围内， 光吸收与RNA的浓度成正比。