DNA的粗提取与鉴定

其中除第八步外，其余均要朝一个方向搅拌， 在第三、五步搅动还要轻缓，玻璃棒不要直 插烧杯底部，这样才能保证得到完整的DNA
（2）为什么反复地溶解与析出DNA，能够去 除杂质？
答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高 盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出， 能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过 反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解 度不同的多种杂质
答：过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质； 得到的是与蛋白质等物质结合在一起的DNA
②溶解细胞核内的DNA
将氯化钠的物质的量浓度为 2 mol的溶40mL 加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌 1min，使其混合均匀，这时DNA在溶液中呈 溶解状态
③析出含DNA的粘稠物
沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒不停 地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现，注意观 察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中 出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时 停止加入蒸馏水（这时溶液中氯化钠的物质的量 浓度相当于0.14 mol／L）
⑤将DNA的粘稠物再溶解
取 1个 50 mL烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物 质的量浓度为 2 mol／L的溶液 20mL。用钝头 镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻 璃择不停地搅拌，使粘稠物尽可能多地溶解于溶 液中
⑥过滤含有DNA的氯化钠溶液
取1个100 mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗 过滤步骤5中的溶液。取其滤液，DNA溶于 滤液中
讨论： （1）为什么要加入蒸馏水？加入蒸馏水后细胞 会有什么变化？
答：让细胞内浓度大于周围溶液的浓度，细胞 会吸水以至胀破 （2）用玻璃棒搅拌有什么意义？
答：用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的 破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能 太快太猛，防止打碎DNA （3）滤去的是什么物质？得到的是什么？
4、课前准备鸡血细胞液
①过程
取质量浓度为0．1g/ml的柠檬酸纳溶液（抗凝 剂）100ml，置于500ml烧杯中。注入新鲜的 鸡血（约180ml），同时用玻璃棒搅拌，使血 液与柠檬酸纳溶液充分混合，以免凝血。将烧 杯中的血液置于冰箱内，静置一天，使血细胞 自行沉淀。（也可以将血液倒入离心管内，用 1000r/min（转每分）的离心机离心2min， 血细胞沉淀于离心管底部。实验时。用吸管除 去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞 液。）
6、DNA在酒精溶液中的溶解性 DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质 则可以溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA 与蛋白质进一步分离 7、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 ①蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响
②大多数蛋白质不能忍受60－80°C的高温， 而DNA在80°C以上才会变性
③洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和 蛋白质,但对DNA没有影响
第一步 第四步 第六步
过滤时使用的纱布层数与需用滤液或黏稠物有 关，第二次要用其滤出的黏稠物有关，所以要 使用多层纱布，第一次和第三次均要用其滤液， 使用的纱布为1－2层
③两次析出
第一次：用0.14 mol／L 的NaCI 溶液含杂质多 第二次：用冷却的95％的酒精
第三步 第七步
④六次搅拌：第一、二、三、五、七步
② DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋 白质可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进 一步提取出含杂质较少的DNA。
③ DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此， 二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
3、实验材料和用具：
鸡血细胞液（5~10ml）；体积分数为95%的冷 酒精溶液（实验前置于冰箱内冷却24h）；蒸馏 水；质量浓度为0．１g/ml的柠檬酸纳溶液；务 质量的浓度分别为2mol/L和0．015mol/L的 氯化纳溶液；二苯胺试剂。铁架台；铁环；镊子； 三角架；酒精灯；石棉网；载玻片；玻璃棒；滤 纸；滴管；量筒（100ml，一个）；烧杯； （100ml，一个，50ml、500ml各二个）；试 管（20ml，二个）；漏斗；试管夹；纱布。
答：血液分为两部分，一部分是血浆，一部分 是血细胞，离心后除去的上清液是血浆
5、方法步骤
①提取鸡血细胞的细胞核物质
将制备好的鸡血细胞液5 mL～10mL，注入到 50 mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20 mL， 同时用玻璃棒充分搅拌5 min，使血细胞加速 破裂。然后，用放有纱布的漏斗将血细胞液过 滤至500mL。取其滤液。
讨论1：构成生物体的遗传物质是什么？ 讨论2：如何证明他们是遗传物质？ 讨论3：怎样才能将细胞内的这些物质分离出来？
DNA的粗提取与鉴定
一、基础知识 （一）提取DNA的方法
1、提取生物大分子的基本思路 选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理 或化学性质的生物大分子 2、生物大分子
主要指蛋白质、酶和核酸
8、DNA的鉴定 ① DNA与二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因 此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂
②紫外灯照射法 A、配制染色剂，用蒸馏水配制万分之五的溴 化已锭（EB） B、将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹于蜡纸上， 再滴一滴EB溶液染色 C、将蜡纸放在紫外灯(260 nm)下照射（暗室 中），可见橙红色的荧光(DNA的紫外吸收高峰 在260 nm处)
三、实验案例 （一）案例一：以鸡血为实验材料进行DNA的 粗提取 1、鸡血细胞做实验材料的原因
①鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得
②鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞 作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求 较高，操作繁琐，历时较长
2、实验原理
① DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的 浓度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为 0.14 mol／L时,DNA的溶解度最低。利用这一原 理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。
2、植物细胞
①植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解 细胞膜 讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？
答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜， 有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl， 有利于DNA的溶解
②实例：提取洋源自文库DNA时，在切碎的洋葱中加 入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研 磨，过滤后收集研磨液
在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶 解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在 0.14 mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液 浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。
②如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液 中溶解或析出？
当氯化钠的物质的量浓度为 2 mol／L时，DNA 的溶解度最大，浓度为 0．14 mol／L时，DNA 的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐 溶液中溶解或析出
3、提取DNA的基本思路
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化 学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分
4、DNA的溶解性
DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶 液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的 盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀， 或者相反
5、讨论：
①根据DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线图， 思考在什么浓度下， DNA的溶解度最小？ DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的？
⑦提取含杂质较少的DNA
在上述滤过的溶液中，加入冷却的、酒精的体积 分数为 95％的溶液 50mL（使用冷却的酒精， 对DNA的凝集效果较佳），并用玻璃棒搅拌， 溶液中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将 丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝 状物的主要成分就是DNA
讨论：
（1）为什么要加50mL的冷酒精？
讨论：为什么反复地溶解与析出DNA，能够去 除杂质
答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高 盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出， 能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反 复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度 不同的多种杂质
讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？
答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而 使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是 DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋 白质变性，与DNA分离
讨论：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样 的影响？ 答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全， 提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到 丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等
（三）去除滤液中的杂质
为了纯化提取的DNA需要将滤液作进一步处理
讨论：此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞 成分？
答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质
（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液
1、动物细胞
动物细胞的破碎较易，例如，在鸡血细胞液中 加入一定量的蒸馏水 ，同时用玻璃棒搅拌，过 滤后收集滤液即可
讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？ 答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体， 水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂， 再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的 破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA
讨论： （1）比较两个试管中溶液的颜色有什么不同？
答：有丝状物的试管变成蓝色，另一试管还是 原来颜色 （2）这一鉴定结果说明什么问题？
答：提取出的丝状物是DNA
（3） DNA的直径约为20×10-10 m，实验中 出现的丝状物的粗细是否表示1个DNA分子直径 的大小？
答： DNA分子直径只有2 nm。丝状物是多 个DNA子聚在一起形成的
6、讨论：
（1）此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过 滤，几次析出，几次搅拌？分别在哪一步？
答：整个实验共“两次蒸馏水，三次过滤，两 次析出，六次搅拌”
①两次蒸馏水
第一次：细胞吸水胀破 第二次：使 DNA黏稠物析出
第一步 第三步
②三次过滤
第一次： DNA存在于滤液里 第二次： DNA被留在纱布上 第三次： DNA存在于滤液里
（四） DNA的析出与鉴定
1、DNA的析出
DNA的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒 精溶液（体积分数为95 ％） ，静置2－3min， 溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取DNA。 用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用 滤纸吸取上面的水
2、 DNA的鉴定
鉴定DNA时在试管中先加入物质的量的浓度为 2mol/L 的NaCl溶液5ml于两只试管中，其中一 只加入DNA丝状物，各加入二苯胺4ml 试剂。 混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min,待试 管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看 看溶解有DNA的溶液是否有蓝色
讨论：加入蒸馏水的目的？
降低NaCl溶液浓度到使DNA溶解度最低点，使 DNA从NaCl溶液中析出
注意事项：
将溶液中的DNA与其他杂质分离，这一步骤是 实验成败的关键。实验中应该缓慢贴壁加入蒸 馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌， 以利于DNA分子的附着和缠绕
④滤取含DNA的粘稠物
用放有多层纱布的漏斗，过滤步骤3中的溶液 至 500mL的烧杯中，含 DNA的粘稠物被留在 纱布上
②柠檬酸钠作用
防止血液凝固
③作用机理
柠檬酸钠能与血浆中的Ca2+发生反应，生成柠 檬酸钙络合物，血浆中游离的Ca2+大大减少， 血液就不会凝固
④注意事项 鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃 容器吸附，所以在提取过程中为了减少DNA的 损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细 胞液
讨论：提取鸡血中的DNA时，为什么除去血液 中的上清液？
答：因为DNA不溶于冷酒精，而其他物质可以 溶解在酒精中，使含杂质较少的DNA丝状物可 以析出,悬浮于溶液中 （2）观察丝状物呈什么颜色？
答：白色
⑧ DNA的鉴定
取两支20 mL的试管，各加入氯化钠的物质的量 浓度为0．015 mol／L的溶液5 mL，将丝状物 放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物 溶解。然后，向两支试管中各加入4mlL的二苯 胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热 5 min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中 溶液颜色的变化
③甲基绿 （绿色）
二、DNA的粗提取与鉴定的实验设计
（一）实验材料的选取
1、材料：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、 哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、 在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选取 2～3种实验材料）
2、原则：凡是含有DNA的生物材料都可以考 虑，但选用DNA含量相对较高的生物组织，成功 的可能性更大