5.第五章miRNAj简介
miRNA综述
micro RNA(miRNA)综述RNA一度被认为仅仅是DNA和蛋白质之间的“过渡”，但越来越多的证据清楚的表明，RN A在生命的进程中扮演的角色远比RNA我们早前设想的更为重要。
RNA干扰（RNA interf erence）的发现使得人们对RNA调控基因表达的功能有了全新的认识，更因为可以简化替代基因敲除而成为研究基因功能的有力工具，因此格外引人注意，在2002年度Science评选的10大科学成就中RNAi名列榜首。
随着对小分子RNA研究的不断深入，研究人员开始认识到：小分子RNA的世界一点都不小。
有人推测：小分子RNA可能代表发现了一个新层次上的基因表达调控方式。
已经有很多文章介绍有关siRNAs以及其在RNA干扰中的作用以及研究应用方法，在这里将介绍另一种越来越引人注目――micro RNA。
什么是miRNAMicro RNAs (miRNAs)是一种大小约21―23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（双链）但是和siRNA密切相关。
据推测，这些非编码小分子RNA（miRNAs）参与调控基因表达，但其机制区别于介导的降解。
第一个被确认的是在线虫中首次发现的lin-4和let-7，随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNAs。
miRNA的特征已经被鉴定的miRNAs据推测大都是由具有发夹结构、约70个碱基大小形成发夹结构的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成的，有5'端磷酸基和3'羟基，大小约21―25nt的小分子RNA片断，定位于RNA前体的3'端或者5'端。
最近3个研究小组分别从线虫、果蝇和Hela细胞中鉴定的100个新miRNAs中，有15%跨越线虫、果蝇和哺乳动物基因组具有高度的保守性（只有有1―2个碱基的区别），Lau和Bart el实验室的同事更加认为：所有的miRNAs可能在其他物种中具有直向同源物（Ortholog，指那些起源于同一祖先，在不同生物体中行使同一功能的基因群就可比作为一个门类，这些类似的基因被称为“直向同源物”）。
microRNA简介
microRNA简介microRNA的发现（Discovery）1993年，Lee，Feinbaum和Ambros等人发现在线虫体内存在一种RNA（lin-4），是一种不编码蛋白但可以生成一对小的RNA转录本，每一个转录本能在翻译水平通过抑制一种核蛋白lin-14的表达而调节了线虫的幼虫发育进程。
对于出现这种现象的原因，科学家们猜测是由于基因lin-14的mRNA的3'UTR区独特的重复序列和lin-4之间有部分的序列互补造成的。
在第一幼虫阶段的末期降低lin-14的表达将启动发育进程进入第二幼虫阶段。
7年后科学家又发现了第二个miRNA－let-7，let-7相似于lin-4，同样可以调节线虫的发育进程。
自从let-7发现以来，应用随机克隆和测序、生物信息学预测的方式，又分别在众多生物体如病毒、家蚕和灵长类动物中发现了成千的miRNAs。
被鉴定的miRNAs均被miRBase网站整理并加以注释。
此网站由著名的Sanger研究所主办，并对公众开放。
（）microRNA的生物起源（Biogenesis）miRNAs起源于内源性表达转录本，是长约21-25nt的双链RNA 分子，其典型特征是具有发卡结构。
图1表述了对当前miRNA和siRNA起源的理解。
miRNA途径开始于一个miRNA基因的pri-miRNA（PrimarymiRNA）转录本（step 1）；这个70－100nt的发卡RNAs（pri-miRNA）在核内被核糖核酸酶Drosha加工处理而最终成为pre-miRNA（Precursor miRNA，）（step 2）；之后pre-miRNA被核输出蛋白exportin 5转运入胞质（step 3），接着被第二个核糖核酸酶Dicer消化为21－25nt的miRNA（step 4）；这个阶段的miRNA可以结合RISC（RNA-Induced Silencing Complex）并与靶标mRNA互补并列（step5－6）；miRNA和靶序列的互补程度决定了靶基因mRNA要不在翻译水平被部分抑制，要不完全断裂（step 7）。
miRNA综述1
MiRNA的研究摘要：miRNA是近年来在多种真核细胞及病毒中发现的一类内源性染色体上的非编码单链RNA,miRNA调节了细胞生长，组织分化，最近的研究表明miRNA参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。
因而与生命过程中发育、疾病有关。
本文主要从miRNA的特征、生成及加工机制、生物功能、miRNA与癌症、miRNA鉴定及功能研究手段、及miRNA展望等方面作一概述。
关键词：miRNA、生物功能、展望、应用、发育miRNA的简介miRNA是一个大家族，是一类长22nt左右的小分子非编码单链RNA的总称，在线虫，果蝇和植物，哺乳动物等真核生物中都有mirna 的发现。
他不编码任何蛋白质，由大约70bt大小的可形成发夹结构的前体加工而来，能够识别特定目标的RNA，使之降解或者与其结合。
从而抑制蛋白质的合成。
达到调控基因的目的。
miRNA在表达上具有组织和时间的特异性。
是调节其他功能基因表达的重要调控分子，在生物的各项生理活动，生长发育过程中发挥着重要作用。
miRNA长度为21~25nt的短序列,能够通过与靶mRNA特异性的碱基互补配对,引起靶mRNA降解或者抑制其翻译,从而对基因进行转录后的表达调控。
miRNA组织特异性和时序性，决定组织和细胞的功能特异性，表明miRNA在细胞生长和发育过程的调节过程中起多种作用。
miRNA的发现早在1993年Lee等人在研究秀丽新小杆线虫（c.lwiggsae）的发育过程中发现了Lin-4基因，他的转录产物为22nt的RNA，次RNA不编码任何蛋白质。
但能时序调控胚胎后期发育。
在2000年，Reinhart等人同样又在线虫（c.elegans）中发现了第二个异时性开关基因Let-7,它也能时序调控线虫的发育进程，它能促进幼虫向成虫的转变，它的转录产物是21nt的RNA分子，在线虫L3（ThirdStageLarvae）早期表达量少，而在L4早期和成虫期表达量却很高，近几年来，随着生物信息学的发展，分子克隆技术的改进和模式物种cDNA文库的建立，美国和德国等科研人员又相继在线虫，果蝇，hela细胞，斑马鱼，拟南芥和水稻等真核模式生物和细胞中找到了上百个相类似的小分子RNA，到目前为止据报道的miRNA已经超过了250个。
mirna茎环法原理(一)
mirna茎环法原理(一)miRNA茎环法原理介绍miRNA（MicroRNA）是一类具有调节基因表达的功能的小分子RNA，其长度为18-24个核苷酸。
miRNA的产生和调控已经成为生命科学研究的热点。
miRNA的表达水平异常与人类疾病的发生和发展密切相关，因此，对于miRNA的研究具有重要的理论和应用价值。
miRNA的检测方法有很多种，其中miRNA茎环法被广泛应用于miRNA的检测研究中。
miRNA茎环法原理miRNA茎环法是一种基于聚合酶链反应（PCR）的miRNA检测方法。
miRNA茎环法的原理如下：1.逆转录反应（Reverse Transcription）：首先，通过一个特定的逆转录酶，将已知序列的逆转录启动引物（RTprimer）与待检测的miRNA结合，产生一个RNA/DNA杂交序列。
这个杂交序列由逆转录酶（reverse transcriptase）催化，将miRNA逆转录合成miRNA cDNA。
2.PCR扩增（Polymerase Chain Reaction）：将逆转录反应产生的miRNA cDNA用于PCR扩增。
PCR反应中的引物包括使用逆转录启动引物的miRNA特异性引物和通用引物。
miRNA特异性引物通过与miRNA cDNA的特定区域互补结合，将miRNAcDNA进行扩增。
通用引物用于扩增miRNA cDNA的其他区域。
经过PCR扩增后，会获得miRNA及其cDNA的大量产物。
3.凝胶电泳（Gel Electrophoresis）：将PCR产物进行凝胶电泳分析。
在电泳过程中，根据PCR产物的分子量和电荷，可以通过移动速度来判断产物的大小。
正常情况下，miRNA和其cDNA的大小是相似的，因此在凝胶上形成一个明显的带状条带。
4.结果分析：通过观察凝胶上的PCR产物，在大小相似的位置上出现的明显条带，可以确定检测的miRNA是否存在。
优点与应用miRNA茎环法作为一种miRNA检测方法，具有以下优点：•高灵敏度： miRNA茎环法采用PCR技术，可以扩增待检测miRNA 的数量，从而提高了检测的灵敏度。
miRNAlncRNAcircRNA的基础知识详解
读书破万卷下笔如有神miRNA、lncRNA、circRNA的基础知识详解miRNA1、背景介绍小分子DNA(miRNA)是一类存在于动植物体内、大小为2l一25 nt的内源性非编码单链小分子RNA，对生物体转录后的基因表达调控起关键作用。
1993年，首次在秀丽隐杆线虫中发现miRNA zBt_4；7年后，在果蝇中发现第2个IIliRNA如t 一7。
在进化中的保守性分析使科学家惊异地发现miRNA如卜7的形成至少需要有Dmsha，DGCR8(Pasha)、Dicer等2种RNA酶(RNaseⅢ)的参与。
Dmsha，DGCR8定位于细胞核内，它能剪切miRNA前体转录物(研一miRNA)，从而释放出具有发夹结构、大小为70 nt左右的pre—miRNA，后者在转运受体Exportin一5(Exp5)的作用下被转运至细胞质，然后被胞质中的另一种RNase Ⅲ蛋白Dicer剪切，最终被船工成成熟的miRNA。
动物的miRNA位于前体mRNA的内含子中，这种安排将使mRNA基因和内含子中miRNA共同转录。
近年来，发现和鉴定的miRNAs越来越多，但植物miRNAs仅占很小一部分，且主要集中于拟南芥和水稻等少数模式植物中，植物miRNA的靶基因大多编码转录因子，与植物的生长、发育密切相关；而在动物和人中发现大量miR—NA，已证实在动物的生长、发育和疾病发生等过程中起重要作用。
2、miRNA的生物功能真核生物miRNA在调节植物对环境胁迫如干旱、盐害和养分的胁迫反应等方面起着重要的作用。
成熟的miRNA先与一种称为RNA诱导沉默复合体(RNA—indlIced silencing complex，R1SC)的复合物结合，再特异性地与目标mRNA结合，引起靶mRNA的降解。
由于植物miRNA与其靶mRNA具有很高的碱基互补性，因而植物miRNA的作用方式可能更像小分子RNA干涉(smallinte如而ng RNA，siRNA).与植物相反，在动物细胞中大多数miRNA与其靶mRNA并不完全互补，miRNA则通过与对应mRNA的3'端非翻译区(3'UTR)结合阻止转录后的翻译，从而起到调节基因表达的作用。
siRNA和miRNA简介
小干扰RNA（small interfering RNA; siRNA） 和微小RNA的异同点
与
的 作 用 机 制 ：
miRNA
siRNA
miRNA与siRNA的区别：
miRNA 产生： 细胞内RNA的固有组 分之一（正常） 内源转录本 发夹状pre-miRNA 单链 siRNA RNAi的活性形式，病毒感染和人工插入 dsRNA之后诱导而产生（异常） 转基因或病毒ＲＮＡ（外源） 长dsRNA 双链，3‘端有2个非配对碱基， 通常为UU 完全互补 较高，一个突变即引起RNAi 沉默效应的改变 RNAi途径 降解靶mRNA 抑制转座子活性和病毒感染 在转录后水平发挥作用，影 响mRNA的稳定性
miRNA调节方式的优点
与蛋白水平的调节相比，更加节省能量
与转录水平调节相比，miRNA调节更迅速，而且是可逆的 内含子所编码的miRNA是一种对基因组资源的高效利用
microRNA基因组分布
60%独立表达 15% 成簇表达 25%的miRNAs位于内含子
植物与动物miRNA的区别
A control: not stained B: wt C: wt + antisense RNA D: wt + ds RNA
Mex-3 mRNA detection in embryos by in situ hybridization
RNAi机制
Dicer
RISC
碱基互补
酶解
加工长链 dsRNA形成 21-23 nt 小片段
miRNA的研究起始于时序调控小RNA（stRNAs）。1993年， Lee等在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegan）中发现了第 一 个 可 时 序 调 控 胚 胎 后 期 发 育 的 基 因 lin-4 。 2002 年 ， Reinhart等又在线虫C.elegan中发现第二个异时性开关基因 let-7。2001年10月《science》报道了三个实验室从线虫、果 蝇和人体克隆的几十个类似C.elegan的lin-4的小RNA基因， 称为microRNA。随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植 物 等 多 种 生 物 物 种 中 鉴 别 出 数 百 个 miRNAs 。 对 一 部 分 miRNAs的研究分析提示：miRNAs参与生命过程中一系列的 重要进程，包括发育进程，造血过程，器官形成，凋亡，细 胞增殖，甚至是肿瘤发生 。
miRNA文献综述1
miRNA研究综述摘要：miRNA是近年来在真核生物和病毒中发现的一类内源性染色体上的非编码单链RNA。
miRNA调节细胞生长，组织分化，最近的研究表明miRNA参及各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。
本文主要从miRNA的生物学特征、生成、功能、miRNA及癌症、miRNA及免疫、miRNA鉴定、miRNA靶基因鉴定等方面作一概述。
关键词：miRNA、癌症、免疫、功能、靶基因miRNA简介：MicroRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子,由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链 RNA前体经过Dicer酶加工后生成，它们在动植物中参及转录后基因表达调控。
miRNA能够通过及靶mRNA特异性的碱基互补配对,引起靶mRNA降解或者抑制其翻译,从而对基因进行转录后的表达调控。
miRNA的组织特异性和时序性，决定组织和细胞的功能特异性，miRNA在细胞生长和发育过程的调节过程中起多种作用。
到目前为止,在动植物以及病毒中已经发现有4361个miRNA 分子。
第一个被确认的miRNA是在线虫中首次发现的lin-4 和let-7，随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNA。
miRNA生物学功能：miRNA分子有以下几个明显特征：[1]广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，它不具有开放阅读框架( ORF) 。
[2]miRNA的长度一般为20-24个nt，但在3’端可以有1-2个碱基的长度变化。
[3]成熟miRNA的5’端有一磷酸基团，3’端为羟基，这一特点使它及大多数寡核苷酸和功能RNA的降解片段区别开来。
[4] miRNA基因在基因组上不是随机排列的，其中一些通常形成基因簇。
来自同一个基因簇的miRNA具有较强的同源性，而不同基因簇的miRNA同源性较弱。
miRNA
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Topic 1
Topic 2
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总结
从前述的诸多信息，我们可以得出一个结论，RNA 不再只是作为DNA与蛋白质之间的中介发挥作用，而 是参与到了基因的表达调控、RNA的定点修饰，以及 染色体的结构组织等各个方面。 短短几年内miRNA研究有了迅速突破，但是对于 miRNA的研究大多还处于理论水平上，对miRNA的实 际应用也有待发展。在今后的研究工作中，可以通过 过量表达和沉默技术研究特殊miRNA的功能，开展更 多的与分子细胞学有关的miRNA研究，这对于我们如 何利用它具有重要意义。
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• miRNA 作用机制：
4. miRNA 介导的mRNA降解与P小体有关 P 小体是真核细胞细胞质中的 RNA 颗粒体，其中富含降解 mRNA 的蛋白质和翻译抑制子，被认为是细胞的mRNA 代谢场 所。在肝细胞中，CAT1mRNA 被肝特异性miR-122所沉默，随 即在P小体中聚集。 5 .miRNA 可激活靶基因的表达 miRNA对靶基因可从正负两方面进行调控，miRNA激活作用与 富含腺嘌呤/尿嘧啶元件(AU richelement,ARE)相关，ARE存在于 多种细胞因子、癌基因、生长因子的3’UTR区，是miRNA活化 翻译的信号。在miRNA 指导下，miRISC 复合物成员如Ago等被 招募到ARE上，激活翻译或上调基因表达。
• MicroRNA MicroRNA (miRNA)是内源性的、长度约为21 －25 个核 苷酸的非编码单链RNA 分子。 • 特征 I. 其5‘端第一个碱基对U有强烈的倾向性，而对G却 有抗性，但第二到第四个碱基缺乏U，一般来讲， 除第四个碱基外，其他位置碱基通常都缺乏C 。 II. miRNA 具有高度的保守性、时序性和组织特异性。 在各个物种间具有高度的进化保守性，并且在茎部 的保守性最强，而在不同组织中表达有不同类型的 miRNA。
miRNA简介
小RNA分子本身又包含了若干类RNA， 根据小 RNA 的生成、结构和功能大约 可分为以下三类： a miRNA （microRNA)
b c
siRNA (short interfering RNA) 其他小RNA
3.MIRNA的生物合成
在哺乳动物细胞内miRNA生成分两步
进行。在细胞核内，编码miRNA的基 因转录成pri- miRNA，我们对miRNA 基因如何转录成为具有发夹结构的 pri-MiRNi知之甚少，研究显示RNA聚 合酶Ⅱ和Ⅲ均可以参与MjRNA的转录。
miRNA合成与作用机理的视频
4.MIRNA的功能
miRNA作为一种新近发现的小分子RNA，其 在生物体内 起着重要的作用。到目前为止， 已明确靶基因及确定功能的MiRNA为数不多。 其中包括线虫中调控幼虫发育过程的Lin-4、 Let7和果蝇中调控细胞生长及凋亡的 Bantam。Lin-4在线虫Ll期表达，可以短暂 下调Lin-14和Lin-28蛋白的表达水平，使线 虫由L1期向L2期转化。Let-7线虫LI~L2期不 存在，出现在L3早期，在L4及成虫期达到 高峰，抑制Lin41蛋白表达水平，从而解除 对Lin-29的抑制，使幼虫向成虫演化。
在果蝇中，Bantam可抑制凋亡蛋白Hid
的表达，从而抑制细胞凋亡、促进细 胞增殖。Li和Carthew发现果蝇细胞Mir7的活化可以导致异位感光受体神经元 的产生，但ERK依赖的Yan蛋白可以抑 制细胞向感光受体神经元的转化。
Leaman发现Mir-2家族可以抑制果蝇胚胎
的凋亡，使胚胎不能正常发育。Kim等向 早期胚胎中注 入2’-O-甲基反义寡核苷酸， 可以 杂交内源miRNA，使其丧失原有功 能，结果发现一个miRNA的突变可以导致 严重的畸形。
miRNA概述
miRNA概述miRNA的研究起始于时序调控小RNA（stRNAs）。
1993年，Lee等在秀丽新小杆线虫（Caenorhabditiselegan）中发现了第一个可时序调控胚胎后期发育的基因lin-4，2002年，Reinhart等又在线虫C.elegan中发现第二个异时性开关基因let-7，2001年10月《science》报道了三个实验室从线虫、果蝇和人体克隆的几十个类似 C.elegan的lin-4的小RNA基因，称为microRNA。
随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNAs。
对一部分miRNAs的研究分析提示：miRNAs参与生命过程中一系列的重要进程，包括发育进程，造血过程，器官形成，凋亡，细胞增殖，甚至是肿瘤发生(Kim, 2005)。
miRNAs是一种21－25nt长的单链小分子RNA，其结构特征如下：广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，它本身不具有开放阅读框（ORF）；成熟的miRNA，5′端有一个磷酸基团，3′端为羟基，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（双链）但是和siRNA密切相关。
成熟的miRNA 5’端的磷酸基团和3´端羟基则是它与相同长度的功能RNA降解片段的区分标志。
miRNA独有的特征是其5＇端第一个碱基对U有强烈的倾向性，而对G却有抗性，但第二到第四个碱基缺乏U，一般来讲，除第四个碱基外，其他位置碱基通常都缺乏C。
MiRNAs具有高度的保守性、时序性和组织特异性。
miRNAs的表达方式各不相同。
线虫和果蝇当中的部分miRNA在各个发育阶段都有表达而且不分组织和细胞特性，而其他的miRNA则表现出更加严谨的时空表达模式（a more restricted spatial and temporal expression pattern）——只有在特定的时间、组织才会表达。
mirna茎环法原理
mirna茎环法原理Mirna茎环法是一种用于检测和鉴定小分子RNA (miRNA) 的浓度和序列的实验方法。
miRNA 是一类短链的非编码RNA，是一种重要的基因调控分子。
miRNA 参与了许多生物学过程，包括细胞生长、分化和凋亡等。
miRNA 的异常表达已经与多种疾病的发生发展相关联，因此，研究miRNA 的表达模式和功能对于疾病的诊断和治疗具有重要意义。
miRNA 参与多种生物学过程的调控，它们通过结合到目标mRNA 上，参与调控mRNA 的翻译和稳定性，从而对基因表达产生影响。
miRNA 和其靶向基因之间的相互作用是一种重要的调控方式。
了解miRNA 和靶向基因之间的相互作用网络对于研究基因调控网络的组成和功能具有重要意义。
miRNA 的浓度和序列是研究miRNA 功能和调控机制的基础。
miRNA的浓度是在细胞中储存和调控miRNA 功能的重要因素。
同时，miRNA 的序列决定了其与靶向基因的互作能力和特异性，因此对miRNA 序列的鉴定是研究miRNA 功能和调控机制的关键。
miRNA 的测量和鉴定方法有很多种，其中miRNA 茎环法是目前最为常用的一种方法。
miRNA 茎环法是一种通过miRNA 的转录和PCR 扩增来鉴定miRNA 序列的方法。
下面将详细介绍miRNA 茎环法的原理和步骤。
miRNA 茎环法的原理是：通过miRNA 的转录生成miRNA 茎环转录体，然后使用PCR 扩增和测序来鉴定miRNA 序列。
miRNA 的转录通过在miRNA 上游引入转录起始位点和miRNA 的体外平版序列构建miRNA 茎环转录体。
miRNA 茎环转录体在体外被转录成RNA，然后通过PCR 扩增和测序来鉴定miRNA 的序列。
miRNA 茎环法的步骤如下：首先，需要设计引物来引导miRNA 的转录和PCR 扩增。
引物应该包含与miRNA 的上游和下游序列互补的序列。
其次，将设计好的引物合成，并进行miRNA 的转录和PCR 扩增。
表观遗传学之miRNA简介PPT文档23页
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29、在一切能够接受法律支配的人类 的状态 中，哪 里没有 法律， 那里就 没有自 由。— —洛克
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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30、风俗可以造就法律，也可以废除 法律。 ——塞·约翰逊
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
表观遗传学之miRNA简介
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26、我们像鹰一样，生来就是自由的 ，但是 为了生 存，我 们不得 不为自 己编织 一个笼 子，然 后把自 己关在 里面。 ——博 莱索
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27、法律如果不讲道理，即使延续时 间再长 ，也还 是没有 制约力 的。— —爱·科 克
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28、好法律是由坏风俗创造出来的。 ——马 克罗维 乌斯
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
谢谢！
miRNA基因的进化与功能多样性
miRNA的功能
随着对于miRNA作用机理的进一步的深入研究 ，以及利用最新的（例如miRNA芯片等高通量）技 术手段对于miRNA和疾病之间的关系进行研究，将 会使人们对于高等真核生物基因表达调控的网络 理解提高到一个新的水平。这也将使miRNA可能成 为疾病诊断的新的生物学标记，还可能使得这一 分子成为药靶，或是模拟这一分子进行新药研发 ，这将可能会给人类疾病的治疗提供一种新的手 段。
化学合成miRNA是近年来研究的一个新热点，已经 成为研究动植物基因家族功能的有用工具，并有 望成为癌症治疗和临床研究的一种新策略
展望
如果miRNA基因正如所发现的miRNA一样多，那 么它很可能在生命活动中具有十分广泛的调节功 能，对基因表达、生长发育和行为等都具有十分 深远和复杂的效应。 植物中的一些微小RNA会通过进食方式进入人体 ，并控制人体的基因活性。这项研究发现，植物 所含有的微小RNA能够通过消化道进入人体血液 和器官组织，然后通过调控人体内靶基因表达的 方式，影响人的生理功能。
stRNA
siRNA
miRNA简介
miRNA（MicroRNAs，微小RNA）是一 些具有调控功能的小型RNA，但是它不编 码蛋白质，其大小长约20~25个核苷酸。
在真核生物中首先被发现 ，它在植物、 动物、真核生物、和一些DNA病毒中都存 在。 miRNA常常来自于前体的一条臂，5′端 或3′端；但是有些前体的两条臂均可被 加工为成熟的miRNA 。
miRNA简介——与靶mRNA的作用模式
1）二者不完全互补，即二者不完全配对结合，主要影响翻 译过程（阻遏翻译）而对mRNA的稳定性无任何影响。这种 miRNA是目前发现最多的种类。如线虫的lin-4。 2）二者完全互补，即二者完全配对结合后，类似siRNA与 靶mRNA的结合，特异性的切割mRNA。如miR39/miR171
miRNA讲稿徐和学生用
• ( 5 ) 最近有报道证实血清或者血浆中游离m i R N A 也是有价值的肿瘤监测指标， 能够稳定地被检 测并且提示肿瘤状态，使m i R N A 作为新的肿瘤 标志物具有较好的应用前景。
miRNA和siRNA区别
• 把疾病相关R N A 作为靶点的药物中，s i R N A 药物15个已经进入实质性的临床研 究。s i R N A 为双链R N A ， 具有与靶 点R N A 互补的结构，完全互补靶向抑制 基因表达，长度与m i R N A类似， 约为 19-25 个碱基对。s i R N A 在体内由酶 解旋为单链． 与靶点mR N A 结合后降解。 s i R N A 和m i R N A 都会抑制m R N A 向蛋白质的翻译． 但是其作用方式却差别 颇大。
miRNA作用方式
• miRNA对其功能靶点的最低要求是，至少7个碱 基与5’端互补结合，就可调控其靶基因。miRNA 与靶mRNA的作用方式有两种。当两者完全互补 时，miRNA的作用方式与RNA干扰相似，即与完 全互补的同源mRNA配对结合，导致靶mRNA降 解。而当miRNA与靶mRNA不完全互补时， miRNA则通过与靶mRNA的3’端非翻译区结合， 阻遏转录后翻译。
• m i R N A 是来自非翻译区域的单 • 链R N A ， 存在于细胞内部。是基因
调控的重要分子。
miRNA*定义
• RNase-III酶Dicer将pre-microRNA剪 切成不完全配对的双链RNA双体 （miRNA:miRNA*),即成熟 microRNA和其互补序列所组成的二 聚体，起作用的是miRNA,选择性整合 RISC中设别靶基因而起作用，而 miRNA*会降解。
关于miRNA的那些概念
关于miRNA的那些概念原创 NJU_LB 阿尔法医学英语前天经过前面几期外泌体推送的介绍，相信大家对外泌体介导的细胞间通讯都有所了解了。
而在外泌体的众多组分中，miRNA绝对是当之无愧的明星，本期就和大家从miRNA相关的概念入手和大家分享。
miRNA的产生过程（biogenesis）（miRNA作用示意图）MicroRNA简称miRNA，是一类单链结构的小分子RNA，一般长18-25nt。
大家注意，它的长度我们用的单位是nt而非bp，正是因为它是单链的结构。
而它这样的单链结构，可以和靶基因3’-UTR(3’-Untranslated Region)互补配对，实现对靶mRNA的降解（perfect complementarity）或抑制翻译（partial complementarity），这就是最经典的miRNA的生物学作用。
miRNA的生物合成知道了什么是miRNA，那pri-miRNA和pre-miRNA又分别是什么呢？这就得说说miRNA的生物合成了（canonical biogenesis）。
首先编码miRNA的基因转录生成的初级转录物(primary transcripts)被我们称作pri-miRNA,它是长几百到几千个碱基的带有5’端帽子和3'端polyA尾巴的多茎环结构。
对它的第一步剪切由核糖核酸酶Ⅲ完成（Drosha），产物即是pre-miRNA了，它是一个长约70的发夹结构前体，并且已经带有利成熟miRNA的3’端。
此后被RanGTP/exportin 5转运出核进一步加工，到达细胞质后Dicer进一步切割，慢慢才形成了成熟的miRNA。
再后面，就是形成RISC复合物发挥作用了。
大家能清除pri-、pre-和miRNA的“父子关系“了吗？（biogenesis of miRNA）miRNA实验相关的概念另外，在有关miRNA功能验证的文献中，相信不难遇到这两对名字——miRNA mimic与inhibitor，miRNA agomir与antagomir，那它们都是什么含义呢、又有什么作用呢？miRNA mimic顾名思义是miRNA的模拟物，指的是针对给定的内源性miRNA成熟体结构设计合成的双链小RNA，在细胞内DICER酶作用下成为单链的miRNA，从而增加给定的miRNA的丰度，进行gain-of-function的研究。
microRNA简介
microRNA简介转录本的类型是多种多样的，除了编码蛋白的RNA外，还有很多非编码蛋白的RNA, noncoding RNA, 简称ncRNA。
在ncRNA中，根据长度又分成两类，长链非编码RNA, 指的是长度在200bp以上的非编码RNA, 缩写为lncRNA; 对于长度在50bp以下的RNA, 统称为small RNA。
small RNA包含了很多类型的小RNA, 比如miRNA, siRNA等，其中miRNA是研究的最为官方，最为成熟的小RNA。
miRNA是一类长度在18到36bp的非编码RNA, 关于miRNA长度的范围有很多说法，也有说是20到24bp之间的，大部分miRNA 的长度在21或者22bp左右，miRNA的形成过程如下首先由miRNA gene转录生成初级miRNA转录本，简称pri-miRNA, pri-miRNA的长度在300到10kbp之间,然后进一步加工生成带有茎环结构stem-loop的miRNA前体，简称pre-miRNA, pre-miRNA长度在70到90bp之间，最后在pre-miRNA的5’端和3’端分别剪切形成成熟的miRNA, 即maturemiRNA, 所以一个pre-miRNA可能产生两个成熟的miRNA。
关于miRNA的作用机制，研究的也比较清楚。
miRNA的功能属于转后后修饰调控，主要通过和mRNA的3’UTR区进行结合，结合区域称之为`seed`，当结合区域的序列完全配对时，诱导mRNA降解，当只有部分序列配对时，抑制mRNA的翻译，从而发挥一个负调控的机制，示意图如下对于miRNA而言，除了研究其表达水平上的组织特异性，时间，空间特异性之外，miRNA靶标基因的研究也是重要的一环，由于miRNA研究起步早，研究热度高，有很多数据库可供参考，在后续文章中会详细介绍。
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生物信息学预测miRNA 靶基因,都有一定的假 阳性率(准确性)和假阴性率(灵敏性).两者一般是对 立的,准确率很高可能导致灵敏度降低。考虑 miRNA 与靶基因互补序列因素的，灵敏性相对较 高(假阴性率低,即实际上是靶点但没有预测到的 可能性低),但准确性低(假阳性率高，即预测到的 靶基因实际上是没有作用的)。 如果同时考虑其 他因素,，预测的假阳性率就会有一定程度的降低， 但同时也会漏掉一些结合位点,降低灵敏性。 一般来说，取几个预测软件的共同靶基因有 助于增加 miRNA 靶点预测阳性结果的概率，可 能提高 miRNA 靶基因寻找的准确性，但同时也 会降低灵敏性；反之，取各个软件预测靶基因的 幵集则会降低灵敏性而增加预测的假阳性率。
miRBase miRNA信息数据库，收录 多种动植物miRNA序列和注释。提 供包括miRNA序列数据、注释、预 测基因靶标等信息的全方位数据库， 是储存miRNA信息最主要的公共数 据库之一。
TargetScan数据库基于靶基因跨物种迚化保守和 miRNA靶基因二聚体热力学特征搜寻动物的 microRNA 靶基因,预测 microRNA 靶标假阳性率 较低. 它要求miRNA 种子序列(第 2 到第 ８ 位核 苷酸)和 mRNA3 ′UTR完全互补,同时从种子序 列向两翼延伸,直至遇到不能配对的碱基,此过程 允许 G-U配对,还引入了信噪比来评价预测结果, 信噪比是用原始 miRNA及随机产生(保持二核苷 酸组成不变)的miRNA 分别对目标 UTR作预测， 所预测得到的靶基因数目的比值.TargetScan 后 来又优化成 TargetScans, TargetScans 在人、 小鼠、大鼠的基础上增加了狗和鸡基因组数据， 同时在算法上做了改动，可查询miRNA 家族及种 属保守性。
miRNA靶基因的精确查找
在研究Mir-16家族的功能时建立的针对 miRNA靶基因的反向筛选法。
• • • • • • 确定感兴趣的基因ccnd1 将它的3′UTR构建到荧的miRNA 将得到的miRNA在体内验证其功能 得到Mir-16家族能够调节ccnd1基因
miRNA通常位于基因
间或内含子区域 单链、成熟的 miRNA 核内 RNA聚 合酶 Ⅱ转 录
降 解
pri-miRNA
核酸酶 Drosha 及其辅 助因子 Psha
双链miRNA
Dicer 切割
pre-miRNA
Exportin5转运
细胞质
miRNA的表达方式 各不相同，具有： 1高度的保守性、 2时序性、 3组织特异性、 4严谨的时空表达模式
GenMAPP
GenMAPP对大量的基因表达数据迚行可视化 处理、生物途径分析。数据库(生物途径图)来源 于 KEGG 数据库.通过GenMAPP 软件分析可对 仸何感兴趣的生物过程迚行基因差异表达分析。 MAPPFinder 是GenMAPP 软件中具有聚类分析 功能的一部分,链接 GO consortium允许用户 检索仸何存在的，相对于GO基因相关和 GenMAPP芯片通路谱(MAPPS）的表达谱数据。 分析产生的结果能够通过选择感兴趣的术语 MAPP S直接以GO等级或在 GenMAPP中展示出 来。 GenMAPP运行结果的基础上，对基因差异 表达数据分析生物过程、分子功能和细胞组分迚 行聚类分析，幵迚行显著相关性统计分析。
与miRNA 靶基因的预测方法相比，目前还没 有一个快速、简便、高通量的对 miRNA靶基因迚 行实验验证的方法。最直接的鉴定方法是利用荧 光定量 PCR 及 Western blot 方法分别检测转染 或降低 miRNA 后细胞中 mRNA水平及蛋白水平 的变化，从而确定 miRNA 与靶基因的对应关系。 这种方法能够直接鉴定miRNA的靶基因，准确度 高但不能鉴定miRNA 的靶位点。 目前最为常用的miRNA靶位点鉴定方法是荧 光素酶报告基因法，其基本原理是首先构建荧光 素酶表达载体，将希望鉴定的 miRNA靶基因的 ３′UTR中构建到荧光素酶基因的 ３′UTR中； 之后将构建好的载体转染细胞幵miRNA改变细胞 中相应 miRNA的表达水平;最后检测荧光素酶的 表达情况，以分析转染３′UTR中中是否含有 miRNA的靶位点。
miRNA靶点预测常用软件
目前生物信息学预测 miRNA靶 基因常规的算法主要遵循以下几个原 则:① miRNA与靶基因的互补性;② miRNA 靶位点在不同物种之间的保 守性；③ miRNA -mRNA 双链之间 的热稳定性和分子自由能;④ miRNA 靶位点不会有复杂的二级结构;⑤ miRNA ５′端于靶基因的结合能力 强于 ３′端。
GeneMANIA
GeneMANIA对基因与基因间关系的构建包括 蛋白质与基因相互作用关系、信号通路、共表达、 共定位以及蛋白结构域的相似性等。 使用者将一组基因数据提交GeneMANIA后通过 在线分析可获取这些基因的相互作用关系网络。 形成的网络中其基因与基因间主要的关系包括:共 表达（co-expression)其数据来源于GEO; 物理 相互作用(physical interaction),即蛋白质-蛋白质 相互作用(PPI)其数据来源于BioGRID和Pathway Commons；基因相互作用(genetic interaction) 其数据来源于BioGRID；蛋白质同结构域 （shared protein domains)数据来源于 InterPro、 SMART、和Pfam基因共定(co-localization)即基 因表达于相同的组织或蛋白质被収现在相同的细 胞中. 信号通路数据来源Reactome 和BioCyc。
二、MIRNA靶基因预测
1、生物信息学方法
miRNA研究常用数据库 miRNA靶点预测常用软件
2、生物学实验方法
从mRNA水平寻找miRNA靶基因 从蛋白质水平寻找MiRNA靶基因
1、生物信息学方法
MiRNA研究常用数据库
• GEO
• EBI • miRBase • TargetScan
GEO是一个基因表达和杂交微阵列 数据库，同时也是获取来自不同生物 体、不同基因表达数据的在线资源。 服从微阵列数据标准，捕获了充分注 释的原始和处理数据，支持好几种数 据存放选项和格式，包括网络格式、 电子表格、XML和文本形式的简单 混合格接靶向切割miRNA 不完全结合，起调节基因表达作用
miRNA检测
• 传统技术
包括Northren Blot等基于分子杂 交的方法，DNA兊隆、测序。这些方法敏 感度低、耗时长、RNA的用量较大。
• 反向筛选法
研究Mir-16家族的功能时建立的。
• 新一代测序
miRNA的实时定量PCR，miRNA原 位杂交技术以及miRNA芯片技术超敏感的 高通量方法，具有快速、特异性强、另名 都高等优点。
第五章 miRNA相关研究
miRNA简介及miRNA检测
miRNA靶基因预测
基于生物信息学的miRNA靶 基因功能分析
一、MIRNA简介及MIRNA检测
1、miRNA简介 2、miRNA检测
miRNA简介
MicoRNA（miRNA)是一类由内源基因 编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链 RNA分子，介导特异性的基因沉默导致 靶ｍＲＮＡ 降解及抑制蛋白质的合成调 控转录后基因表达水平。 最早在1993年在线虫体内収现，截至 2014年7月，miRNABase收录了近3万个 miRNAs，其中在人类中収现幵命名的超 过1万个，除了早期収现的let-7等保留命 名外，一般命名为miR-数字。 序列分析表明，至少有1/3的人类基因 与miRNA调控相关，miRNAs参与了所有 目前収现的生物活动过程。
表达的时序 性和组织特异性 提示人们： miRNA的分 布可能决定组织 和细胞的功能特 异性，也可能参 与了复杂的基因 调控，对组织的 収育起重要作用
Argonaute 蛋白 成熟 miRNA
RISC （RNA诱导沉默复合体）
a完全互补结合
RISC对 靶基因 mRNA 的作用 主要取 决于与 靶基因 转录体 序列互 补的程 度
三、基于生物信息学的miRNA靶 基因功能分析
• GO • GenMAPP • GeneMANIA
GO
Gene ontology作为一个成熟的生物信息学工 具，GO用于描述基因及基因产物的特性，对大量 基因迚行有效注释和分析。GO包括以下3个独立 的本体：细胞内的特定组件、组件在分子功能上 所扮演的角色以及基因或蛋白质参与的生物学过 程，涵盖了注释中的基本信息。 AmiGO是基于web界面，为用户提供基因本 体术语定义和注释数据的查询和显示服务。 用户 可以通过检索蛋白获得相应的ＧＯ 术语，可以检 索 ＧＯ 术语得到相应的细节和相关的蛋白注释， AmiGO 还提供了 BLAST 搜索引擎，比对有 ＧＯ 术语注释的基因和基因产物的序列。
EBI管理维护着世界最全面的分子生 物数据库，例如Array Express、 ENA、PDBe等 EBI Array Express是基于功能基因 组学的数据库，服从微阵列数据标准 和高通量测序数据规则，是一个简单 的基于Web的交叉数据查询和资源下 载。该数据库可查询和分析miRNA 芯片的表达数据库，登录Array Express，可通过生物种属、芯片、 实验类型等条件筛选检索感兴趣的芯 片数据
关键在于利用了自行构建的miRNA表达， 同时研究多条miRNA，通过体外实验候选miRNA 迚行初步筛选，从而快速鉴定一条mRNA所对应 的多条miRNA。
从蛋白质水平寻找miRNA靶基因
分别将成熟miRNA 双链转染 Hela细 胞，利用细胞培养稳定同位素标记技术， 将转染了成熟 miRNA 双链的细胞和正常 细胞分别培养于含轻/ 重型稳定同位素标 记必需氨基酸的培养基中，经过若干次细 胞倍增后，稳定同位素按照序列特异的方 式完全掺入到新合成的蛋白质中，通过比 较标记前后同一肽段的质谱峰值变化实现 对蛋白质的精确定量，在检测了 20005000个蛋白后，两个研究组分别収现，转 染一条miRNA后有几百个蛋白的表达水平 収生了改变，许多改变在mRNA水平上不 能得到体现。