糖蛋白药物糖基化及其表达系统的研究进展
n-糖基化对蛋白质药物关键质量属性影响机制的研究进展
DOI: 10.3969/j.issn.1673-713X.2020.01.010·综述·N-糖基化对蛋白质药物关键质量属性影响机制的研究进展刘国芳，刘晓志，高健，王志明蛋白质糖基化是真核生物蛋白质翻译后修饰的主要方式。
它分布于许多膜结合蛋白上，以N- 或O- 形式和蛋白质连接，其中N- 连接是天冬酰胺（N）和聚糖连接，O- 连接主要是苏氨酸（T）或丝氨酸（S）同聚糖连接。
许多激素、酶以及抗体的N-糖基化位点一般含有保守序列N-X-S/T（其中X 为非脯氨酸的氨基酸），糖基化蛋白一般分布于细胞外，内质网（endoplasmic reticulum，ER）、高尔基体和溶酶体内[1]。
N-糖基化反应在内质网（ER）内开始，ER 和高尔基体内的多种糖苷酶和糖基转移酶参与这个修饰过程。
治疗性抗体药物的Fc 区域有一个N-连接聚糖，位于重链CH2 结构域中的N297。
它具有复杂的双触角型结构，核心结构为甘露糖α1,3 和甘露糖α1,6 键连接的 2 个糖链，添加半乳糖和唾液酸延长糖链。
当含有N-糖基化共有序列的新生抗体通过ER 膜时，N-聚糖前体[包含有3 个葡萄糖（Glc），9 个甘露糖（Man）和 2 个N]通过寡糖基转移酶将乙酰葡糖胺（GlcNAc）转移至新生多肽的N 侧链的酰胺氮上。
在ER 内，N-聚糖末端的葡萄糖残基被α-葡糖苷酶依次修剪，蛋白质正确折叠后形成寡甘露糖9（Man9 或Man9-GlcNAc2）结构。
随后通过ER α-甘露糖苷酶I 除去Man9 中的α1,2-连接的甘露糖，并且将聚糖转化为寡甘露糖5（Man5 或Man5-GlcNAc2）结构。
当抗体从ER 转运到高尔基体时，通过糖苷转移酶I（GlcNAcT I）将GlcNAc 添加到Man5 的α1,3 臂末端甘露糖上，成为杂合型分子。
α1,6-岩藻糖基转移酶VIII（FucT VIII）催化α1,6-岩藻糖转移到GlcNAc-GlcNAc 核心中的最内部的GlcNAc 上，将聚糖转化为岩藻糖型聚糖。
单克隆抗体药物糖基化修饰分析研究进展
单克隆抗体药物糖基化修饰分析研究进展丛宇婷;胡良海【摘要】单克隆抗体药物是一类以免疫球蛋白G的结构为基础的大分子糖蛋白药物,为癌症、自身免疫疾病以及病毒感染等多种疾病的治疗提供了全新的途径.单抗药物的糖基化修饰类型及水平对其稳定性、清除率、免疫原性、抗体依赖细胞毒性及补体依赖细胞毒性等都有一定的影响.单抗药物的迅速发展及其在多种疾病治疗中日益凸显的重要性都对单抗药物的研发及用药安全等方面提出了更高的要求.因此,建立规范可靠的单抗药物糖基化修饰分析方法有着十分重要的意义.该综述将简要介绍单克隆抗体药物糖基化修饰及相关的定性、定量分析方法.【期刊名称】《色谱》【年(卷),期】2016(034)012【总页数】6页(P1186-1191)【关键词】单克隆抗体药物;糖基化修饰;质谱;蛋白质组学;综述【作者】丛宇婷;胡良海【作者单位】吉林大学生命科学学院,吉林长春130012;吉林大学生命科学学院,吉林长春130012【正文语种】中文【中图分类】O658单克隆抗体药物(therapeutic monoclonal antibody,mAb;以下简称单抗药物)是一类以γ型免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)为结构基础的大分子蛋白类药物,结构如图1a所示。
1975年,Kohler和Milstein[1]证明,骨髓瘤细胞与经抗原免疫的动物脾细胞融合,形成的融合细胞能分泌针对该抗原的均一、高特异性的抗体——单克隆抗体,这种技术称为杂交瘤技术[1-3],这一发现实现了一个世纪前Ehrlich提出的通过抗体靶向治疗肿瘤的设想[4]。
随着杂交瘤技术的发展,第一支单抗药物——莫罗单抗(muromomab)于1986年由美国食品和药品管理局(United States Food and Drug Administration,FDA)批准上市[1],从此,单抗药物逐渐走入人们视野并得到了越来越多的关注。
糖生物学与糖化学【精选】
糖与蛋白质、脂类和核酸一样，是组成细胞的重要成分，核酸分子中也不能没有核糖，从分子生物学的研究知道，糖不但是细胞能量的主要来源，在细胞的构建、细胞的生物合成和细胞生命活动的调控中，均扮演着重要的角色。
糖生物学(glycobiology)是研究聚糖及其衍生物的结构,化学,生物合成及生物功能的科学。
蛋白质、核酸和多糖是构成生命的三类大分子，蛋白质和核酸的研究已经成为生命科学中的热点问题。
科学家对糖的研究早在19世纪就已开始，但由于糖链结构的复杂多变，物理和化学分析手段的滞后，百余年来科学界对糖的认识几乎没有多大进展。
随着分子生物学的兴起，从20世纪60年代开始，物理和化学技术的发展，终于使糖的研究进入了新阶段。
到了90年代糖生物学才发展起来的生物化学中的最后的一个巨大学术前沿领域。
糖生物学是研究糖缀合物糖链的结构、生物合成和生物学功能的一门科学。
其研究的范围包括糖的化学结构、性质，糖链在细胞中的生物合成，糖链在生命系统中的功能，糖链的基因程序和分子操作。
糖生物学有着广阔的应用前景，它是生物化学和生物医学学科交叉的新前沿。
生物学家发现，糖结构的微小差异可能对生物功能有重大影响。
事实上，糖涉及到从胚胎发育到免疫系统控制的每一件事情。
在所有器官中，糖无所不在。
对糖生物学的深入研究可能会产生新药，或改进现有药物的疗效。
例如，加有适量糖的、基于蛋白质的药物，可能产生更有效的治疗，以及减少所需药物剂量。
糖生物学是生物化学的一个重要方面，在人体结构、功能、代谢、调节和疾病发生中起着十分重要的作用，并已取得很多进展。
1 糖生物学研究的现状和特点1.1对糖结构的研究糖链结构与功能的阐明将是后基因组时代生命科学研究的核心内容之一，对人类健康的维护和疾病的防治将产生深远影响。
糖链的结构具有惊人的多样性、复杂性和微观不均一性，其一级结构的内容不仅包括糖基的排列顺序，还包括各糖基的环化形式、各糖基本身异头体的构型、各糖基间的连接方式以及分支结构的位点和分支糖链的结构。
糖组学中糖蛋白糖链的研究技术及进展
糖组学中糖蛋白糖链的研究技术及进展1988年牛津大学Dwek教授在Annual Review of Biochemistry上发表了题为“Glycobiology” (糖生物学) 的综述，首次提出了糖生物学这一概念，标志着糖生物学这门学科的诞生[1]。
在十几年后，糖生物学在糖链结构、生物合成、生理功能等方面取得了极大地进展。
作为第3种生命信息分子的糖链正越来越受到重视，于是糖组学被誉为是继基因组学和蛋白质组学后的第三领域。
糖组是指细胞内所有的糖链，包括糖复合物[2]。
糖组学是研究糖链的表达、调控和生理功能的科学，通过研究糖链确定基因所携带的遗传信息与功能之间的关系。
糖组学的研究依赖于糖组研究技术的发展，其中糖蛋白和糖链的研究技术比较成熟，本文主要对这两方面进行综述。
1.糖组学研究的内容及意义基因对生命活动的调控是由基因所编码的蛋白质及其所合成的糖链和脂类来体现的，因此基因功能的阐明不仅需要基因组学的研究，还必须开展蛋白质组学和糖组学的研究。
糖链、核酸和蛋白质都是生物大分子，但是糖链的结构远比核酸和蛋白质复杂，这是由于聚糖的糖单位之间糖苷键的链接方式的多样性[3]。
糖链参与几乎所有真核生物的每一生命过程，其功能是复杂而多样的在分子内，糖蛋白糖链影响蛋白质的折叠、溶解度、半衰期、抗原性及生物活性等。
在分子间，糖链可以通过糖基化影响蛋白的功能，更重要的是还与信号传递、细胞通讯密切相关。
.糖与糖之间的相互作用介导细胞-细胞相互作用也被证实.因此糖组学的重要研究内容之一就是作为信息分子的糖类如何在细胞识别和信号传导中发挥作用[4]。
为了研究糖类在细胞识别和信号传导中的作用首先要完成4个方面：什么是基因编码糖蛋白，即基因信息；实现被糖基化的位点，即糖基化信息；聚糖结构，即结构信息；糖基化功能，即功能信息[5]。
目前预测细胞内超过５０％的蛋白质为糖蛋白，在这些糖蛋白中蛋白质是生理功能的主要承担者，而糖链则通过改变蛋白质的折叠方式、生物活性、溶解度、疏水性、聚合、降解、电荷、粘度及质量，对蛋白质的功能起修饰作用。
CHO细胞表达系统研究进展
生物技术进展２０１６年㊀第６卷㊀第４期㊀２３９~２４３ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ㊀ＩＳＳＮ２０９５￣２３４１进展评述Ｒｅｖｉｅｗｓ㊀收稿日期:２０１６￣０２￣２２ꎻ接受日期:２０１６￣０４￣０４㊀作者简介:郑惠惠ꎬ技术员ꎬ主要从事真核重组抗原研发研究ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｓｈａｎｊｖｑｉｕｍｉｎｇ＠１６３.ｃｏｍꎮ∗通信作者:江洪ꎬ工程师ꎬ主要从事重组抗原研发研究ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｊｉａｎｇ＠ｗｏｎｄｅｒｇｅｎ.ｃｏｍＣＨＯ细胞表达系统研究进展郑惠惠ꎬ㊀江㊀洪∗北京万达因生物医学技术有限责任公司ꎬ北京１４１０１７摘㊀要:ＣＨＯ细胞表达系统是目前重组糖蛋白生产的首选系统ꎮ随着无血清悬浮培养技术㊁基因工程技术和大规模培养技术的应用和不断发展ꎬＣＨＯ细胞表达系统已经成为生物技术药物最重要的表达或生产系统ꎬ并被广泛应用于抗体㊁重组蛋白药物和疫苗等产品的研发和生产中ꎮ近年来ꎬ针对ＣＨＯ细胞表达系统在某些重组蛋白的表达和大规模生产中存在的不足ꎬ研究者们通过利用基因工程技术手段ꎬ结合重组蛋白表达机制的研究成果ꎬ为优化和应用ＣＨＯ细胞表达系统做出了不懈努力ꎮ从培养基的优化㊁高产重组ＣＨＯ细胞株的构建㊁大规模培养三个方面综述了ＣＨＯ细胞表达系统的最近研究进展ꎬ以期为ＣＨＯ细胞表达系统的研究与应用提供参考ꎮ关键词:ＣＨＯ细胞培养ꎻ细胞改造ꎻ重组抗原表达ＤＯＩ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.２０９５￣２３４１.２０１６.０４.０３ＰｒｏｇｒｅｓｓｏｆＣＨＯＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍＺＨＥＮＧＨｕｉ￣ｈｕｉꎬＪＩＡＮＧＨｏｎｇ∗ＢｅｉｊｉｎｇＷｏｎｄｅｒｇｅｎＢｉｏ￣ｍｅｄｉｃｉｎｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ.Ｌｔｄ.ꎬＢｅｉｊｉｎｇ１４１０１７ꎬＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ:ＣＨＯｃｅｌｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｉｓｔｈｅｐｒｅｆｅｒｒｅｄｓｙｓｔｅｍｆｏｒｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ.Ｗｉｔｈｔｈｅｅｖｏｌｖｉｎｇｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｓｅｒｕｍ￣ｆｒｅｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄｔｈｅｌａｒｇｅ￣ｓｃａｌｅｃｕｌｔｕｒｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓꎬＣＨＯｃｅｌｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｈａｓｂｅｃｏｍｅｔｈｅｍｏｓｔｉｍｐｏｒｔａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｆｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｐｒｏｄｕｃｔｓ.Ｔｈｉｓｓｙｓｔｅｍｉｓｗｉｄｅｌｙｕｓｅｄｉｎｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓꎬｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｖａｃｃｉｎｅｓ.Ｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓꎬｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓｈａｖｅｍａｄｅｇｒｅａｔｅｆｆｏｒｔｓｔｏｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｌａｒｇｅ￣ｓｃａｌｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｂｙｕｓｉｎｇｌａｔｅｓｔｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍ.ＴｈｉｓａｒｔｉｃｌｅｂｒｉｅｆｌｙｒｅｖｉｅｗｅｄｔｈｅｒｅｃｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｔｈｅＣＨＯｃｅｌｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｉｎｔｈｒｅｅａｓｐｅｃｔｓ:ｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍꎬｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄＣＨＯｓｔｒａｉｎｓｆｏｒｈｉｇｈ￣ｌｅｖｅｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｌａｒｇｅ￣ｓｃａｌｅｃｕｌｔｕｒｅｒｅｓｅａｒｃｈꎬｗｈｉｃｈｗａｓｅｘｐｅｃｔｅｄｔｏｐｒｏｖｉｄｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＣＨＯｃｅｌｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＣＨＯｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅꎻｃｅｌｌｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎻｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｎｔｉｇｅｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ㊀㊀ＣＨＯ细胞是由Ｐｕｃｋ于１９５７年建成的中国仓鼠卵巢成纤维细胞系ꎮ发展至今ꎬＣＨＯ细胞已成为生物技术药物最重要的表达或生产系统ꎮ随着无血清悬浮培养技术㊁基因工程技术㊁生物反应器设计放大与强化技术㊁大规模高密度流加和连续灌注培养技术等的发展ꎬＣＨＯ细胞系统被广泛应用于抗体㊁基因重组蛋白质药物㊁病毒疫苗等生物技术产品的研究开发和工业化生产中ꎮＣＨＯ细胞是目前重组糖基蛋白生产的首选体系ꎮ因为它具有准确的转录后修饰功能ꎬ表达的蛋白在分子结构㊁理化特性和生物学功能方面更接近于天然蛋白分子ꎮ但ＣＨＯ细胞在无血清培养基中会出现活力差㊁分泌外源蛋白能力弱等问题ꎮ所以建立稳定㊁高产的重组ＣＨＯ细胞成为很多研究者的目标ꎮ近年来ꎬ研究者从细胞营养㊁代谢㊁凋亡㊁信号传导等角度ꎬ结合蛋白表达机制等研究成果ꎬ对这一目标的实现做出了很多努力ꎮ本文从培养基优化㊁高产重组ＣＨＯ细胞株的构. All Rights Reserved.建㊁大规模培养三个方面综述了ＣＨＯ细胞表达系统的最新研究进展ꎬ以期为ＣＨＯ细胞表达系统的应用提供参考ꎮ１㊀培养基的优化研究发现ꎬ不同的细胞株甚至克隆对营养成分的需求都有差别ꎮ通过筛选比较不同培养基成分对重组抗原生产的影响ꎬ并开发适用于不同重组ＣＨＯ细胞株的培养基ꎬ成为很多研究者提高ＣＨＯ细胞表达系统产量的重要方式ꎮ为了维持细胞在无血清培养基中的正常生长ꎬ需要在基础培养基中添加很多其他因子ꎬ如激素㊁生长因子㊁蛋白水解物等ꎮ蛋白质水解物含有丰富的营养成分ꎬ可有效缩短细胞对无血清培养基的适应过程ꎮＤａｖａｍｉ等[１]通过组合比较不同来源的蛋白水解物对细胞密度及表达产量的影响ꎬ优化得到更适于ＤＧ４４的培养基ꎮ酵母水解物作为一种成本较低的非动物源蛋白水解物ꎬ可以使细胞密度增加的同时ꎬ使重组表达抗体的表达量大幅提高[２]ꎮ大豆水解物等都可以被添加到基础培养基中[１ꎬ３ꎬ４]ꎮ由于蛋白水解物的构成复杂ꎬ且批间差异大ꎬ因此蛋白水解物的添加会影响细胞培养基批次间的稳定性ꎮ如果去除培养基中的蛋白质水解物ꎬ需要添加氨基酸或微量元素等ꎬ通过优化调整其比例ꎬ仍能支持高密度的ＣＨＯ细胞培养[５]ꎮ刘兴茂等[６]采用Ｐｌａｃｋｅｔｔ￣Ｂｕｒｍａｎ实验对影响细胞生长的培养添加成分进行了考察ꎬ确定了腐胺㊁胰岛素及转铁蛋白对１１Ｇ￣Ｓ细胞的悬浮培养有明显的生长促进作用ꎮ设计的培养基可以使细胞最大生长密度达到４.１２ˑ１０６ｃｅｌｌｓ/ｍＬꎮＸｕ等[７]采用Ｐｌａｃｋｅｔｔ￣Ｂｕｒｍａｎ设计与支持向量机(ＳＶＭ)预测并实验确定了硫酸锌㊁转铁蛋白及ＢＳＡ对ＣＨＯ￣Ｋ１细胞的生长有促进作用ꎮ另有研究表明ꎬ使用柠檬酸铁作为转铁蛋白的替代物ꎬ可以使细胞的密度达到７.０ˑ１０６ｃｅｌｌｓ/ｍＬꎬ但是会降低转染效率[８]ꎮＭｉｋｉ等[９]研究发现ꎬ添加生长因子ＩＧＦ￣１和脂类信号分子溶血磷脂酸(ＬＰＡ)也可以有效加速ＣＨＯ细胞生长ꎮ优化培养基能有效提高重组ＣＨＯ细胞的培养密度ꎮ高密度的ＣＨＯ细胞培养是ＣＨＯ细胞表达系统实现工业化生产应用的必要条件之一ꎮ与大肠杆菌和酵母表达系统相比ꎬＣＨＯ细胞有生长较慢㊁培养周期较长㊁产量较低等缺点ꎮ为了提高重组蛋白产量㊁扩大ＣＨＯ细胞表达系统的生产应用范围ꎬ研究者们在优化培养基的实验基础上ꎬ构建高产的重组ＣＨＯ细胞系ꎬ为大规模的重组蛋白生产提供基础ꎮ２㊀高产重组ＣＨＯ细胞株的构建研究者们利用发展迅速的基因编辑技术对ＣＨＯ细胞进行筛选和改造ꎬ得到高产的重组细胞株ꎮ研究者们通过过量表达或敲除某个基因ꎬ调整代谢途径㊁延缓细胞凋亡㊁增强转录表达效率ꎬ有效的增加了重组蛋白产量ꎮ通过结合全基因组测序和基因敲除技术的研究成果ꎬ研究者们为得到反应性更好的糖基化重组蛋白做出了不懈努力ꎮ２.１㊀调整代谢途径乳酸作为糖酵解产生的代谢产物会影响细胞生长ꎮＺｈｏｕ等[１０]使用ｓｉＲＮＡ技术降低乳酸脱氢酶Ａ(ＬＤＨａ)和丙铜酸脱氢酶激酶(ＰＤＨＫｓ)基因的表达ꎬ使乳酸的产生降低了９０％ꎬ并增加了单抗的产量ꎮＴｏｕｓｓａｉｎｔ等[１１]通过在ｒＣＨＯ中表达酵母丙酮酸羧化酶(ＰＹＣ２)ꎬ改变了流加培养方式中葡萄糖的代谢速率ꎬ增长了细胞的对数生长期ꎬ从而增加了细胞密度及产量ꎮ２.２㊀延缓细胞凋亡为了延长细胞培养的时间从而增加产量ꎬ有研究者建立了能表达抗凋亡基因的ＣＨＯ细胞系ꎮＭａｊｏｓ等[１２]通过在ＣＨＯ中表达１个Ａｓｐ２９Ａｓｎ突变的抑制凋亡基因ꎬ有效延缓了细胞凋亡ꎮ也有研究者通过敲除细胞中的促凋亡基因来延缓细胞凋亡ꎬ如Ｃｏｓｔ等[１３]敲除了ＢＣＬ２相关蛋白Ｘ(ＢＡＸ)和ＢＡＫ的基因ꎬ使单克隆抗体产量增加了５倍ꎮＲｉｔｔｅｒ等[１４]发现８号染色体端粒区的缺失也可以使产物产量成倍增加ꎮ２.３㊀增强转录表达效率有研究者在细胞信号通路研究成果的基础上ꎬ通过表达转录及翻译过程中的相关蛋白ꎬ增强转录和表达效率ꎬ以增加目的重组蛋白的产量ꎮＬｅＦｏｕｒｎ等[１５]通过在ＣＨＯ中表达人信号受体蛋白ＳＲＰ１４ꎬ成功增加了分泌表达的重组蛋白的产０４２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.量ꎮＰｅｎｇ等[１６]通过表达转录翻译相关蛋白ＳＬＹ１㊁ＭＵＮＣ１８Ｃ和ＸＢＰ１ꎬ使ＩｇＧ的产量提高了２０倍ꎻＲａｈｉｍｐｏｕｒ等[１７]在ＣＨＯ细胞中表达神经酰胺转移蛋白(ＣＥＲＴ)的突变基因使ｔ￣ＰＡ的产量增加了３５％ꎮ２.４㊀表达糖基化酶能产生糖基化的重组蛋白是ＣＨＯ细胞表达系统重要的优势ꎬ研究者们通过建立能表达Ｎ￣糖基化途径中不同酶类的细胞系以增加糖基化重组蛋白的反应性ꎮ如Ｇｏｈ[１８]建立的一个含有Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖转移酶Ｉ基因的突变体ＣＨＯ￣ｇｍｔ４细胞系ꎬ其表达的重组葡萄糖脑苷脂酶将不需要多糖重构可直接用于治疗戈谢病患者ꎮＺｈａｎｇ等[１９]通过ＣＨＯ￣ｇｍｔ５细胞株表达的重组抗体ꎬ其Ｆｃ的Ｎ￣多糖缺少岩藻糖和唾液酸能增强ＡＤＣＣ的作用ꎮ根据ＣＨＯ￣Ｋ１的基因组信息ꎬＹａｎｇ等[２０]通过锌指核酸酶(ＺＦＮｓ)基因敲除的方法ꎬ研究了１９种包括作用于Ｎ￣糖基链分支㊁半乳糖基㊁聚ＬａｃＮＡｃ延伸㊁唾液酸化加盖的Ｎ￣糖基转移酶对Ｎ￣糖基化作用的影响ꎬ为更准确的表达特定糖基化方式的重组蛋白提供了重要参考ꎮ重组ＣＨＯ细胞表达重组蛋白能力的高低ꎬ不能简单的归结为某些关键基因的作用ꎮ为了得到高产的重组细胞株ꎬ需要研究者们综合考虑细胞的代谢情况㊁培养条件㊁蛋白表达效率和蛋白加工修饰能力等诸多因素ꎮ３㊀大规模培养研究基因工程技术㊁细胞融合技术及抗体类药物的迅速发展ꎬ推进了生物反应器培养技术在生物制药中的应用ꎮ由于ＣＨＯ细胞能以悬浮培养的方式高密度培养ꎬ培养体积可达１０００Ｌ以上ꎬ所以在大规模培养和重组蛋白的高产量生产中ꎬＣＨＯ细胞表达系统拥有广阔的发展前景ꎮ在大规模生产中ꎬ通常采用流加培养方式ꎬ通过添加营养物质来延长培养时间ꎬ增加细胞密度和目的产品的浓度ꎮ为了更大程度的提高重组蛋白的生产效率ꎬ研究者们需要根据不同细胞株的生长代谢特点ꎬ选择和优化起始培养基㊁补料培养基及补料策略ꎮ现代计算机技术㊁数学算法及理论的应用ꎬ也为研究者对细胞流加培养的优化提供了很大帮助ꎮ３.１㊀优化培养参数选择合适的培养基㊁优化细胞培养的参数(如温度㊁ｐＨ㊁溶氧㊁ＣＯ２浓度㊁渗透压等)对生产至关重要ꎮ同时ꎬ流加工艺参数(如流加培养基成分㊁流加时间等)均需根据不同的细胞株及反应器的特点来设计优化ꎮＦａｎ等[２１]采用分批补料方式培养ＣＨＯ细胞ꎬ实验显示培养基中的氨基酸和葡萄糖浓度对细胞的生长㊁ＩｇＧ浓度和Ｎ￣糖基化生成都很重要ꎮＫｉｍ等[２２]使用分批补料培养使ＩｇＧ的产量达到２.３ｇ/Ｌꎮ通过用小麦蛋白水解物(ＷＧＨ)代替补料中的谷氨酰胺可以使ｔ￣ＰＡ的产量达到４２２ｍｇ/Ｌ[２３]ꎮ３.２㊀应用新的培养技术微载体培养是一种动物细胞大规模培养技术ꎮ培养液中大量的微载体为细胞提供了极大的附着表面ꎬ从而可实现细胞的高密度培养ꎮ胡显文等[２４]在搅拌式反应器中无血清培养分泌ｕ￣ＰＡ的ＤＮＡ重组ＣＨＯ细胞ꎬ通过部分更换Ｃｙｔｏｐｏｒｅ多孔微载体ꎬ解决了大规模细胞培养中细胞凋亡的问题ꎮ并使用周期变压刺激技术使ｕ￣ＰＡ的产量提高了１０倍ꎬ且可以降低葡萄糖厌氧代谢产生乳酸的转化率ꎮＶｅｎｔｉｎｉ等[２５]通过Ｃｙｔｏｄｅｘ微载体培养ＣＨＯ￣ｈＴＳＨ细胞的实验表明ꎬ培养基中微载体的数量及在ｒｈＴＳＨ合成期开始时的细胞浓度是提高目的蛋白产量的重要参数ꎮ李智等[２６]利用ＣＨＯ细胞能在培养过程中自然结团的特性ꎬ采用超声沉降柱二合一灌流系统促进细胞结团和加强截留的特性ꎬ用无血清培养基连续灌流培养基因重组ＣＨＯ细胞ＭＫ３￣Ａ２株ꎬ分泌表达的ｒｈＴＮＫ￣ｔＰＡ生产率平均为８９ｍｇ/Ｌ ｄꎮ３.３㊀添加保护剂聚醚Ｆ６８可以有效减少生物反应器中搅拌对细胞产生的机械损伤ꎮ针对Ｆ６８对某些细胞株的生长及产量降低的情况ꎬ研究者发现０.０５％或０.０７５％的５００ｋＤａ的γＰＧＡ可以替代Ｆ６８应用于ＣＨＯＤＧ４４细胞的培养中[２７]ꎮ在细胞培养工艺逐级放大的过程中ꎬ每一步都需要研究者们监控细胞在生长和表达方面的相关指标ꎮ生物反应器在线监控ｐＨ㊁溶氧等参数的功能㊁色谱和在线蛋白分解监测等技术为大规模培养的过程控制提供了帮助ꎮ１４２郑惠惠ꎬ等:ＣＨＯ细胞表达系统研究进展. All Rights Reserved.４ 展望ＣＨＯ细胞是表达外源蛋白最多也是最成功的一类细胞ꎬ有其不可比拟的优点ꎬ同时也存在现行技术手段不能弥补的不足之处ꎮ结合生物信息学㊁细胞生物学㊁基因工程技术和生物反应器技术的研究成果ꎬ研究者们可以通过综合考虑细胞代谢特性㊁蛋白表达特性等影响因素ꎬ通过研发个性化培养条件及培养工艺ꎬ构建高表达载体ꎬ筛选稳定高产的重组细胞株ꎬ改造宿主细胞等角度继续优化ＣＨＯ细胞表达系统ꎬ为产业化生产重组蛋白提供基础ꎮ用于产业化生产的重组ＣＨＯ细胞ꎬ需要具备生长特性良好㊁能在无血清培养基中高密度培养㊁表达重组蛋白能力强㊁能正确的进行翻译后修饰等特点ꎮ糖基化是蛋白翻译后最重要的修饰之一ꎬ直接影响重组蛋白的空间结构㊁生物活性㊁稳定性㊁免疫原性和生物反应性等ꎮ对重组蛋白的糖基化研究一直是研发和生产真核重组蛋白的热点课题ꎮ随着基因编辑技术的发展ꎬ研究者们通过表达特定糖基化相关酶从而得到完整㊁准确的特定形式的糖链结构ꎬ为糖基化蛋白在免疫诊断㊁临床治疗等领域的持续发展奠定了基础ꎮ随着基因技术的不断发展ꎬ对细胞代谢㊁信号传导等方面研究的持续深入ꎬ构建能表达准确修饰的糖基化重组蛋白的高产重组ＣＨＯ细胞株仍将成为研究热点ꎮ参㊀考㊀文㊀献[１]㊀ＤａｖａｍｉＦꎬＥｇｈｂａｌｐｏｕｒＦꎬＮｅｍａｔｏｌｌａｈｉＬꎬｅｔａｌ..ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｐｅｐｔｏｎｅｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉａｏｎｇｒｏｗｔｈꎬｍｅｔａｂｏｌｉｃｐａｔｈｗａｙａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｏｆＣＨＯＤＧ４４ｃｅｌｌｓ:ａｎｅｗｉｎｓｉｇｈｔｉｎｔｏａｍｉｎｏａｃｉｄｐｒｏｆｉｌｅｓ[Ｊ].Ｉｒａｎ.Ｂｉｏｍｅｄ.Ｊ.ꎬ２０１５ꎬ１９(４):１９４－２０５.[２]㊀ＳｕｎｇＹＨꎬＬｉｍＳＷꎬＣｈｕｎｇＪＹꎬｅｔａｌ..Ｙｅａｓｔｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅａｓａｌｏｗ￣ｃｏｓｔａｄｄｉｔｉｖｅｔｏｓｅｒｕｍ￣ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍｆｏｒｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎｉｎｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｓｏｆＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ａｐｐｌ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２００４ꎬ６３(５):５２７－５３６.[３]㊀ＤａｖａｍｉＦꎬＢａｌｄｉＬꎬＲａｊｅｎｄｒａＹꎬｅｔａｌ..ＰｅｐｔｏｎｅｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｈａｓｖａｒｉａｂｌｅｅｆｆｅｃｔｓｏｎｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｏｆＣＨＯｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ｉｎｔ.Ｊ.Ｍｏｌ.ＣｅｌｌＭｅｄ.ꎬ２０１４ꎬ３(３):１４６－１５６.[４]㊀ＣｈｕｎＢＨꎬＫｉｍＪＨꎬＬｅｅＨＪꎬｅｔａｌ..Ｕｓａｂｉｌｉｔｙｏｆｓｉｚｅ￣ｅｘｃｌｕｄｅｄｆｒａｃｔｉｏｎｓｏｆｓｏｙｐｒｏｔｅｉｎｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓｆｏｒｇｒｏｗｔｈａｎｄｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｃｅｌｌｓｉｎｐｒｏｔｅｉｎ￣ｆｒｅｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅ[Ｊ].Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ.Ｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２００７ꎬ９８(５):１０００－１００５.[５]㊀张大鹤ꎬ易小萍ꎬ张元兴ꎬ等ꎬ适于重组ＣＨＯ细胞培养的无血清培养基的制备[Ｊ].中国生物制品学杂志ꎬ２０１１(１０):１１５２－１１５６.[６]㊀刘兴茂ꎬ刘红ꎬ叶玲玲ꎬ等ꎬＣＨＯ工程细胞无血清悬浮分批培养的生长代谢特征及动力学模型[Ｊ].生物工程学报ꎬ２０１０ꎬ(１):８５－９２.[７]㊀ＸｕＪꎬＹａｎＦＲꎬＬｉＺＨꎬｅｔａｌ..Ｓｅｒｕｍ￣ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｂａｓｅｄｏｎｔｒｉａｌｄｅｓｉｇｎａｎｄｓｕｐｐｏｒｔｖｅｃｔｏｒｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ[Ｊ].Ｂｉｏｍｅｄ.Ｒｅｓ.Ｉｎｔ.ꎬ２０１４ꎬｄｏｉ:１０.１１５５/２０１４/２６９３０５. [８]㊀ＥｂｅｒｈａｒｄｙＳＲꎬＲａｄｚｎｉａｋＬꎬＬｉｕＺ.Ｉｒｏｎ(ＩＩＩ)ｃｉｔｒａｔｅｉｎｈｉｂｉｔｓｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｉｅｎｔｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｃｅｌｌｓｉｎｓｅｒｕｍ￣ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍ[Ｊ].Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２００９ꎬ６０:１－９.[９]㊀ＭｉｋｉＨꎬＴａｋａｇｉＭ.Ｄｅｓｉｇｎｏｆｓｅｒｕｍ￣ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍｆｏｒｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｏｆＣＨＯｃｅｌｌｓｏｎｔｈｅｂａｓｉｓｏｆｇｅｎｅｒａｌｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｍｅｄｉａ[Ｊ].Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２０１５ꎬ６７(４):６８９－６９７.[１０]㊀ＺｈｏｕＭꎬＣｒａｗｆｏｒｄＹꎬＮｇＤꎬｅｔａｌ..ＤｅｃｒｅａｓｉｎｇｌａｃｔａｔｅｌｅｖｅｌａｎｄｉｎｃｒｅａｓｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎＣｈｉｎｅｓｅＨａｍｓｔｅｒＯｖａｒｙｃｅｌｌｓ(ＣＨＯ)ｂｙｒｅｄｕｃｉｎｇｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｌａｃｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅａｎｄｐｙｒｕｖａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｋｉｎａｓｅｓ[Ｊ].Ｊ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１１ꎬ１５３(１－２):２７－３４.[１１]㊀ＴｏｕｓｓａｉｎｔＣꎬＨｅｎｒｙＯꎬＤｕｒｏｃｈｅｒＹ.ＭｅｔａｂｏｌｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆＣＨＯｃｅｌｌｓｔｏａｌｔｅｒｌａｃｔａｔｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｄｕｒｉｎｇｆｅｄ￣ｂａｔｃｈｃｕｌｔｕｒｅｓ[Ｊ].Ｊ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１５ꎬ２１７:１２２－１３１.[１２]㊀ＭａｊｏｒｓＢＳꎬＣｈｉａｎｇＧＧꎬＰｅｄｅｒｓｏｎＮＥꎬｅｔａｌ..Ｄｉｒｅｃｔｅｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｍａｍｍａｌｉａｎａｎｔｉ￣ａｐｏｐｔｏｓｉｓｐｒｏｔｅｉｎｓｂｙｓｏｍａｔｉｃｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ[Ｊ].ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ.Ｄｅｓ.Ｓｅｌ.ꎬ２０１２ꎬ２５(１):２７－３８.[１３]㊀ＣｏｓｔＧＪꎬＦｒｅｙｖｅｒｔＹꎬＶａｆｉａｄｉｓＡꎬｅｔａｌ..ＢＡＫａｎｄＢＡＸｄｅｌｅｔｉｏｎｕｓｉｎｇｚｉｎｃ￣ｆｉｎｇｅｒｎｕｃｌｅａｓｅｓｙｉｅｌｄｓａｐｏｐｔｏｓｉｓ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔＣＨＯｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｅｎｇ.ꎬ２０１０ꎬ１０５(２):３３０－４０. [１４]㊀ＲｉｔｔｅｒＡꎬＶｏｅｄｉｓｃｈＢꎬＷｉｅｎｂｅｒｇＪꎬｅｔａｌ..Ｄｅｌｅｔｉｏｎｏｆａｔｅｌｏｍｅｒｉｃｒｅｇｉｏｎｏｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ８ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓｗｉｔｈｈｉｇｈｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆＣＨＯｃｅｌｌｌｉｎｅｓ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｅｎｇ.ꎬ２０１６ꎬ１１３(５):１０８４－１０９３.[１５]㊀ＬｅＦｏｕｒｎＶꎬＧｉｒｏｄＰＡꎬＢｕｃｅｔａＭꎬｅｔａｌ..ＣＨＯｃｅｌｌｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｔｏｐｒｅｖｅｎｔｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓｅｃｒｅｔｉｏｎ[Ｊ].Ｍｅｔａｂ.Ｅｎｇ.ꎬ２０１４ꎬ２１:９１－１０２.[１６]㊀ＰｅｎｇＲＷꎬＦｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒＭ.ＭｏｌｅｃｕｌａｒｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆｅｘｏｃｙｔｉｃｖｅｓｉｃｌｅｔｒａｆｆｉｃｅｎｈａｎｃｅｓｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｅｎｇ.ꎬ２００９ꎬ１０２(４):１１７０－１１８１.[１７]㊀ＲａｈｉｍｐｏｕｒＡꎬＶａｚｉｒｉＢꎬＭｏａｚｚａｍｉＲꎬｅｔａｌ..ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｔｈｅｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｔｅｉｎｓｅｃｒｅｔｏｒｙｐａｔｈｗａｙｆｏｒｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｔｉｓｓｕｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｃｅｌｌｓ:ｅｆｆｅｃｔｓｏｆＣＥＲＴａｎｄＸＢＰ１ｓｇｅｎｅｓ[Ｊ].Ｊ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１３ꎬ２３(８):１１１６－１１２２. [１８]㊀ＧｏｈＪＳꎬＬｉｕＹꎬＣｈａｎＫＦꎬｅｔａｌ..ＰｒｏｄｕｃｉｎｇｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓｗｉｔｈｅｎｈａｎｃｅｄｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎｕｓｉｎｇＣＨＯ￣ｇｍｔ４ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｍｕｔａｎｔｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄꎬ２０１４ꎬ５２４２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.(４):２６９－２７３.[１９]㊀ＺｈａｎｇＰꎬＨａｒｙａｄｉＲꎬＣｈａｎＫＦꎬｅｔａｌ..ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｅｌｅｍｅｎｔｓｏｆｔｈｅＧＤＰ￣ｆｕｃｏｓｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒＳＬＣ３５Ｃ１ｕｓｉｎｇａｎｏｖｅｌＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｍｕｔａｎｔ[Ｊ].Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２０１２ꎬ２２(７):８９７－９１１.[２０]㊀ＹａｎｇＺꎬＷａｎｇＳꎬＨａｌｉｍＡꎬｅｔａｌ..ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＣＨＯｃｅｌｌｓｆｏｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｄｉｖｅｒｓｅꎬｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ[Ｊ].Ｎａｔ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１５ꎬ３３(８):８４２－８４４.[２１]㊀ＦａｎＹꎬＪｉｍｅｎｅｚＤｅｌＶａｌＩꎬＭｕｌｌｅｒＣꎬｅｔａｌ..Ａｍｉｎｏａｃｉｄａｎｄｇｌｕｃｏｓｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎｆｅｄ￣ｂａｔｃｈＣＨＯｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅａｆｆｅｃｔｓａｎｔｉｂｏｄｙｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｅｎｇ.ꎬ２０１５ꎬ１１２(３):５２１－５３５.[２２]㊀ＫｉｍＢＪꎬＺｈａｏＴꎬＹｏｕｎｇＬꎬｅｔａｌ..Ｂａｔｃｈꎬｆｅｄ￣ｂａｔｃｈꎬａｎｄｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｃｕｌｔｕｒｅｓｗｉｔｈＣＨＯｃｅｌｌｌｉｎｅｓｉｎａｐｒｅｓｓｕｒｅ￣ｃｙｃｌｅｄｒｉｖｅｎｍｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｅｎｇ.ꎬ２０１２ꎬ１０９(１):１３７－１４５.[２３]㊀ＫｉｍｄｏＹꎬＣｈａｕｄｈｒｙＭＡꎬＫｅｎｎａｒｄＭＬꎬｅｔａｌ..Ｆｅｄ￣ｂａｔｃｈＣＨＯｃｅｌｌｔ￣ＰＡｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｆｅｅｄｇｌｕｔａｍｉｎｅｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｔｏｒｅｄｕｃｅａｍｍｏｎｉａｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｐｒｏｇ.ꎬ２０１３ꎬ２９(１):１６５－１７５.[２４]㊀胡显文ꎬ肖成祖ꎬ高丽华ꎬ等.用多孔微载体大规模长期培养动物细胞的方法[Ｊ].生物技术通报ꎬ２００１ꎬ(１):４５－４８. [２５]㊀ＶｅｎｔｉｎｉＤＣꎬＤａｍｉａｎｉＲꎬＳｏｕｓａＡＰꎬｅｔａｌ..ＩｍｐｒｏｖｅｄｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｗｉｔｈＣＨＯ￣ｈＴＳＨｃｅｌｌｓｏｎｈｉｇｈｅｒｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｐｒｏｖｉｄｅｓｈｉｇｈｅｒｏｖｅｒａｌｌｂｉｏｍａｓｓａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｆｏｒｒｈＴＳＨ[Ｊ].Ａｐｐｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１１ꎬ１６４(４):４０１－４０９.[２６]㊀李智ꎬ肖成祖ꎬ杨琴ꎬ等.ＣＨＯ细胞无血清结团灌流培养:超声－沉降柱二合一灌流系统[Ｊ].中国生物工程杂志ꎬ２００８ꎬ(４):５３－５８.[２７]㊀ＣｈｕｎＢＨꎬＬｅｅＹＫꎬＣｈｕｎｇＮ.Ｐｏｌｙ￣ｇａｍｍａ￣ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄｅｎｈａｎｃｅｓｔｈｅｇｒｏｗｔｈａｎｄｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｃｅｌｌｓｉｎｓｅｒｕｍ￣ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｌｅｔｔ.ꎬ２０１２ꎬ３４(１０):１８０７－１８１０.３４２郑惠惠ꎬ等:ＣＨＯ细胞表达系统研究进展. All Rights Reserved.。
蛋白质药物的研究进展
蛋白质药物的研究进展生命科学系07级生物科学（3）班魏海涛摘要：蛋白质药物是生物技术药物中重要组成部分之一。
由于其成本低、成功率高、安全可靠，已成为医药产品中重要组成部分。
现就蛋白质药物研究的现状做一个综述。
关键词：蛋白质合成给药系统近年随着化学合成和生物工程技术的迅速发展，大量的多肤和蛋白质药物不断涌现[1]，目前国内外此药物已批准上市的约50多种，处于早期或临床研究的也多达700多种[2]。
所谓蛋白质经物，就是采用DNA重组技术或其他新生物技术生产的，在蛋白质水平对疾病进行诊断、预防和治疗的药物。
1蛋白药物的合成1.1化学法合成蛋白质类药物用化学法合成多肽主要依赖于固相肽自动合成仪，它是将氨基端被保护的第1个氨基酸的羧基结合到一个不溶性载体上，使之固定，然后脱掉该氨基酸的氨基端保护基，再将第2个氨基端被保护的氨基酸的羧基与固定的第1个氨基酸的游离氨基缩合形成不溶性二肽，如此反复进行，最后经化学降解和脱保护基后，从载体上脱落目的多肽。
由于产率随每个氨基酸的缩合而递降，合成多肽的长度受到一定限制，一般在30～50氨基酸残基水平。
目前，硫酯键介导的化学连接法已被成功地应用于较小蛋白质和蛋白质结构域的合成，其主要缺点是在连接位点需要特定的亲核性氨基酸残基。
随着方法学的改进与发展，现在已经能够进行连续几个肽片断的连接，促红细胞生成素（EPO）变异体的合成就是一个成功的例子[3]。
下面是用化学法合成的多肽与蛋白质。
表1化学法合成的多肽与蛋白质[4,5]1.2化学—生物法合成蛋白质类药物化学—生物法合成蛋白质主要是利用分子克隆与生物工程技术将化学合成的小片断经特定的介导途径连接于大片断上，例如蛋白质内含子介导法，该法既解决了生物法合成的蛋白质局限于编码氨基酸又能避免化学合成法受到片断大小限制。
近年来，已成功地合成了一些多肽与蛋白质。
表2化学-生物法合成的多肽与蛋白质[6]1.3利用(His)6标识辅助的蛋白类药物合成最近有报道用(His)6标识辅助蛋白质合成的方法[(His)6tag-assistedprotein synthesis][5]。
蛋白质与糖的相互作用及其功能研究进展
蛋白质与糖的相互作用及其功能研究进展蛋白质和糖是在生物体内常见的两种分子，它们之间相互作用能够调控生物体内的许多生理过程。
近年来，科学家们在研究蛋白质与糖相互作用的过程中，发现了许多意想不到的发现，这些发现对于人类的健康和生命的理解有很大的帮助。
本文将介绍一些蛋白质与糖相互作用的基础概念，阐述其在生物体内的重要性，并总结近年来的相关研究进展。
一、基础概念蛋白质和糖是生命体中最基本的分子之一，它们在生物体内的相互作用是许多生理过程的基础。
蛋白质是由氨基酸组成的长链分子，它们通过不同的折叠形式形成不同的结构，并担任了许多生物过程中的关键角色。
糖是生物体内的一种碳水化合物，它们通常以单糖、双糖或多糖的形式存在，可以为细胞提供能量、维持细胞的结构以及调节细胞的信号转导。
蛋白质和糖之间的相互作用主要包括两种类型。
一种是糖基化修饰，即糖分子通过酰化、磷酸化或者酰胺化等化学反应与蛋白质共价结合，从而改变蛋白质的功能特性。
另一种是非共价相互作用，即糖分子通过氢键、范德华力、静电互作用等力学机制与蛋白质发生相互作用，从而影响蛋白质的三维构象和生物学功能。
二、在生物体内的重要性蛋白质和糖之间的相互作用对于生物体内的多种生理过程都有重要的调节作用。
例如，在免疫系统中，糖基化修饰的蛋白质能够作为抗体或者细胞表面受体，调节免疫细胞的活化和趋化，从而在免疫反应中发挥重要的作用。
在神经系统中，糖分子能够与神经元表面的蛋白质相互作用，调节神经元的活动和突触传递，从而维持神经系统的正常功能。
此外，蛋白质和糖之间的相互作用对于生物体内的许多代谢、分化、增殖等生理过程都有重要的作用。
三、研究进展近年来，随着技术手段的不断发展，科学家们对于蛋白质与糖相互作用的原理和功能进行了更加深入的研究。
例如，科学家们发现许多重要的蛋白质在其结构中包含了糖结构，这些糖结构能够影响蛋白质的稳定性、功能特性和互作性。
此外，科学家们还发现了许多重要的非共价相互作用类型，例如卟啉-糖相互作用、磺酸-糖相互作用和芳香-糖相互作用等，这些相互作用类型对于调节蛋白质的功能具有重要的作用。
P_糖蛋白最新研究进展_闻镍
中国药事 2011 年第 25 卷第 7 期
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排泵 , P-gp 通过 A T P 供能 , 将细胞内的药物泵出 细胞外 , 从而降低细胞内药物浓度 , 既是机体生理 状态下的自身防御保护机制 , 也是产生肿瘤 MDR 的主要原因之一 。目前 P-gp 外排作用机制的假说 中 , “疏水性真空清除泵” 的理论得到了较多的认 同[ 2-3] 。 1 P-gp 生理功能 1.1 血脑屏障上的功能 :大多数 P-g p 底物是脂溶 性的 , 理论上应该容易进入脑内 。 然而由于在脑血 管内皮细胞的腔侧面上 P-g p 高度表达 , 促使已进 入细胞内的药物泵回到血液中 , 结果净通透结果显 著降低 。 如在 mdr1a/ mdr1b 基因缺陷小鼠 , 由于 血脑屏障上 P-gp 缺乏 , 导致 P-g p 底物通透性可以 增加 10 和 100 倍 , 药物的毒性和活性显著增加 。 1.2 血睾屏障和血神经屏障 :在许多敏感组织如 睾丸 、 神经中的微血管内 皮细胞上 有 P-gp 表达 , 类似血脑屏障 , 阻止相关物质进入这些敏感组织 。 1.3 胎盘屏障 :P-g p 存在于胎盘合胞体滋养层顶 侧面膜上 。合胞体滋养层构成胎儿-母体屏障 , 交 换必需的营养物质和代谢产物 , 也起着保护作用 。 P-gp 功能类似于血脑屏障 , 防止有毒物质 从母体 进入胎儿 。 如在 P-gp 缺陷或 基因敲除 动物体内 , 阿维菌素 、 地高辛 、 塞喹那韦和紫杉醇通透性增加 10 ～ 20 倍 。 对于多数治疗药物而言 , 在胎 盘上的 低通透性当然是需要的 , 但在有些情况下 , 成为治 疗上的障碍 。 如对于 H IV 治疗 , 希望在婴儿出生 前 , 有一个合适的 “负荷剂量” , 以降低在出生过 程中母-婴 H IV 感染的频率 。 1.4 在肝-胆和肠中的作用 :在肝细胞的胆管侧细 胞膜和肠上皮细胞腔侧面膜上 , 表达丰富的 P-gp , 功能是促进药物 、 毒物从肝细胞进入胆汁和促进药 物从肠上皮细胞进入肠腔 。 肠上皮细胞中 P-gp 分 泌功能成为许多药物吸收差的主要原因之一 。 1.5 肾中 P-g p 也表达于近曲小管的腔侧面 , 也可 能是促进药物从血液侧进入尿中 。然而用 P-gp 敲 除动物模型 , 有些药物显示相反的结果 , 某些药物 在 P-gp 缺陷小鼠中的尿排泄反而高 。 这也可能有 其他原因如 P-gp 缺陷小鼠 , 药物代谢酶活性下调 , 也可能是动物的其他条件变化 , 也可能是肠和胆分 泌作用下降 , 继 发性引起尿排泄增加 。 P-g p 在肾 中的功能还需要进行更深入的研究 。 2 P-gp 的底物
生物体内有四种主要的大分子
生物体内有四种主要的大分子，分别是核酸、蛋白质、脂类和糖类。
核酸和蛋白质都是线性结构，分子间以单一的酯键或肽键相连，所以已经建立起十分成熟的研究方法。
而糖类却有不同的特点。
首先糖链高度分枝，单糖能够彼此以多种不同的键连接，所以聚糖的结构及其复杂；其次，在生物体内，糖类一般不单独存在，而是连接在蛋白质或脂类分子上。
这些化合物称为糖蛋白或糖脂。
1990年11月，三个小组同时发现了血管内皮细胞－白细胞黏附分子1（ELAM－1），后改称E选择蛋白（E－selectin），能识别白细胞表面的SLex(一种血型抗原）四聚糖。
当组织受损或感染时，白细胞黏附于内皮细胞，沿血管壁滚动并穿过管壁进入受损组织，杀灭入侵病原物，但过多的白细胞聚集，则会引起炎症及类风湿等自身免疫疾病。
这是糖结合蛋白与寡糖识别作用的首次确证。
更令人吃惊的是，在肺癌和大肠癌细胞表面也存在SLex。
这一革命性的进展，导致了糖工程的兴起，引发了一场制备抗炎和抗癌药物的大竞赛。
当基因工程和蛋白质工程药物的生产正如火如荼时，人们惊奇地发现，很多糖蛋白药物在不同细胞中表达所得的产物，其免疫原性、半寿期、生物活性等各不相同，原因就是糖基化的不同。
如何使表达产物进行合适的糖基化这一问题的提出，促使了糖基化工程（glycosylation engineering）这一新领域的产生。
糖基化工程的研究，主要集中于糖蛋白糖链功能的分析和糖基化表达体系的构建。
如科学家将昆虫细胞改造后，可表达正确的糖链；日本Kirin公司则准备改造酵母。
可以预见，糖基化工程研究在理论上可阐明糖链的功能，在实践上则可为解决基因工程药物的免疫原性、生物活性及药物设计等问题提供指导。
一、蛋白上糖链的结构糖蛋白上的糖链从连接方式上可分两类：一类是与天冬氨酰（Asn）残基连接，即N-连接糖蛋白，另一类与丝氨酸或苏氨酸连接，称为O-连接糖蛋白。
一般来说，O-糖链不含甘露糖，而N-糖链总含有大量的甘露糖，因此，通过分析单糖的组分，便可知两者的分布组成情况。
蛋白糖基化修饰和疾病研究进展
蛋白糖基化修饰和疾病研究进展摘要：糖类、蛋白质、核酸是构成生物体的三类大分子物质。
糖类除了供能和作为结构物质基础，还在细胞和蛋白质功能方面扮演着十分重要的角色。
在多种多样的生物过程中，从胚胎发育，细胞分裂，到蛋白质结构调控，糖基化都发挥作用。
在正常的生理活动和疾病过程中，多种不同蛋白质的糖基化状态发生显著变化。
因此，检测蛋白质糖基化的实验，有助于疾病预后和治疗目的的研究。
蛋白质糖基化是一种丰度高、结构类型特别复杂的蛋白质翻译后修饰类型，具有很强的宏观不均一性和微观不均一性。
据估计，细胞表达的蛋白质有50%以上为糖蛋白。
但目前为止，只有不到20%的蛋白质糖基化得到了实验证实。
蛋白质的糖基化酶促反应是一个复杂且精密的过程。
通过对蛋白质进行复杂而精确的糖基化修饰，细胞内可以产生丰富的蛋白质类型；通过对各类糖基化信号途径的精密调控，细胞中蛋白质的功能得到了极大的拓展。
丰富多样的糖蛋白在细胞内/间的信号转导、免疫调控、蛋白质稳定性维持等过程中都发挥着重要作用。
一、蛋白质糖基化主要类型与特点蛋白质糖基化修饰是在糖基转移酶的催化作用下糖链分子与蛋白质氨基酸侧链活性基团反应生成糖苷键，从而使糖链连接到蛋白质上。
根据糖基化发生的化学键类型，可将蛋白糖基化修饰主要分为N-糖基化和O-糖基化。
（一）N-糖基化修饰N-糖基化修饰发生在肽链的天冬酰胺（Asn）上，是最常见的糖基化修饰类型。
N-糖基化具有两个重要特点，第一个是具有位点特异性，N-糖基转移酶能识别特定的氨基酸基序Asn-X-Thr/Ser，（X可以是除脯氨酸之外任何氨基酸）进行修饰。
第二个是五糖核心，N-糖基化糖链都包含一个五糖核心，该核心由2个乙酰葡糖胺和3个甘露糖组成，五糖核心可进一步被修饰上其他糖，形成复杂的N-糖链结构[1]。
这两个特点为N-糖蛋白/糖肽的解析提供了重要依据。
（二）O-糖基化修饰O-糖基化修饰通常发生在肽链的丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）上，糖链与Ser/Thr侧链羟基在酶催化下产生O-糖苷键。
《安徽医药》2008年第12卷总目次索引
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徐冬辉 ， 冯婉 玉
（０ ） １ ７ （１ ） １０
关于药物动力学参数 的精确化方法的探讨
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储成 顶， 叶红 杨 ， 媛媛 许
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油酸诱导慢性胰腺炎大鼠肝脏细胞 Ｇ Ｕ ２蛋白表达 的改变 ＬＴ 赵战朝， 孙绍梅 ， 袁 咏等 （３ １） 注射用盐酸雷莫司琼与 ４种输液配伍的稳定性考察
… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … …
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Ｉ ・
安 徽 医 药
Ａ ｈ ｉ ｄｃ ｌ ｎ ｈ ｒ ｃｕｉ ｌ ｏ Ｆａ ２ ０ ｅ ； （２ ｎ ｕ ｉ ｄ Ｐ ａｍａｅ ｔ ａ ｕｎ ｌ ０ ８ Ｄ ｃ １ １） Ｍｅ ａ ａ ｃ 卷总 目次索 引 ２
综 述 与讲 座 人参炔醇研究进展 ……………… 段 贤春， 汪永 忠， 居
宋
飞 （５ １）
仙灵骨葆颗粒的质量标准研究 …… 周春燕 ， 王正俊 ， 严晓星 （６ １） 爽咽茶提取工艺研究 ……………………………… 吴新安 （ ０ ） １ ４ 羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯 的小 鼠急性 口服毒性试验 桂 留中， 胡建飞 ， 静 等 （ ０ 王 １６） 氯丙嗪和尼莫地平对锰致大鼠神经毒性 的影响
哺乳动物细胞培养过程控制对糖蛋白药物糖基化影响的研究进展
哺乳动物细胞培养过程控制对糖蛋白药物糖基化影响的研究进展李潜 张彩乔 侯丽媛 张卫婷【摘要】 在生物制药行业, 哺乳动物细胞培养系统, 尤其是主要是用于生产糖蛋白药物的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞应用最为广泛。
蛋白质糖基化可以影响工业化糖蛋白药物的活性, 因此糖基化是重组糖蛋白药物的重要质量属性。
糖蛋白药物糖基化水平的稳定性尤其需要关注, 碳水化合物结构将会决定的分子类型。
最佳的糖蛋白药物就是拥有治疗效果或者筛选出同类的糖蛋白。
通过调节哺乳动物细胞培养条件, 如改变细胞株, 培养基成分和过程控制等影响因素。
生产融合蛋白或者单克隆抗体的生物过程变量和糖蛋白药物质量有着错综复杂的联系, 糖基化程度的优化将会提高产品功效。
本文重点讨论在工业化生产中通过过程控制提升糖基化水平, 并依此了解如何控制糖蛋白药物糖基化水平。
【关键词】 生物工艺；哺乳动物细胞培养；蛋白糖基化；糖蛋白药物；蛋白质量DOI ：10.14164/11-5581/r.2017.14.112·综述·作者单位：050010 华北制药金坦生物技术股份有限公司蛋白糖基化对于蛋白疗效及糖蛋白的生产至关重要。
商业化生产糖蛋白药物首选哺乳动物表达系统, 因其具有天然蛋白加工机制, 包括蛋白糖基化, 这样就与天然的蛋白十分接近, 并保证治疗效果。
蛋白质糖基化的形成主要是由寡糖连接到天冬酰胺的侧链(N-连接)或者连接到丝氨酸/苏氨酸(O-连接)。
多糖会影响糖蛋白药物活性, 同时也会并决定该糖蛋白药物在体内的半衰期［1］。
正是因为其特点, 糖蛋白药物糖型需要满足药品监管部门的要求规范, 以确保其有效性和安全性。
1 蛋白糖基化控制在细胞培养过程控制中会影响蛋白糖基化的变量汇总。
见表1。
本文重点对细胞系、培养模式、生产工艺、细胞培养基这几方面对糖基化蛋白药物的糖基化影响研究进行总结。
1. 1 细胞系 在设计新的蛋白质疗法中, 了解一个细胞系可以影响糖基化水平十分关键。
蛋白质糖基化修饰研究进展
基因组计划的提出到现在已经有近20年的时间，科学家在基因组学领域的研究已经取得了巨大的成就，完成了包括人类、秀丽隐杆线虫、小鼠、果蝇、蚊子、水稻、家蚕和蜜蜂等物种的基因组测序工作。
但仅仅拥有基因序列，仍然无法很好的解释其生物功能，也不能解释生物的生命活动规律。
因为作为生命体现者的蛋白质与基因之间并不存在严格的线性关系，所以研究人员也逐渐从基因组学研究转向了蛋白质组学研究，研究生命的体现者蛋白质的表达模式和功能模式。
但是蛋白质在生命体内又是动态变化的，并存在多种翻译后修饰，包括磷酸化、糖基化、泛素化、脂蛋白质糖基化修饰研究进展李军，杜鑫，Hosseini Moghaddam S.H.，陈玉银*（浙江大学动物科学学院，杭州310029）摘要：蛋白质翻译后修饰是蛋白质组学的一个组成部分，而蛋白质糖基化是生命体中最重要的一种蛋白质翻译后修饰之一。
糖基化在细胞免疫、信号传导、蛋白翻译调控、蛋白降解等诸多生物过程中起着重要作用。
随着蛋白质组学技术的不断发展，糖基化研究也越来越受到广泛的关注。
本文综述了糖基化的分类、在生命体中的作用、最新的研究技术及进展。
关键词：蛋白质糖基化；免疫；糖基捕获；质谱中图分类号：Q51文献标识码：A文章编号：1001-7119（2009）06-0773-06The Research Progress in Protein Glycosylation ModificationLI Jun ，DU Xin ，Hosseini Moghaddam S.H.，CHEN Yuyin *（College of Animal Sciences ，Zhejiang University ，Hangzhou 310029，China ）Abstract ：Glycosylation is one of the most important post -translational modifications of the protein.It plays important role in many activities of life ，including cell immune ，signal transduction ，regulation of protein translation ，protein degradation.With the rapid advance in the proteomics ，more and more studies are focusing on glycosylation.This article reviewed the types of glycosylation ，its function and the techniques to study glycosylation.Key words ：protein glycosylation ；immune ；glyco -catching ；mass spectrometry收稿日期：2008-06-20基金项目：国家重点基础研究发展计划项目（编号2005CB121003）作者简介：李军（1984-），男，浙江萧山人，博士研究生，主要从事蛋白质组学研究。
糖蛋白药物的多糖结构解析进展
生物技术进展２０１６年㊀第６卷㊀第４期㊀２４４~２４８ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ㊀ＩＳＳＮ２０９５￣２３４１进展评述Ｒｅｖｉｅｗｓ㊀收稿日期:２０１６￣０４￣２５ꎻ接受日期:２０１６￣０５￣０４㊀基金项目: 十二五 国家科技重大专项(２０１４ＺＸ０９２０１０４１)ꎻ河北省科技计划项目(１６２７２４０１Ｄ)资助ꎮ㊀作者简介:刘艳玲ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事生物技术药物质量控制研究ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｙａｎｌｉｎｇｌｉｕ２０１０＠１６３.ｃｏｍꎮ∗通信作者:王志明ꎬ高级工程师ꎬ研究方向为生物技术药物研发ꎮＥ￣ｍａｉｌ:138****2037＠１３９.ｃｏｍ糖蛋白药物的多糖结构解析进展刘艳玲ꎬ㊀刘晓志ꎬ㊀赵㊀伟ꎬ㊀王志明∗华北制药集团新药研究开发有限责任公司ꎬ抗体药物研制国家重点实验室ꎬ石家庄０５００１５摘㊀要:细胞表达的治疗性单克隆抗体多数是糖蛋白ꎮ附着在蛋白质上的多糖直接影响蛋白质药物的稳定性㊁生物活性及免疫原性ꎮ因此ꎬ应对糖蛋白产品上的多糖进行充分分析ꎬ以控制产品质量ꎮ然而ꎬ糖蛋白上多糖的复杂性对检测带了艰巨挑战ꎮ介绍了糖蛋白上多糖分析的最新进展ꎬ以及利用凝集素芯片技术的高通量多糖分析法ꎬ重点介绍了用于检测糖基化位点㊁糖链结构和含量的测定分析方法ꎬ以期为糖蛋白药物的研发提供参考ꎮ关键词:治疗性糖蛋白药物ꎻ多糖分析ꎻ凝集素芯片技术ＤＯＩ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.２０９５￣２３４１.２０１６.０４.０４ＰｒｏｇｒｅｓｓｏｎＧｌｙｃａｎＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＧｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎＬＩＵＹａｎ￣ｌｉｎｇꎬＬＩＵＸｉａｏ￣ｚｈｉꎬＺＨＡＯＷｅｉꎬＷＡＮＧＺｈｉ￣ｍｉｎｇ∗ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｎｔｉｂｏｄｙＲｅｓｅａｒｃｈ＆ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔꎬＮｅｗＤｒｕｇＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＣｏｍｐａｎｙＬｔｄ.ꎬＮｏｒｔｈＣｈｉｎａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎꎬＳｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ０５００１５ꎬＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ:Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ(ｍＡｂｓ)ａｒｅｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙｌｉｖｉｎｇｃｅｌｌｓｙｓｔｅｍｓ.Ｔｈｅｇｌｙｃａｎｍｏｉｅｔｉｅｓａｔｔａｃｈｅｄｔｏｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｓｃａｎｄｉｒｅｃｔｌｙａｆｆｅｃｔｐｒｏｔｅｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙꎬｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ.Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅꎬｇｌｙｃａｎｖａｒｉａｎｔｓｏｆａｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｐｒｏｄｕｃｔｍｕｓｔｂｅａｄｅｑｕａｔｅｌｙａｎａｌｙｚｅｄａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｔｏｅｎｓｕｒｅｐｒｏｄｕｃｔｑｕａｌｉｔｙ.Ｈｏｗｅｖｅｒꎬｔｈｅｉｎｈｅｒｅｎｔｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙｏｆｐｒｏｔｅｉｎｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｐｏｓｅｓａｄａｕｎｔｉｎｇａｎａｌｙｔｉｃａｌｃｈａｌｌｅｎｇｅ.Ｔｈｉｓｒｅｖｉｅｗｐｒｏｖｉｄｅｄａｎｕｐｄａｔｅｏｆｒｅｃｅｎｔａｄｖａｎｃｅｓｉｎｇｌｙｃａｎａｎａｌｙｓｉｓꎬｉｎｃｌｕｄｉｎｇｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｕｔｉｌｉｔｙｏｆｌｅｃｔｉｎ￣ｂａｓｅｄｍｉｃｒｏａｒｒａｙｆｏｒｈｉｇｈｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｇｌｙｃａｎｐｒｏfiｌｉｎｇ.Ｅｍｐｈａｓｉｓｗａｓｐｌａｃｅｄｏｎｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｅｍａｊｏｒｔｙｐｅｓｏｆａｎａｌｙｔｉｃｓｆｏｒｕｓｅｉｎｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｕｎｉｑｕｅｇｌｙｃａｎｆｅａｔｕｒｅｓｓｕｃｈａｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｓｉｔｅꎬｇｌｙｃａｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｃｏｎｔｅｎｔꎬｗｈｉｃｈｗａｓｅｘｐｅｃｔｅｄｔｏｐｒｏｖｉｄｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓꎻｇｌｙｃａｎａｎａｌｙｓｉｓꎻｌｅｃｔｉｎｍｉｃｒｏａｒｒａｙ㊀㊀细胞表达的生物技术药物多数是糖蛋白ꎬ包括单克隆抗体㊁重组蛋白㊁融合蛋白㊁生长因子㊁细胞因子㊁酶和激素ꎮ这些药物被用于癌症㊁自身免疫性疾病及其他危及生命的疾病的治疗ꎮ适度糖基化对药物的溶解性㊁稳定性㊁生物活性㊁安全性㊁药代动力学和药效动力学等特征具有重要影响ꎮ药物糖基化不但可以增加药物体外稳定性ꎬ还可以保护蛋白药物免受体内蛋白酶的降解ꎮ非糖基化促红细胞生成素(ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎꎬＥＰＯ)较糖基化ＥＰＯꎬ更易受到化学物质㊁ｐＨ变化或是加热引起的变性或降解ꎮ蛋白质糖基化可以影响蛋白药物ＰＫ/ＰＤ特征ꎬ研究显示ꎬ末端半乳糖部分糖基化蛋白ꎬ较末端唾液酸完成糖基化蛋白具有更短的循环寿命ꎮ由于肝细胞表达的唾液酸糖蛋白受体同半乳糖结合ꎬ促进了肝脏对部分糖基化蛋白的清除ꎮ特异性结合末端甘露糖㊁Ｎ￣乙酰葡糖胺(ＧｌｃＮＡｃ)和岩藻糖凝集素样受体ꎬ也可以清除含有上述糖基的糖蛋白药物ꎮ此外ꎬＦｃ片段糖基化对于Ｆｃ和Ｆｃγ受体相互作用至关重要ꎮ人Ｆｃγ受体分为激活型受体(ＦｃγＲＩａ㊁ＦｃγＲＩＩａ和ＦｃγＲＩＩＩａ)及抑制型受体(ＦｃγＲＩＩｂ)ꎮＦｃ片段糖基化影响抗体ＦｃγＲｓ或补体Ｃ１ｑ的亲和常数ꎬ进而影响其免疫功能ꎬ如抗. All Rights Reserved.体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ａｎｔｉｂｏｄｙ￣ｄｅ￣ｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙꎬＡＤＣＣ)㊁抗体依赖性细胞吞噬(ａｎｔｉｂｏｄｙ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓꎬＡＤＣＰ)和补体依赖的细胞毒作用(ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙꎬＣＤＣ)ꎮ优化Ｆｃ片段的糖基化ꎬ可以提高治疗性单克隆抗体的药物活性ꎮ１ 蛋白质的糖基化修饰蛋白质糖基化是复杂的翻译后修饰过程ꎬ在蛋白特定位点上进行糖基化修饰ꎬ通常修饰位点是天冬酰胺残基(Ｎ￣链接)或是丝氨酸/苏氨酸残基(Ｏ￣链接)ꎬＮ￣链接糖基化修饰通常发生在Ａｓｎ￣Ｘ￣Ｓｅｒ/Ｔｈｒ(Ｘ是非脯氨酸氨基酸)ꎬＯ￣链接糖基化修饰通常发生在丝氨酸(Ｓｅｒ)或苏氨酸(Ｔｈｒ)残基上ꎬ通过Ｎ￣乙酰半乳糖胺(Ｇａｌ￣ＮＡｃ)和Ｓｅｒ/Ｔｈｒ的羟基形成Ｏ￣糖苷键ꎮ蛋白质糖基化过程从内质网开始ꎬ将Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２糖链添加到Ａｓｎ￣Ｘ￣Ｓｅｒ/Ｔｈｒ序列的Ａｓｎ上ꎮ通过各种糖苷酶修剪ꎬ糖蛋白被运输到高尔基体进行下一步修饰ꎮ通过多次催化修饰ꎬ形成多种Ｎ￣糖链结构ꎬ如高甘露糖ꎬ复杂㊁混合糖等结构ꎮＯ￣链接糖的生物合成ꎬ是在高尔基体内将ＵＤＰ￣ＧａｌＮＡｃ转化为Ｇａｌ￣ＮＡｃꎬ再连接到Ｓｅｒ/Ｔｈｒ残基上ꎮＯ￣ＧａｌＮＡｃ前体的起源不同ꎬ因此产生了８种Ｏ￣ＧａｌＮＡｃ聚糖核心结构ꎬ哺乳动物中常见是其中的４种聚糖核心结构ꎮ蛋白质药物的糖基化通常受到宿主细胞类型和发酵条件(如培养基㊁ｐＨ㊁温度㊁搅拌)的影响ꎮ治疗性蛋白药物通常使用哺乳动物细胞㊁酵母或转基因动物进行生产ꎬ每种宿主系统都具有独特的糖基化机制ꎬ生产的蛋白药物也具有不同的糖基化模式[１ꎬ２]ꎮ哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞)被广泛用于治疗性糖蛋白的生产ꎮ哺乳动物细胞表达的蛋白可能含有少量非人源多糖ꎬ如高含量甘露糖修饰的Ｎ￣羟乙酰神经氨酸(Ｎｅｕ５Ｇｃ)和末端α１￣３￣半乳醣(α￣Ｇａｌ)ꎮ其他表达系统(转基因植物和转基因动物)可能会产生更多的非人源多糖ꎬ如木糖蛋白多糖㊁Ｎｅｕ５Ｇｃ或末端α￣Ｇａｌꎬ这些多糖的存在可以引起药物的免疫原性反应ꎮ由于复杂的糖基化过程ꎬ在糖基化模式上会存在宏观和微观的异质性ꎮ宏观异质性是指糖基化位点和数量的变化ꎬ而微观异质性是指在特定位点上的糖链结构的变化ꎮ宏观和微观的异质性有助于产生多样性糖基ꎬ虽然其蛋白质氨基酸系列相同ꎬ但糖基化位点㊁糖含量或结构都有可能不同[３]ꎮ治疗性糖蛋白药物糖链异质性的多水平(糖蛋白药物㊁多糖㊁单糖水平)分析面临着诸多挑战ꎮ治疗性糖蛋白药物ꎬ特别是生物仿制药的研发过程中ꎬ通常要联合使用多种方法对其糖基化的性质进行分析ꎬ如糖基化位点㊁糖链结构和数量等ꎮ高效液相色谱法(ＨＰＬＣ)㊁毛细管电泳(ＣＥ)㊁质谱(ＭＳ)㊁等电聚焦(ＩＥＦ)和凝集素芯片法等方法常被用于完整糖蛋白㊁糖肽多糖㊁多糖和单糖分析[４]ꎮ可以直接对完整糖蛋白多糖的一般模式和异质性进行分析ꎮ可以使用电喷雾电离－飞行时间质谱(ＥＳＩ￣ＴＯＦ)和反相(ＲＰ)的高效液相色谱或排阻色谱(ＳＥＣ)完成上述检测ꎮＲＰＬＣ￣ＭＳ检测可以为蛋白质检测提供更好的色谱分离ꎬ并在检测完整的单克隆抗体时表现出很高的分辨率[大约(１５００００ʃ１.５)Ｄａ]ꎬ但检测过程需要较高柱温(６０~８０ħ)ꎮ虽然ꎬＳＥＣ￣ＭＳ可以使用非变性或变性流动相在室温条件下工作ꎬ得到高质量的质谱结果ꎬ但是其分辨率比ＲＰ低ꎮＬＣ￣ＥＳＩ￣ＭＳ可以用于更复杂的治疗性蛋白检测ꎬ如促红细胞生成素ꎬ这个产品中包括了１个Ｏ￣糖基化位点和３个Ｎ￣糖基化位点[５]ꎮ而传统ＥＳＩ￣ＴＯＦ￣ＭＳ可以用于分析结构更复杂的异构糖蛋白ꎬ如ｄａｒｂｅｐｏｅｔｉｎ￣α(已知含有５个Ｎ￣糖基化位点)[６]ꎬ但在变性条件下检测仍难以完成ꎬ最近开发的ＯｒｂｉｔｒａｐＥｘａｃ￣ｔｉｖｅＴＭ和高分辨质谱仪联用ꎬ可以在自然条件下得到高度复杂的高分辨的糖链信息[７]ꎬ这项技术的优势在于ꎬ使用水性醋酸铵缓冲液对检测蛋白离子化处理ꎬ使得蛋白处于无电荷的天然折叠状态ꎮ此外ꎬＥＳＩ￣ＭＳ和ＭＡＬＤＩ￣ＭＳ的联合使用可以用于小型完整糖蛋白的多糖分析ꎬ但是质谱的分辨率低[５]ꎮ为了提高分析的灵敏度ꎬ可以将单克隆抗体药物还原为重链和轻链再进行分析ꎮ常使用二硫苏糖醇㊁β￣巯基乙醇㊁半胱胺等还原剂ꎮ另外可以选择木瓜蛋白酶㊁胃蛋白酶㊁ＩｄｅＺ和ＩｄｅＳ将单克隆抗体降解为更小的片段ꎮ木瓜蛋白酶作用于ＩｇＧ铰链区上方ꎬ将ＩｇＧ裂解为３个片段ꎬ２个Ｆａｂ和１个Ｆｃ片段ꎬ胃蛋白酶作用于ＩｇＧ铰链区下方ꎬ将ＩｇＧ裂解为Ｆ(ａｂ )２和降解的Ｆｃ片段ꎮ５４２刘艳玲ꎬ等:糖蛋白药物的多糖结构解析进展. All Rights Reserved.ＩｄｅＺ和ＩｄｅＳ将ＩｇＧ裂解为Ｆ(ａｂ )２和一个完成的Ｆｃ片段[８]ꎮ也可以ＣＥ￣ＭＳ进行糖基异质性分析ꎮ使用ＩＥＦ㊁ＣＥ㊁ｃＩＥＦ或是ＩＥＸ色谱法ꎬ在完整糖蛋白水平上进行蛋白质唾液酸化的异质性分析ꎮ这些方法通常用于质量控制检测ꎻＩＥＦ和ＩＥＸ是传统方法ꎬ但与ＭＳ不兼容ꎮＣＥ和ｃＩＥＦ是新兴技术具有高速㊁高分辨率和ＭＳ兼容等优势ꎬ但毛细血管可能会吸附蛋白质[９]ꎮ２㊀糖蛋白药物中糖基化位点及多糖组成分析㊀㊀利用ＥＳＩ￣ＭＳ或ＭＡＬＤＩ￣ＭＳ对蛋白质的糖基化位点和占有率进行分析ꎮ可以使用这种方法分析很难从肽链上解离的Ｏ￣链接糖基ꎮ通过多肽分析ꎬ可以检测其他翻译后的多糖修饰ꎮ用对蛋白质系列高度特异的蛋白酶ꎬ如胰蛋白酶㊁Ｌｙｓ￣Ｃ或Ｇｌｕ￣Ｃꎬ将糖蛋白降解为适当的片段ꎮ再用多种组合方法对片段进行检测ꎬ例如对ＥＰＯ的检测ꎮ糖蛋白质降解形成糖多肽ꎬ在ＭＳ分析之前ꎬ通常使用ＨＰＬＣ对糖多肽进行分类富集ꎬ以克服因电离子引起的糖肽信号抑制ꎮ可以通过ＨＰＬＣ和ＥＳＩ￣ＭＳ的联合使用实现在线检测ꎬ或使用ＭＡＬＤＩ￣ＭＳ进行离线检测ꎬ现在较为广泛高效使用的ＬＣ￣ＥＳＩ￣ＭＳ可以实现在线检测ꎮ由于共洗脱高丰度糖肽的离子抑制ꎬ使用传统Ｃ１８柱ＲＰＬＣ￣ＭＳ分析检测低丰度糖肽时面临诸多挑战ꎮＨＩＬＩＣ可以更好地分离亲水性糖多肽和常规多肽ꎮ但是ꎬ具有相同质量糖多肽的异构体不能通过这种方法进行分离ꎮ最近ꎬ一种新型纳米ＬＣ￣ＭＳ方法可以用于分离糖多肽异构体ꎮ在包被微流毛细管芯片的多孔石墨碳中ꎬ链霉蛋白酶Ｅ可以将糖多肽异构体的肽链进行非特异性消化ꎬ使肽链的氨基酸残基小于３个ꎬ便于糖多肽的分离和检测ꎮ另一方面ꎬ发酵过程中Ｆｃ糖基化的高通量检测技术得到了发展[１０]ꎮ用结合ＰｒｏｔｅｉｎＡ９６孔板对ＩｇＧ进行纯化ꎬ胰蛋白酶消化糖蛋白ꎬＨＩＬＩＣ提取ꎬ再进行ＥＳＩ￣ＭＳ分析ꎬ这种方法可以不使用ＨＰＬＣ对糖多肽进行分离[１１]ꎮ单电荷离子产生的ＭＡＬＤＩ质谱图相对简单ꎬ因此ＭＡＬＤＩ较ＥＳＩ更适合用于糖肽分析ꎮ但是存在非唾液酸糖肽的衰变对实验的干扰ꎬ需要在ＭＡＬＤＩ￣ＭＳ分析时对样品进行唾液酸衍生处理ꎮ糖肽串联质谱分析可以测定糖肽上的糖基化位点及多糖组成ꎮ最近开发的电子转移解离(ＥＴＤ)技术ꎬ可以裂解肽键对糖蛋白的糖基化位点进行分析ꎮ而碰撞诱导解离(ＣＩＤ)技术ꎬ可以将多糖从糖肽上解离下来ꎬ分析多糖的组成和序列信息ꎮ将这些方法组合在一个ＬＣ￣ＭＳ实验中ꎬ可以得到有效的糖肽序列信息[１２]ꎮＣＥ￣ＭＳ可以在糖肽水平上对其特异结合位点的微观异质性进行有效分析ꎮ传统ＲＰＬＣ￣ＭＳ检测中ꎬ高度亲水性肽可能与ＲＰ色谱基质发生作用ꎬ造成样品在上样和脱盐过程中的丢失ꎮ因此ＣＥ￣ＭＳ可以更好的用于亲水性多肽检测并实现完整的序列覆盖ꎮ３㊀糖蛋白药物中解离多糖的组成分析Ｎ￣糖苷酶Ｆ可以将Ｎ￣链接多糖从糖蛋白上解离下来ꎮ通常使用还原碱性技术将Ｏ￣链接多糖从糖蛋白上释放ꎬ但是ꎬ很难将全部的多糖释放ꎮＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦＭＳ对糖链进行快速鉴定ꎬ使用甲基化加强电离的有效性和唾液酸化糖的稳定性ꎮ此外ꎬ酯化唾液酸可以增加唾液酸的稳定性ꎬ同时可以使用ＭＡＬＤＩ￣ＭＳ对不同的唾液酸键(ａ２￣３和ａ２￣６)进行分别检测ꎮ为了方便ＨＰＬＣ和ＭＳ的多糖分析ꎬ通常使用还原胺化反应对多糖进行荧光标记ꎮ最常用的荧光标记物有:２￣氨基苯甲酰胺(２￣ＡＢ)和氨茴酸(２￣ＡＡ)ꎮ２￣ＡＢ缺少负电荷ꎬＨＰＬＣ是数据库建立的金标准ꎬ但是电离效率低ꎮ２￣ＡＡ带有一个负电荷ꎬ适用于ＣＥ和ＭＡＬＤＩ分析ꎮ最近研究表明ꎬ普鲁卡因胺较２￣ＡＢ荧光标记多糖ꎬ具有更好的电离效率和荧光强度ꎬ有利于对应低丰度Ｎ￣链接多糖的分析[１３]ꎮＨＰＬＣ和ＭＳ分析前的纯化步骤有利于多余标签和盐的去除ꎬ他们包括用于标记检测的ＨＩＬＩＣ㊁ＲＰ㊁ＰＧＣ和凝胶过滤等方法[１４]ꎮ使用ＨＩＬＩＣ㊁ＲＰ￣ＨＰＬＣ或阴离子交换ＨＰＬＣ(ＡＥ￣ＨＰＬＣ)等色谱方法对标记的多聚糖进行分离ꎮＨＩＬＩＣ较ＨＰＬＣ方法在分离多糖时ꎬ表现出更好的分辨率ꎮ２￣ＡＢ标记的多糖洗脱同２￣ＡＢ标记的葡聚糖标准(葡萄糖均聚物)进行比较ꎬ葡聚糖标准是一组葡萄糖聚合数已知的物质标准ꎮ这６４２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.个信息可以用于计算单糖丰度ꎬ预测糖链结构ꎮ另一方面ꎬ没有荧光标记的Ｎ￣糖链ꎬ可以通过ＨＰＬＣ同ＨＰＡＥＣ￣ＰＡＤ或是ＰＧＣ色谱联用进行分析ꎬ但是方法的耐用性和重复性较差ꎮ荧光标记的解离多糖也可以使用ＣＥ进行分析ꎬ得到高灵敏度和分辨率的分析结果ꎮ低聚糖ＣＥ分析常使用ＡＰＴＳ(或２￣ＡＡ等)作为荧光标记物ꎬ可以用于区分糖链结构的同分异构体ꎮ然而ꎬ只有几个多糖标准有相对应的糖链结构ＣＥ峰信号ꎮ因此ꎬ利用ＣＥ对糖苷外切酶顺序消化的寡糖进行分析ꎬ可以得到更详细的多糖序列信息ꎮＭＳ和ＣＥ￣ＭＳ联用可以对肽和糖型特性进行分析ꎬ但在寡糖分析中的应用有限ꎮ利用ＨＩＬＩＣ㊁ＣＥ和ＨＰＡＥＣ￣ＰＡＤ等７种方法ꎬ对Ｆｃ解离的多糖进行分析ꎬ各种分析方法得到的糖型和含量结果相似ꎮ由于寡糖异构和支链的存在ꎬ对糖链结构的确认带来了挑战ꎮ传统方法是使用糖苷外切酶ꎬ将末端的单糖依次解离ꎬ再用ＨＩＬＩＣ㊁ＣＥ或ＭＡＬＤＩ￣ＭＳ进行分析ꎮ根据不同糖苷酶实验得到的葡萄糖数目㊁消化时间和质谱数据变化ꎬ推测糖链原始结构对于新糖链结构分析ꎬ使用这些方法可以得到有价值的信息ꎬ但是方法耗时长ꎬ且需要高纯度糖苷酶进行糖链消化[１５]ꎮＬＣ￣ＥＳＩ￣ＣＩＤ￣ＭＳ/ＭＳ用于糖链测序ꎬ具有速度快㊁灵敏度高的优势ꎮ使用ＭＳ分析糖苷链方式时ꎬ需要在负离子模式低能量ＣＩＤ条件下ꎬ使用ＥＳＩ￣ＱＴＯＦＭＳ将糖苷环切开ꎮ但是ꎬＭＳ分析不能解决结构异构体及确定糖链的三维结构等问题ꎮ上述问题可以通过核磁共振(ＮＭＲ)和结晶Ｘ射线等方法解决ꎮ核磁共振被用于新糖链信息结构的确认ꎬ但是需要样品量大ꎮ新研发的离子迁移(ＩＭ)ＭＳ技术ꎬ根据分子大小㊁形状㊁电荷情况将其电离为气相ꎬ增加了检测糖链异构体的有效性ꎮ４㊀糖蛋白药物中解离单糖的组成分析释放单糖定量分析可以提供特定末端单糖的含量信息ꎬ如唾液酸㊁甘露糖￣６￣磷酸(Ｍ６Ｐ)㊁Ｎ￣乙酰葡萄糖胺和Ｏ￣连接单糖ꎮ唾液酸残基可以由温和酸水解或神经氨酸酶特异性的水解ꎮ通常使用ＨＰＡＥＣ￣ＰＡＤ对唾液酸进行定量分析ꎮ使用唾液酸标准ꎬ可以完成唾液酸的绝对定量ꎮ将唾液酸进行荧光标记后ꎬ可以进行ＲＰ￣ＨＰＬＣ分析ꎮ对于其他单糖ꎬ通常使用浓酸水解法再用ＨＰＬＣ进行分离ꎮ特别是唾液酸选择性水解后ꎬ通常使用三氟乙酸进行多糖水解ꎬ产生的氨基单糖通常被Ｎ￣乙酰化ꎮ酸水解常见问题是酸性条件下糖链的不完全水解及水解单糖不稳定ꎮ通常使用ＨＰＡＥＣ￣ＰＡＤ进行非唾液酸单糖的定性和定量分析ꎬ并使用２￣脱氧葡萄糖作为这些中性单糖的标准ꎮ５㊀利用凝集素芯片技术解析糖蛋白药物的多糖结构㊀㊀凝集素是一组糖结合蛋白(Ｇｂｐｓ)ꎬ在植物和许多物种中存在ꎬ可以选择性地与蛋白质结合的多糖分子或是解离的多糖分子进行相互作用ꎮ基于这种特性ꎬ人们开发了多糖分析方法ꎬ基于凝集素芯片开发的几种技术平台ꎬ用于治疗糖蛋白药物的多糖分析[１６ꎬ１７]ꎮ特定凝集素被固定到固相载体上(如玻璃载片)ꎬ使用化学物质(如环氧㊁ＮＨＳ酯㊁金或氨基)活化或生物物质(如链霉亲和素)事先将固相载体活化ꎮ凝集素包被后ꎬ使用Ｔｒｉｓ缓冲液或牛血清白蛋白封闭固相载体上残余的活性位点ꎮ将糖蛋白样品在检测芯片上同特定凝集素结合ꎬ通过洗涤程序去除未结合糖蛋白ꎬ再经特定显色技术检测ꎮ这样的操作程序会破坏凝集素和多糖之间的稳态相互作用[１５]ꎮ因为相对于抗原－抗体和生物素－亲和素复合物的高结合性ꎬ凝集素－多糖复合物的结合性相对较弱ꎮ近期开发的荧光系统ꎬ可在没有洗涤过程的情况下对凝集素－多糖相互作用进行实时监控[１８]ꎮ该检测平台已经应用于检测纯化后的糖蛋白㊁粗提取膜蛋白㊁活细胞质膜蛋白质等多种糖蛋白ꎮ有研究比较了３种色谱分析(ＨＰＡＥＣ￣ＰＡＤ㊁２￣ＡＡＨＩＬＩＣ㊁２￣ＡＢＨＩＬＩＣ)和凝集素法用于治疗性单克隆抗体的多糖分析[１９ꎬ２０]ꎮ凝集素法可识别单克隆抗体多糖结构类ꎬ检测结果与其他方法一致[２１]ꎮ已经有商业凝集素芯片(包含４５种不同凝集素)由于检测ＦＤＡ批准多种治疗性糖蛋白药物(含９种单克隆抗体)ꎮ对于治疗性蛋白质药物检测ꎬ凝集素法在检测多糖变异体中具有优势ꎮＭＳ方法需要涉及较多的样品处理步骤ꎬ而凝集素法可直接作用于完整糖蛋白ꎬ且需要样品量小ꎮ７４２刘艳玲ꎬ等:糖蛋白药物的多糖结构解析进展. All Rights Reserved.该凝集素芯片ꎬ与精密的检测系统结合后ꎬ为治疗性蛋白质药物多糖检测提供了一个快速的高通量平台ꎮ但是凝集素法仍面临挑战ꎬ使用凝集素多是天然物质ꎬ可与糖蛋白的亲和力弱ꎬ阻碍了技术的进一步推广ꎮ６ 展望蛋白质药物的糖基化复杂性使其分析面临诸多挑战ꎮ糖蛋白类药物的正交方法可用来描述其糖基化特征:①糖含量(中性糖㊁氨基糖和唾液酸)ꎻ②糖链结构ꎬ寡糖模式ꎻ③糖基化位点ꎮ糖蛋白的检测方法取决于检测目的和方法属性ꎮＩＥＦ㊁ＩＥＸ和ＣＥ及其组合方法ꎬ常用于完整性糖蛋白唾液酸类异质性的检测ꎮＨＰＬＣ被广泛用于检测解离的寡糖含量ꎮＭＳ￣ＨＰＬＣ用于检测糖基化位点和糖结构ꎮ然而ꎬ检测低聚糖前需要将糖链解离ꎻ进行检测时ꎬ必须保证多糖的有效解离和方法的适当调整ꎬ以保证多糖的结构没有太大的改变ꎮ新近发展的凝集素芯片技术ꎬ可直接测量完整蛋白多糖的变化ꎬ而无需将其从蛋白质上解离ꎬ这在蛋白质的糖基化方面ꎬ对现有技术是一个有力补充ꎮ参㊀考㊀文㊀献[１]㊀ＣｈｏｉＢＫꎬＷａｒｂｕｒｔｏｎＳꎬＬｉｎＨꎬｅｔａｌ..ＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆＮ￣ｇｌｙｃａｎｓｉｔｅｏｃｃｕｐａｎｃｙｏｆｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓｐｒｏｄｕｃｅｄｉｎＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ[Ｊ].Ａｐｐｌ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１２ꎬ９５(３):６７１－６８２.[２]㊀ＴｕｒｙａｎＩꎬＨｒｏｎｏｗｓｋｉＸꎬＳｏｓｉｃＺꎬｅｔａｌ..ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｗｏａｐｐｒｏａｃｈｅｓｆｏｒｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＯ￣ｌｉｎｋｅｄｇｌｙｃａｎａｎａｌｙｓｉｓｕｓｅｄｉｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓ[Ｊ].Ａｎａｌｙ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.ꎬ２０１４ꎬ４４６:２８－３６.[３]㊀ＧａｂｉｕｓＨＪ.Ｇｌｙｃｏｂｉｏｍａｒｋｅｒｓｂｙｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓａｎｄｇｌｙｃａｎｐｒｏｆｉｌｉｎｇ(ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ):ｅｍｅｒｇｅｎｃｅｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ[Ｊ].Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｓｏｃ.Ｔｒａｎｓａｃ.ꎬ２０１１ꎬ３９(１):３９９－４０５. [４]㊀ＬｏｍｂａｒｄｉＡꎬＡｎｄｒｅｏｚｚｉＣꎬＰａｖｏｎｅＶꎬｅｔａｌ..Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｆｏｌｌｉｃｌｅｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ[Ｊ].Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓꎬ２０１３ꎬ３４(１６):２３９４－２４０６.[５]㊀ＳｅｇｕＺＭꎬＨｕｓｓｅｉｎＡꎬＮｏｖｏｔｎｙＭＶꎬｅｔａｌ..ＡｓｓｉｇｎｉｎｇＮ￣ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｓｉｔｅｓｏｆｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓｕｓｉｎｇＬＣ/ＭＳＭＳｉｎｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎｗｉｔｈｅｎｄｏ￣Ｍ/ｅｘｏｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅｍｉｘｔｕｒｅ[Ｊ].Ｊ.ＰｒｏｔｅｏｍｅＲｅｓ.ꎬ２０１０ꎬ９(７):３５９８－３６０７.[６]㊀ＳｃｈｗａｒｚｅｒＪꎬＲａｐｐＥꎬＲｅｉｃｈｌＵ.Ｎ￣ｇｌｙｃａｎａｎａｌｙｓｉｓｂｙＣＧＥ￣ＬＩＦ:ｐｒｏｆｉｌｉｎｇｉｎｆｌｕｅｎｚａＡｖｉｒｕｓｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎＮ￣ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇｖａｃｃｉｎｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ[Ｊ].Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓꎬ２００８ꎬ２９(２０):４２０３－４２１４.[７]㊀ＭｉｙａｈａｒａＫꎬＮｏｕｓｏＫꎬＭｏｒｉｍｏｔｏＹꎬｅｔａｌ..ＰｒｏｇｎｏｓｔｉｃｖａｌｕｅｏｆａｌｔｅｒｅｄＮ￣ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｏｆｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｕｎｒｅｓｅｃｔａｂｌｅｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ[Ｊ].Ｐａｎｃｒｅａｓꎬ２０１５ꎬ４４(４):５５１－５５６.[８]㊀ＢｕｃｋＰＭꎬＫｕｍａｒＳꎬＳｉｎｇｈＳＫ.ＣｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｇｌｙｃａｎｔｒｕｎｃａｔｉｏｎｏｎＦｃｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｉｎｔｅｇｒｉｔｙ[Ｊ].ｍＡｂｓꎬ２０１３ꎬ５(６):９０４－９１６.[９]㊀ＳｏｎｇＷꎬＭｅｎｔｉｎｋＲＡꎬＨｅｎｑｕｅｔＭＧꎬｅｔａｌ..Ｎ￣ｇｌｙｃａｎｏｃｃｕｐａｎｃｙｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＮ￣ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ[Ｊ].Ｊ.Ｐｒｏｔｅｏｍ.ꎬ２０１３ꎬ９３:３４３－３５５.[１０]㊀ＲｅｕｓｃｈＤꎬＨａｂｅｒｇｅｒＭꎬＭａｉｅｒＢꎬｅｔａｌ..ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｔｈｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＧＦｃ￣ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅｓ ｐａｒｔ１:ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ￣ｂａｓｅｄｍｅｔｈｏｄｓ[Ｊ].ｍＡｂｓꎬ２０１５ꎬ７(１):１６７－１７９.[１１]㊀ＬｕＣꎬＷｏｎｓｉｄｌｅｒＪＬꎬＬｉＪꎬｅｔａｌ..Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ￣ｂｌｏｃｋｅｄａｎｔｉｂｏｄｙｍｉｃｒｏａｒｒａｙｆｏｒｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄｈｉｇｈ￣ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｐｒｏｆｉｌｉｎｇｏｆｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｏｔｅｉｎｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｉｎｃｏｍｐｌｅｘｓａｍｐｌｅｓ[Ｊ].Ｊ.Ｖｉｓｕａｌ.Ｅｘｐ.ꎬ２０１２ꎬ６３:ｅ３７９１.[１２]㊀ＰａｔｗａＴꎬＬｉＣꎬＳｉｍｅｏｎｅＤＭꎬｅｔａｌ..Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎａｎａｌｙｓｉｓｕｓｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓａｎｄｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ[Ｊ].ＭａｓｓＳｐｅｃｔ.Ｒｅｖ.ꎬ２０１０ꎬ２９(５):８３０－８４４.[１３]㊀ＳｚｅｋｒｅｎｙｅｓＡꎬＰａｒｔｙｋａＪꎬＶａｒａｄｉＣꎬｅｔａｌ..ＳａｍｐｌｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｆｏｒＮ￣ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｂｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ[Ｊ].ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ.Ｂｉｏｌ.ꎬ２０１５ꎬ１２７４:１８３－１９５.[１４]㊀ＪａｙｏＲＧꎬＴｈａｙｓｅｎ￣ＡｎｄｅｒｓｅｎＭꎬＬｉｎｄｅｎｂｕｒｇＰＷꎬｅｔａｌ..Ｓｉｍｐｌｅｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ￣ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｍｅｔｈｏｄｆｏｒｃｏｍｐｌｅｘｇｌｙｃａｎａｎａｌｙｓｉｓｕｓｉｎｇａｆｌｏｗ￣ｔｈｒｏｕｇｈｍｉｃｒｏｖｉａｌｉｎｔｅｒｆａｃｅ[Ｊ].Ａｎａｌｙ.Ｃｈｅｍ.ꎬ２０１４ꎬ８６(１３):６４７９－６４８６.[１５]㊀ＢｏｎｎｅａｕＪꎬＤｕｍｅｓｔｒｅ￣ＰｅｒａｒｄＣꎬＲｉｎａｕｄｏ￣ＧａｕｊｏｕｓＭꎬｅｔａｌ..Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｒｅｖｉｅｗ:ｎｅｗｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｍａｒｋｅｒｓ(ａｎｔｉ￣ｇｌｙｃａｎꎬａｎｔｉ￣ＧＰ２ꎬａｎｔｉ￣ＧＭ￣ＣＳＦＡｂ)ｉｎｔｈｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆＩＢＤｐａｔｉｅｎｔｏｕｔｃｏｍｅｓ[Ｊ].Ａｕｔｏｉｍ.Ｒｅｖ.ꎬ２０１５ꎬ１４(３):２３１－２４５. [１６]㊀ＫｏｂａｙａｓｈｉＹꎬＭａｓｕｄａＫꎬＢａｎｎｏＫꎬｅｔａｌ..Ｇｌｙｃａｎｐｒｏｆｉｌｉｎｇｏｆｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌｃｈｏｒｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａｕｓｉｎｇａｌｅｃｔｉｎｍｉｃｒｏａｒｒａｙ[Ｊ].Ｏｎｃｏｌ.Ｒｅｐ.ꎬ２０１４ꎬ３１(３):１１２１－１１２６.[１７]㊀ＫｕｎｏＡꎬＫａｔｏＹꎬＭａｔｓｕｄａＡꎬｅｔａｌ..Ｆｏｃｕｓｅｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｇｌｙｃａｎａｎａｌｙｓｉｓｗｉｔｈｔｈｅｐｌａｔｆｏｒｍａｎｔｉｂｏｄｙ￣ａｓｓｉｓｔｅｄｌｅｃｔｉｎｐｒｏｆｉｌｉｎｇｆｏｒｇｌｙｃａｎ￣ｒｅｌａｔｅｄｂｉｏｍａｒｋｅｒｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ[Ｊ].Ｍｏｌ.Ｃｅｌｌ.Ｐｒｏｔｅｏｍ.ꎬ２００９ꎬ８(１):９９－１０８.[１８]㊀ＰｉｌｏｂｅｌｌｏＫＴꎬＭａｈａｌＬＫ.Ｌｅｃｔｉｎｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓｆｏｒｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎａｎａｌｙｓｉｓ[Ｊ].ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ.Ｂｉｏｌ.ꎬ２００７ꎬ３８５:１９３－２０３. [１９]㊀ＣｏｏｋＭＣꎬＫａｌｄａｓＳＪꎬＭｕｒａｄｉａＧꎬｅｔａｌ..Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃａｎｄｌｅｃｔｉｎ￣ａｆｆｉｎｉｔｙｍｉｃｒｏａｒｒａｙｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｇｌｙｃａｎｐｒｏｆｉｌｉｎｇｏｆａｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ[Ｊ].Ｊ.ＣｈｒｏｍａＢ:Ａｎａｌ.Ｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｍｅｄ.ＬｉｆｅＳｃｉ.ꎬ２０１５ꎬ９９７:１６２－１７８.[２０]㊀ＺｈａｎｇＬꎬＬｕｏＳꎬＺｈａｎｇＢ.Ｔｈｅｕｓｅｏｆｌｅｃｔｉｎｍｉｃｒｏａｒｒａｙｆｏｒａｓｓｅｓｓｉｎｇｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓ[Ｊ].ｍＡｂｓꎬ２０１６ꎬ８(３):５２４－５３５.[２１]㊀ＣｈｅｎＰꎬＬｉｕＹꎬＫａｎｇＸꎬｅｔａｌ..ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＮ￣ｇｌｙｃａｎｏｆａｌｐｈａ￣ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎｂｙｌｅｃｔｉｎａｆｆｉｎｉｔｙｍｉｃｒｏａｒｒａｙ[Ｊ].Ｊ.ＣａｎｃｅｒＲｅｓ.Ｃｌｉｎ.Ｏｎｃｏｌ.ꎬ２００８ꎬ１３４(８):８５１－８６０.８４２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.。
蛋白质表达与药物研发探讨蛋白质表达在新药物研发中的作用
蛋白质表达与药物研发探讨蛋白质表达在新药物研发中的作用蛋白质表达与药物研发探讨在新药物研发过程中，蛋白质表达起着至关重要的作用。
蛋白质表达是指将目标蛋白质在细胞中合成的过程，它是药物研发的关键一步，对于药物研发的成功与否有着重要的影响。
一、蛋白质表达的基本原理蛋白质表达的基本原理是通过基因转录和翻译的过程将基因编码的信息转化为蛋白质。
基因转录是指将基因中携带的信息以RNA的形式转录出来，而翻译则是将RNA转化为相应的氨基酸序列，最终形成蛋白质的过程。
二、重要性在于药物研发中的作用蛋白质表达在药物研发中起着关键的作用。
首先，蛋白质表达可以提供足够的目标蛋白质用于药物筛选和优化。
新药物的研发通常需要与目标蛋白质相互作用，了解其结构和功能以及与其他蛋白质的相互作用，在药物筛选和设计中起着重要的作用。
其次，蛋白质表达可以用于产生大量的蛋白质，以便进行生物学活性和药理学研究。
在药物研发过程中，需要进行大量的生物学活性和药理学实验，这些实验通常需要足够的目标蛋白质。
通过蛋白质表达可以产生大量的目标蛋白质，满足实验需求。
此外，蛋白质表达还可以用于研究药物的毒副作用和药物代谢。
药物的毒副作用和药物代谢往往与蛋白质的表达和功能相关，通过研究蛋白质表达的变化可以揭示药物的毒副作用机制和药物代谢途径，为药物的合理设计和使用提供重要的依据。
三、蛋白质表达技术的进展随着生物技术的不断发展，蛋白质表达技术也在不断更新与完善。
目前常用的蛋白质表达技术包括原核表达系统和真核表达系统。
原核表达系统是指在原核细胞（如大肠杆菌）中通过转化外源基因来表达目标蛋白质。
原核表达系统具有操作简便、表达效率高等优点，然而由于原核细胞的内环境与真核细胞不同，因此无法表达复杂蛋白质如多肽、糖蛋白等。
真核表达系统则可以在真核细胞中表达复杂蛋白质。
真核表达系统可以使用哺乳动物细胞、昆虫细胞等进行蛋白质表达，这些细胞具有较高的表达效率、较好的蛋白质折叠和糖基化能力，适用于生产复杂蛋白质。
糖组学中糖蛋白糖链的研究技术及进展
糖组学中糖蛋白糖链的研究技术及进展1988年牛津大学Dwek教授在Annual Review of Biochemistry上发表了题为“Glycobiology”(糖生物学) 的综述，首次提出了糖生物学这一概念，标志着糖生物学这门学科的诞生[1]。
在十几年后，糖生物学在糖链结构、生物合成、生理功能等方面取得了极大地进展。
作为第3种生命信息分子的糖链正越来越受到重视，于是糖组学被誉为是继基因组学和蛋白质组学后的第三领域。
糖组是指细胞内所有的糖链，包括糖复合物[2]。
糖组学是研究糖链的表达、调控和生理功能的科学，通过研究糖链确定基因所携带的遗传信息与功能之间的关系。
糖组学的研究依赖于糖组研究技术的发展，其中糖蛋白和糖链的研究技术比较成熟，本文主要对这两方面进行综述。
1.糖组学研究的内容及意义基因对生命活动的调控是由基因所编码的蛋白质及其所合成的糖链和脂类来体现的，因此基因功能的阐明不仅需要基因组学的研究，还必须开展蛋白质组学和糖组学的研究。
糖链、核酸和蛋白质都是生物大分子，但是糖链的结构远比核酸和蛋白质复杂，这是由于聚糖的糖单位之间糖苷键的链接方式的多样性[3]。
糖链参与几乎所有真核生物的每一生命过程，其功能是复杂而多样的在分子内，糖蛋白糖链影响蛋白质的折叠、溶解度、半衰期、抗原性及生物活性等。
在分子间，糖链可以通过糖基化影响蛋白的功能，更重要的是还与信号传递、细胞通讯密切相关。
.糖与糖之间的相互作用介导细胞-细胞相互作用也被证实.因此糖组学的重要研究内容之一就是作为信息分子的糖类如何在细胞识别和信号传导中发挥作用[4]。
为了研究糖类在细胞识别和信号传导中的作用首先要完成4个方面：什么是基因编码糖蛋白，即基因信息；实现被糖基化的位点，即糖基化信息；聚糖结构，即结构信息；糖基化功能，即功能信息[5]。
目前预测细胞内超过５０％的蛋白质为糖蛋白，在这些糖蛋白中蛋白质是生理功能的主要承担者，而糖链则通过改变蛋白质的折叠方式、生物活性、溶解度、疏水性、聚合、降解、电荷、粘度及质量，对蛋白质的功能起修饰作用。
糖蛋白抗肿瘤作用及其机制的研究进展
糖蛋白抗肿瘤作用及其机制的研究进展王慧昀;吴杰连;袁野【摘要】Based on the introduction of glycoprotein structure, the antitumor mechanism of P-glycoprotein is described from the aspects of preventing the absorption of hazardous substances and output of mediated materials, inducing apoptosis of tumor cells, and influencing organism cell apoptosis through the effect on reactive oxygen. The new direction for glycoprotein research is prospected, and the paper also points out that the focus of glycobiology research will gradually transform to the direction of sugar chain structure analysis and its role in disease.%在介绍糖蛋白结构的基础上,从P-糖蛋白防止机体对有害物质的吸收和介导物质的输出、诱导肿瘤细胞凋亡及通过影响活性氧影响机体细胞凋亡方面阐述了其抗肿瘤机制,展望了关于糖蛋白研究的新方向,指出糖生物学的研究重点将逐渐向糖链结构的解析及其在疾病中的作用等方向转变。
【期刊名称】《宁夏农林科技》【年(卷),期】2012(053)006【总页数】3页(P119-121)【关键词】糖蛋白;抗肿瘤;免疫调节;抗菌【作者】王慧昀;吴杰连;袁野【作者单位】江西科技师范大学,江西南昌330013;江西科技师范大学,江西南昌330013;江西科技师范大学,江西南昌330013【正文语种】中文【中图分类】Q279在海洋天然产物的开发与研究中，人们发现有许多具有生物活性的糖蛋白，这些糖蛋白具有结构新、活性强的特点，在抗肿瘤、抗菌、免疫调节以及免抑制等方面起着非常重要的作用。
蛋白质糖基化分析方法及其在蛋白质组学中的应用
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命科学中又一极具潜力的研究领域 ! 分析技术的进步在糖生物学发 展 过 程 中 始 终 是 直 接 的 推 动 力 " 正是由于前所未有的分析技术进 步 才 最 终 导 致 了 糖 生 物 学 研究的全面繁荣 <24=! 蛋白质组学技术的出现为包括糖生物学在内 的许多传统学科的发展注入了新的活力 <>?=" 近来在蛋白质组学背 景下进行的糖生物学研究 @ 糖蛋白组学已经取得了 可 喜 的 进 展 ! 但是许多制约糖生物学发展的问题依 然 存 在 " 目 前 蛋 白 质 组 学 水平的蛋白质糖基化研究面临 9 个突 出 问 题 # 一 个 是 糖 蛋 白 分 离富集 A 非糖蛋白去除问题" 另一个是二级质谱的裂解效率问 题 ! 因为糖蛋白常是相对量比较少且糖基化具有不均一性 " 传统 的 分 离 方 法 一 般 难 以 将 糖 蛋 白 与 大 量 的 非 糖 蛋 白 分 离 开 来 $而 且鉴定糖基化位点需要质量比较高的 二 级 图 谱 " 目 前 广 泛 应 用 的 *&B %C%B 等裂解技术经常不能满足要求 ! 实际上 " 这也是蛋白 质组学中其他翻译后修饰研究如磷酸 化 % 泛 素 化 等 共 同 面 临 的 问题 ! 此外 " 随着蛋白质组学研究领域的 急 剧 扩 展 " 蛋 白 质 组 学 正迅速向其他生命科学的传统学科渗 透 " 与 日 俱 增 的 大 量 不 同 的生物学问题等待蛋白质组学的方法 来 解 决 " 这 也 要 求 蛋 白 质 组学技术不断发展创新 ! 因此 " 蛋白质组学技术就其面临的任务 来讲还不完备 " 形势的发展迫切要求新的技术突破 ! 下面就蛋白 质糖基化的特点 % 相关研究技术现状 及 发 展 趋 势 从 蛋 白 质 组 学 研究的角度作一综述 !
蛋白质表达与药物开发的应用研究利用蛋白质表达系统进行药物筛选
蛋白质表达与药物开发的应用研究利用蛋白质表达系统进行药物筛选蛋白质表达与药物开发的应用研究随着生物技术的不断发展，蛋白质表达系统在药物开发中起到了至关重要的作用。
通过利用蛋白质表达系统进行药物筛选，科学家们能够更加高效地发现潜在的药物靶点并进行开发。
本文将介绍蛋白质表达系统的种类以及在药物开发中的应用研究。
一、蛋白质表达系统的种类1.原核表达系统原核表达系统包括大肠杆菌（E.coli）、酵母菌等。
其中，E.coli是最为常用的原核表达系统之一。
原核表达系统具有表达效率高、操作简便等特点，在药物开发领域得到广泛应用。
2.真核表达系统真核表达系统包括哺乳动物细胞、昆虫细胞等。
相比原核表达系统，真核表达系统能够实现对复杂蛋白质的正确折叠和修饰，更贴近天然情况。
但真核表达系统需要较高的成本和复杂的操作步骤。
二、蛋白质表达系统在药物开发中的应用研究1.蛋白质表达系统的构建为了高效表达特定蛋白质，科学家们需要构建适合的表达系统。
通过对不同表达载体的选择、启动子的设计以及转染技术等手段，可以实现目标蛋白的高效表达。
2.药物靶点的发现蛋白质表达系统可以帮助科学家们发现新的药物靶点。
通过大规模筛选蛋白质库，可以发现与特定疾病相关的蛋白质分子，为研发新药提供候选靶点。
3.药物活性的评价利用蛋白质表达系统可以对药物的活性进行评价。
通过与特定蛋白质相互作用，可以研究药物的结合方式、亲和力等特性，为药物设计与开发提供重要线索。
4.药物的副作用研究在药物开发过程中，评估药物的副作用是非常重要的一环。
蛋白质表达系统可以模拟人体内蛋白质的表达情况，通过研究药物对不同蛋白质的影响，可以预测药物的副作用。
5.新药的制备蛋白质表达系统在新药制备方面发挥着重要的作用。
通过对目标蛋白进行大规模表达和纯化，可实现药物的批量制备，为进一步临床研究提供足够的药物样品。
三、蛋白质表达系统的优势与挑战蛋白质表达系统在药物开发中具有以下优势：1.高效性：能够实现对目标蛋白质的高效表达和纯化。
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关键 词 ： 蛋 白 ； 基 化 ； 达 系统 糖 糖 表
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安 徽 医 药
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糖 蛋 白药 物 糖 基 化 及 其 表 达 系统 的研 究 进 展
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（， １ 青岛科技 大学生物 与制 药工程 系； 山东省青 岛黄海制 药有 限责任公 司， 东 青岛 ２ ６４ ） ２ 山 ６ ０ ２
摘要 ： 大约有四分之～的新 药是蛋 白类药物 ， 中糖蛋 白药物 占了绝大部分 。本 文从药物代 谢动力学 、 其 组织靶 向和调节生物 活 性等三个方面综述 了糖基化对最佳治疗效果 的影响 ， 并且评估了 Ｃ ＨＯ和酵母表达系统 以求达到最佳糖基化 。哺乳动物细 胞培 养是现今糖蛋 白的生产 系统 ， 它存在以下几个缺点 ： 成本高 ， 周期长 ， 糖基化作用 受限 。鉴 于此 ， 现在 也 已经开发 了酵母表达 系 统来 替代 哺乳 动物细胞培养 ， 它具有表达能力高 ， 发酵易 于控 制 ， 以进 行氮糖基 化的优点 ， 可 尤其是 Ｐ ｐ ｓ ｒ 工程 酵母必将有 ． ａｔ ｉ ｏｓ 更加广 阔的应用前景 。
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