糖蛋白富集
糖蛋白药物的多糖结构解析进展
糖蛋白药物的多糖结构解析进展刘艳玲;刘晓志;赵伟;王志明【摘要】细胞表达的治疗性单克隆抗体多数是糖蛋白.附着在蛋白质上的多糖直接影响蛋白质药物的稳定性、生物活性及免疫原性.因此,应对糖蛋白产品上的多糖进行充分分析,以控制产品质量.然而,糖蛋白上多糖的复杂性对检测带了艰巨挑战.介绍了糖蛋白上多糖分析的最新进展,以及利用凝集素芯片技术的高通量多糖分析法,重点介绍了用于检测糖基化位点、糖链结构和含量的测定分析方法,以期为糖蛋白药物的研发提供参考.【期刊名称】《生物技术进展》【年(卷),期】2016(006)004【总页数】5页(P244-248)【关键词】治疗性糖蛋白药物;多糖分析;凝集素芯片技术【作者】刘艳玲;刘晓志;赵伟;王志明【作者单位】华北制药集团新药研究开发有限责任公司,抗体药物研制国家重点实验室,石家庄050015;华北制药集团新药研究开发有限责任公司,抗体药物研制国家重点实验室,石家庄050015;华北制药集团新药研究开发有限责任公司,抗体药物研制国家重点实验室,石家庄050015;华北制药集团新药研究开发有限责任公司,抗体药物研制国家重点实验室,石家庄050015【正文语种】中文细胞表达的生物技术药物多数是糖蛋白，包括单克隆抗体、重组蛋白、融合蛋白、生长因子、细胞因子、酶和激素。
这些药物被用于癌症、自身免疫性疾病及其他危及生命的疾病的治疗。
适度糖基化对药物的溶解性、稳定性、生物活性、安全性、药代动力学和药效动力学等特征具有重要影响。
药物糖基化不但可以增加药物体外稳定性，还可以保护蛋白药物免受体内蛋白酶的降解。
非糖基化促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)较糖基化EPO，更易受到化学物质、pH变化或是加热引起的变性或降解。
蛋白质糖基化可以影响蛋白药物PK/PD特征，研究显示，末端半乳糖部分糖基化蛋白，较末端唾液酸完成糖基化蛋白具有更短的循环寿命。
由于肝细胞表达的唾液酸糖蛋白受体同半乳糖结合，促进了肝脏对部分糖基化蛋白的清除。
蛋白质糖基化分析方法简介
蛋白糖检测
百泰派克生物科技
蛋白糖检测
蛋白糖是指发生了糖基化修饰的蛋白质，也称糖蛋白。
蛋白糖检测主要就是鉴定一个蛋白质是否发生了糖基化修饰。
糖蛋白检测可以通过分离富集糖基化蛋白质的技术来实现，如凝集素亲和技术、肼化学富集法以及凝胶色谱技术等。
凝集素可以专一性识别并结合某一特异性的单糖或寡糖中特定的糖基序列。
含糖蛋白的蛋白质样品或经酶切的聚糖肽可以按照顺序通过多种凝集素亲和色谱柱，从而筛选出不同的聚糖蛋白或聚糖肽，用于后续的检测分析。
肼化学富集法利用高氯酸盐将糖基上的邻二醇氧化成醛，醛基能与固定在树脂上的肼共价结合，经过洗脱程序，富集在树脂上的蛋白质就是发生了糖基化。
凝胶色谱法通过利用凝集素或抗体亲和技术使糖蛋白带上相应标记，再通过色谱柱进行洗脱富集。
色谱法基于其快速、准确、分辨率高且稳定性好等特点，已成为糖蛋白鉴定的理想技术。
百泰派克生物科技基于Thermo公司最新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪结合Nano-LC，提供糖蛋白检测一站式服务，包括蛋白提取、蛋白酶切、糖基化肽段富集、肽段分离、质谱分析、质谱原始数据分析、生物信息学分析，欢迎免费咨询。
正常人肝组织的及肝癌转移相关核心岩藻糖基化蛋白质组学的研究
正常人肝组织及肝癌转移相关核心岩藻糖基化蛋白质组学的研究.;学校代码:学号:织旦大学博士学位论文正常人肝组织及肝癌转移相关核?罐藻糖基化蛋白质组学研究中山医院院系专代智姓名:刘银坤教授指导教师:完成日期:兰鱼鱼生垒旦博卜论文正常人盯组织及肝癌转移相关核一岩藻诂基化蛋白质组学研究正常人肝组织及肝癌转移相关核心岩藻糖基化蛋白质组学研究中文摘要糖蛋白质组学是研究糖蛋白表达谱、糖链组成及其功能的一门有发展前景的新学科。
糖蛋白在细胞识别、粘附、细胞间相互作用等细胞功能中发挥了关键作用。
许多疾病的发生与蛋白质糖链结构异常有关。
至今仍没有一个完整数据库全面阐述正常生理状态下所有糖基化的蛋白质,也未见有系统的糖蛋白质组学手段筛查病理过程相关的异常糖基化蛋白质。
由于一,岩藻糖又称核心岩藻糖普遍存在于很多糖蛋白中,并且其糖基化程度异常与肝癌或慢性肝病的发生和诊断关系密切。
本研究利用扁豆凝集素对糖链内核,岩藻糖的高亲和性及适用于大样本的、高通量糖蛋白质组学共性技术平台,即凝集素亲和层析、双向电泳联合基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱?~/分析,首次建立了正常人肝脏组织核心岩藻糖基化蛋白数据库。
同时应用和凝集素印迹联合】?/分析,对高低转移潜能不同人肝癌细胞系即高转移的、低转移的和基本不转移的细胞进行研究,获、膜联得了它们的核心岩藻糖基化蛋白质修饰谱,发现膜联蛋白蛋白和细胞角蛋白等异常核心岩藻糖基化状态及差异性表达,分析了此种糖蛋白表达和糖链结构的改变与肝癌细胞系转移潜能的关系。
第一部分正常人肝组织核心岩藻糖基化蛋白质数据库的建立及生物信息学分析本部分研究旨在建立适用于大样本、相对稳定、标准的高通量糖蛋白质组学共性技术平台,并以此为基础,建立正常人肝脏组织核心岩藻糖基化蛋白质数据库,为正常状态下,机体内糖蛋白的全面阐述提供基本生物学信息,为蛋白质核心岩藻糖基化在体内功能研究提供理论依据。
选择不同正常人的肝脏组织例,提取总蛋白通过亲和层析柱后,分成正常人组织及肝确转移相关核心岩藻糖基化蛋白质组学研究博士论文两个组份,柱不结合组分由非核心岩藻糖基化蛋白构成;柱结合组份由核心岩藻糖基化蛋白组成。
基于生物质谱的蛋白质N-糖基化定性与定量新技术
基于生物质谱的蛋白质N-糖基化定性与定量新技术本论文研究内容涉及分析化学、化学生物学等二级学科,属交叉学科研究领域。
主要在生物质谱技术的基础上,发展针对蛋白质N型糖基化修饰定性与定量研究的创新性技术与方法,以准确、高效地揭示蛋白质N-糖基化修饰的多方面信息,包括糖蛋白／糖肽、糖基化位点、糖链等。
糖基化修饰是生命活动中最广泛、最复杂、也是最重要的蛋白质翻译后修饰之一,不仅影响着蛋白质的空间构象、生物活性、运输和定位,而且在分子识别、细胞通信、信号转导等特定生物过程中发挥着至关重要的作用。
糖蛋白根据其糖链结构及糖基化位点的不同可分为三大类：N-糖蛋白、O-糖蛋白和GPI锚定蛋白,其中又以N-糖蛋白分布最为广泛。
据推断,有超过50%的蛋白质都发生了糖基化修饰,但是现有数据库中只有约10%的蛋白质被注释为糖蛋白,说明绝大多数糖蛋白尚未被发现。
糖基化研究仍处于起步阶段,缺乏高效的、成熟的技术手段。
在后基因组时代,基于对蛋白质高通量、系统性研究的蛋白质组学迅速兴起。
而以软电离为基础的生物质谱技术为蛋白质组学的快速发展提供了有力工具。
近年来,生物质谱技术同样被应用于糖基化修饰的研究,主要包括糖基化位点的鉴定和糖链结构的解析等方面,而针对糖蛋白/糖链进行大规模研究的糖蛋白质组学和糖组学也随之应运而生。
然而,糖链属非模板合成,其结构极其复杂且呈二维结构,同时糖链离子化效率低、同分异构体多,在质谱分析上仍存在诸多技术瓶颈。
可见,糖基化领域的进一步发展亟待方法学上的新突破。
本论文以生物质谱技术为基础,从定性研究和定量研究两方面,发展了针对蛋白质N-糖基化修饰研究的新技术与新方法,致力于建立高效、实用的糖基化解析策略,解决当今糖蛋白质组学与糖组学所面临的技术难题。
本论文工作的主要贡献如下：(1)成功将糖苷内切酶(Endo)应用于大规模、高通量的N-糖基化位点质谱鉴定,与传统的肽N-糖酰胺酶(PNGase)形成互补,并利用这两种酶切路线,从大鼠肝脏组织中鉴定到大量尚未被发现或证实的N-糖基化位点；(2)首次发现Endo酶促N-糖18O标记反应,并基于此反应发展了酶促糖链还原末端18O标记GREOL技术,有效用于糖链的质谱相对定量,弥补了定量糖组学领域的一项技术空白；(3)通过条件优化,首次实现了PNGase酶促N-糖链的完全18O标记,并基于此反应创新性地发展了酶促18O4标记技术,成功用于糖链、糖肽、非糖肽的一步定量分析,在一次实验中实现了蛋白质N-糖基化的全方位定量解析；(4)发展了硼氢化钠辅助的酶促N-糖链墙18O技术与18O+D双标记技术,不仅大大增加了酶促糖链18O标记的稳定性,更通过双标记使糖链质量差异增加到3Da,大大降低了同位素峰重叠效应的影响。
糖蛋白
复杂型 （complex type）： 这类N-糖链，除五 糖核心外，不含其 他甘露糖残基，但 含有半乳糖、岩藻 糖和唾液酸；
杂合型（hybird type）：此型糖链具 有复杂型和高甘露糖型这两类糖链的结 构元件，即除了高甘露糖型常见的七糖 核心外，也含有半乳糖、岩藻糖等。
•N聚糖修饰通常产生一定程度的修饰异质性， 因而得到的蛋白质并不是一个确定分子，可 能含有一个以上的糖基化位点，可能出现两 种情况： 微观不均一性(microheterogeneity) 即不同蛋白分子在同一糖基化位点上含 有不同的聚糖链。 宏观不均一性(macroheterogeneity) 即同样的糖基化修饰出现在不同的位点。
N-连接糖基化
• N-连接，只发生于真核生物中，糖链合成 起始于内质网，完成于高尔基体。在内质 网形成的糖蛋白具有相似的糖链，进入高 尔基体后，在各种糖基转移酶的作用下发 生了一系列有序的加工和修饰，包括某些 核心糖残基的替换以及聚糖链的降解，使 得糖链的结构和构造发生巨大变化，从而 形成了结构各异的糖链。
8.3 糖蛋白质组学
8.3.1 糖蛋白
• 糖蛋白质组学（glycoproteomics） 糖蛋白质组学是指大规模的分离、富集、 鉴定糖蛋白的研究。
糖蛋白质组学
凝集素亲和层析 免疫亲和色谱 尺寸排阻色谱 亲水亲和方法 +现代质谱技术=糖蛋白高通量鉴定
……
8.3.1 糖蛋白
• 糖蛋白（glycoprotein）是一类复合糖，由长 度较短，带分支的寡糖和多肽链共价连接而 形成。在大多数情况下，糖的含量小于蛋白 质。
• 糖蛋白广泛地存在于动物、植物和某些微生物 中。这些糖蛋白可被分泌、进入体液或作为膜 蛋白，起多种作用。它们包括许多酶、大分子 蛋白质激素、血浆蛋白、全部抗体、补体因子、 血型物质和粘液组分以及许多膜蛋白。
糖基化分析的内容和方法
糖基化分析的内容和方法
糖基化程度的分析过程大致如下：首先是鉴定糖蛋白，即确定糖蛋白的存在；其次是富集糖蛋白，即糖蛋白的分离存化。
糖蛋白的检测大致有以下几种：放射性标记法、分子荧光标记法、电泳法、凝集素标记法、抗体标记法和化学酵素法。
获得糖基化蛋白的方法主要是电泳法和层析法。
电泳法即通过电泳的方法先得到糖蛋白条带或蛋白点，再通过电洗脱或透析的方法得到糖蛋白。
此方法较为费时，且在操作中易使蛋白变性。
而层析法则具有快速、准确、分辨率高、稳定性好等特点，是分析糖蛋白的理想手段。
目前，利用抗体、凝集素进行亲和层析已成为分离存化糖蛋白的主要方法。
糖基化氨基酸位点的鉴定中，Edman降解法冗长，需要高超的实验技巧和较多的蛋白质，且无法处理N－端封闭的蛋白质。
因此，随着质谱技术的发展，此法已不在被广泛使用。
核磁共振技术也可用于糖基化氨基酸位点的鉴定。
这种方法可在液态溶液中直接进行蛋白质结构测定。
糖链结构的鉴定也采用质谱技术、毛细管电泳技术、气相色谱技术及凝集素亲和技术。
糖蛋白检测
百泰派克生物科技
糖蛋白检测
糖蛋白是蛋白质糖基化修饰作用后产生的一种蛋白质类型，生物体内约50%的蛋白质以糖蛋白的形式发挥其生物学功能。
通过糖蛋白检测可对蛋白质糖基化修饰过程进行研究，糖蛋白检测包括糖基化修饰的定性定量分析、糖基化修饰位点分析等。
一般可使用液相色谱质谱联用（LC-MS）或亲水作用色谱串联质谱（HILIC-MS/MS）技术对特定修饰的糖蛋白进行检测，包括特定修饰糖蛋白的鉴定、糖基化结合位点鉴定等内容。
糖蛋白检测思路：在进行糖蛋白检测之前，需要对经过特定修饰的糖蛋白样本进行富集；之后进行内切酶裂解（如胰蛋白酶消化）得到小片段糖肽，得到的糖肽利用LC-MS或HILIC-MS/MS检测，根据质谱检测结果分析糖肽序列，即可鉴定得出带有特定糖链的所有糖蛋白，结合生物信息学可分析特定修饰糖蛋白糖基化修饰位点。
百泰派克生物科技采用LC-MS和HILIC-MS/MS等高分辨质谱系统提供糖蛋白分析服务，该服务可用于鉴定血浆/血清、细胞、组织或生物体中的全部糖蛋白，并使用质谱系统进行定性和定量分析。
您只需将实验目的告知并将样品寄出，我们将负责项目后续所有事宜，包括蛋白提取、蛋白酶切、肽段分离、质谱分析、质谱原始数据分析、生物信息学分析。
糖基化蛋白的分离纯化
化学酵素法是一各较新的标记糖基化蛋白 质的技术。Khidekel等率先利用此方法构 建了一种半乳糖基转移酶，可选择性地给 糖基化蛋白标记上含酮基的蛋白毒素抗体， 成功地在老鼠的前脑中鉴定出25种与基因 表达、神经信号转导、突触可塑性等功能 相关的O-糖基化蛋白，并且肯定了此方法 可推广至各种组织中的糖蛋白的标记及功 能鉴定。
主要内容
糖基化蛋白质的研究方案
糖基化蛋白质的鉴定 糖基化蛋白的分离纯化
糖基化蛋白的表征
糖基化蛋白质的功能研究
蛋白质人工糖基化改性的研究
糖基化蛋白质的研究方案
研究过程与内容： 1：鉴定糖蛋白，即确定糖蛋白的存在； 2：富集糖蛋白，即糖蛋白的分离纯化； 3：对糖蛋白进行表征的基础研究:一是糖蛋白中蛋白的表 征，即糖基化氨基酸位点的鉴定；二是糖蛋白中糖链的表 征，即糖组成的确定和糖含量的测定； 4：对糖蛋白进行功能研究，即弄清楚糖蛋白的作用机制， 以及对生物体影响； 5：在上面的基础上进一步开展糖蛋白的应用研究，根据 糖蛋白的功能进行人工改性，以满足人类的需要。
凝集素标记法
凝集素标记法是最常用的糖蛋白检测法。凝集
素可特异性吸附糖蛋白，因而被广泛用于糖蛋 白的鉴定。Tilley等运用凝集素对小麦高分子量 谷蛋白亚基的糖基化进行了鉴定，在中国春和 TAM105品种的高分子量谷蛋白亚基2，7，8， 12中均发现有糖基化现象的存在。Kaji等采用 凝集素亲和捕获柱，成功鉴定出250个线虫N糖蛋白。
糖基化蛋白的分离纯化
• 获得糖基化蛋白的方法主要是电泳法和层析法。 • 电泳法即是通过电泳的方法先得到糖蛋白条带或蛋白点， 再通过电洗脱或透析的方法得到糖蛋白。（此方法较为费 时，且在操作中易使蛋白变性） • 层析法快捷、准确、分辨率高、稳定性好，是分析糖蛋白 的理想手段。 • 目前利用抗体、凝集素进行亲和层析已成为分离纯化糖蛋 白的最主要方法。除此之外，已有人开始利用多维高效液 相色谱对蛋白质进行液相图谱分析，并全新研制并测试了 一种新的蛋白质组二维分离和差异表达鉴定方法，称为2D ProteoSepTM.这种方法可以基于蛋白质的等电点(PI) 和疏水性，获得完整蛋白质组的2-DE图谱。
糖组学中糖蛋白糖链的研究技术及进展
糖组学中糖蛋白糖链的研究技术及进展1988年牛津大学Dwek教授在Annual Review of Biochemistry上发表了题为“Glycobiology”(糖生物学) 的综述，首次提出了糖生物学这一概念，标志着糖生物学这门学科的诞生[1]。
在十几年后，糖生物学在糖链结构、生物合成、生理功能等方面取得了极大地进展。
作为第3种生命信息分子的糖链正越来越受到重视，于是糖组学被誉为是继基因组学和蛋白质组学后的第三领域。
糖组是指细胞内所有的糖链，包括糖复合物[2]。
糖组学是研究糖链的表达、调控和生理功能的科学，通过研究糖链确定基因所携带的遗传信息与功能之间的关系。
糖组学的研究依赖于糖组研究技术的发展，其中糖蛋白和糖链的研究技术比较成熟，本文主要对这两方面进行综述。
1.糖组学研究的内容及意义基因对生命活动的调控是由基因所编码的蛋白质及其所合成的糖链和脂类来体现的，因此基因功能的阐明不仅需要基因组学的研究，还必须开展蛋白质组学和糖组学的研究。
糖链、核酸和蛋白质都是生物大分子，但是糖链的结构远比核酸和蛋白质复杂，这是由于聚糖的糖单位之间糖苷键的链接方式的多样性[3]。
糖链参与几乎所有真核生物的每一生命过程，其功能是复杂而多样的在分子内，糖蛋白糖链影响蛋白质的折叠、溶解度、半衰期、抗原性及生物活性等。
在分子间，糖链可以通过糖基化影响蛋白的功能，更重要的是还与信号传递、细胞通讯密切相关。
.糖与糖之间的相互作用介导细胞-细胞相互作用也被证实.因此糖组学的重要研究内容之一就是作为信息分子的糖类如何在细胞识别和信号传导中发挥作用[4]。
为了研究糖类在细胞识别和信号传导中的作用首先要完成4个方面：什么是基因编码糖蛋白，即基因信息；实现被糖基化的位点，即糖基化信息；聚糖结构，即结构信息；糖基化功能，即功能信息[5]。
目前预测细胞内超过５０％的蛋白质为糖蛋白，在这些糖蛋白中蛋白质是生理功能的主要承担者，而糖链则通过改变蛋白质的折叠方式、生物活性、溶解度、疏水性、聚合、降解、电荷、粘度及质量，对蛋白质的功能起修饰作用。
基于液相色谱-质谱的血清糖蛋白质组定量分析
基于液相色谱-质谱的血清糖蛋白质组定量分析胡丹阳;蒋碧云;王献;刘晓慧【摘要】糖尿病作为最常见的代谢疾病之一,是一种受环境和遗传因素影响的多因素疾病.糖基化可导致蛋白功能多样性,对重大疾病、免疫系统有着深远影响.本实验通过两性离子亲水相互作用色谱(zwitterionic hydrophilic interaction liquid chromatography,ZIC-HILIC)富集技术结合微升级高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法,对6例糖尿病人和6例正常人的血清中的蛋白和糖蛋白进行了非标记定量分析,定量了65个差异蛋白和24个差异表达的糖蛋白.通过DAVID软件对这些差异蛋白和差异糖蛋白进行功能富集分析,进一步了解它们的细胞定位、分子功能和生物过程.该研究揭示了糖尿病发病过程中糖蛋白的变化,可为疾病的发病机制和临床诊断提供数据参考.【期刊名称】《质谱学报》【年(卷),期】2019(040)004【总页数】11页(P314-324)【关键词】糖尿病;血清糖蛋白;非标定量;质谱【作者】胡丹阳;蒋碧云;王献;刘晓慧【作者单位】中南民族大学化学与材料科学学院,国家民事委员会分析化学重点实验室,湖北武汉430074;复旦大学生物医学研究院,上海200032;中南民族大学化学与材料科学学院,国家民事委员会分析化学重点实验室,湖北武汉430074;复旦大学生物医学研究院,上海200032【正文语种】中文【中图分类】O657.63糖基化是一种具有重要生物学功能的蛋白质翻译后修饰。
与许多其他翻译后修饰不同，蛋白质的N糖基化的主要结构N-聚糖是由许多单糖单元组成，且呈非线性排列，具有结构多样性，研究蛋白质的糖基化对了解其生物学结构和功能有着重要意义，如对糖蛋白和糖基化位点、对糖型进行鉴定等[1-3]。
研究表明[4-7]，糖蛋白参与了很多重要的生物学过程，包括细胞粘附、分子运输、受体激活和特定的蛋白功能等，许多疾病的病理过程与糖蛋白表达量的变化密切相关。
糖蛋白质组学中基于化学反应的富集方法研究进展
糖蛋白质组学中基于化学反应的富集方法研究进展包慧敏;谢力琦;陆豪杰【摘要】蛋白质糖基化是一种广泛存在的重要的蛋白质翻译后修饰,糖基化肽在总酶解肽中占的比例不超过5％,这使得糖肽的分离富集成为糖蛋白质组学研究发展的关键技术之一.在诸多糖蛋白质组富集技术中,化学方法是富集技术的主导,本文从化学反应的角度介绍糖基化蛋白质富集的技术进展.富集过程按照连接和释放分别讨论,在连接过程中,重点介绍硼酸化学法、肼化学法、胺化学法和肟点击法;在释放过程中,以N-糖蛋白的酶释放法和O-糖蛋白的β-消除法为主导,一并介绍了最新的氧化断裂释放的化学法.最后,讨论总体富集策略的发展现状.该文以糖蛋白富集的共价反应为核心,分析不同方法的优缺点以及各技术在糖蛋白质组学研究中的应用和贡献.【期刊名称】《色谱》【年(卷),期】2016(034)012【总页数】9页(P1145-1153)【关键词】糖蛋白质组;蛋白质糖基化;糖蛋白;富集;连接/释放;共价反应;综述【作者】包慧敏;谢力琦;陆豪杰【作者单位】复旦大学化学系,生物医学研究院和老年医学研究中心上海200433;复旦大学化学系,生物医学研究院和老年医学研究中心上海200433;复旦大学化学系,生物医学研究院和老年医学研究中心上海200433【正文语种】中文【中图分类】O658蛋白质糖基化在细胞间的识别、信息交流和传递中发挥重要的生物学功能。
糖基化蛋白质在病原对宿主的感染、癌症的发生和转移等生物过程中起重要的作用[1,2]。
蛋白质糖基化的异常和肿瘤的发生、发展密切相关,美国食品药品监督管理局(FDA)批准用在临床上的肿瘤标志物中有一半以上是糖蛋白[3]。
甲胎蛋白(AFP)就是一种被广泛应用于肝癌早期临床诊断的血清糖蛋白,肝癌病人甲胎蛋白糖链上的核心岩藻糖含量显著增加[4,5]。
已有研究表明,以蛋白质的核心岩藻糖化水平作为疾病诊断标志物比蛋白质水平更灵敏、更具特异性[6]。
此外,用于前列腺癌诊断的前列腺特异性抗原(PSA)、用于胰腺癌监测的癌抗原19-9(CA19-9)、用于乳腺癌监测的癌抗原15-3(CA15-3)、癌抗原CA27-29和CA-125等都是糖基化蛋白质[7]。
糖蛋白富集提取方法
使用方法：
一、蛋白样品的准备： 以下为由细胞和组织制备蛋白样品的参考步骤，其它方法得到的蛋白样品稀释至蛋白浓 度为 0.25-0.5mg/ml 后直接上样即可。 可以用试剂盒中的洗柱液、裂解液、洗涤液稀释蛋白样品。
细胞裂解： 1. 取 5-10×106 个细胞，在 4℃，1000rpm 条件下离心 5-10 分钟，小心吸取培养基， 尽可能吸干，收集细胞。 2. 用冷生理盐水洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。 3. 每 5×106 个细胞中加入 500ul 冷的蛋白裂解液，混匀后，在 4℃条件下振荡 15-20 分钟。 4. 在 4℃，14000rpm 条件下离心 15 分钟。 5. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白裂解液。
组织裂解： 1. 取 100mg 组织样本剪碎，加入总蛋白提取液，用组织匀浆器匀浆至无明显肉 眼可见固体。
2. 将组织匀浆吸入一预冷的干净离心管中，在 4℃，10000rpm 条件下离心 5 分钟。 3. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白裂解液。
植物蛋白提取： 1、 取 200mg 植物组织样本，去除粗筋脉络等后剪碎，置于研钵中用液氮研磨。（没 有液氮也可直接置冰上研磨即可） 2、 研磨后加入 500ul 提取液，混匀后于一个预冷的干净离心管中在冰上静置 2-3 小时。 3、 在 4℃，12000rpm 以上条件下离心 10-15 分钟。 4、 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白。
糖蛋白富集试剂盒
产品组成：
产品组成 规格 洗柱液
蛋白裂解液 洗涤液
蛋白洗脱液 糖蛋白吸附柱 使用说明书
BB-3109-1 5columns
25ml 25ml 25ml 25ml
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利用亲水富集策略分析人血浆中N-糖基化蛋白及N-糖类型
Ｑ — Ｅ ｘ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ质 谱 仪 （ 美 国 Ｔ ｈ ｅ ｒ ｍｏ Ｆ ｉ ｓ ｈ ｅ ｒ公
司） ； ４ ８ ０ ０ Ｐ ｌ ｕ ｓ ＭＡ Ｌ Ｄ Ｉ － Ｔ Ｏ Ｆ — Ｔ Ｏ Ｆ ＭＳ （ 美 国Ａ Ｂ Ｉ 公 司） ；Ｅ ａ ｓ ｙ — ｎ ａ ｎ ｏ Ｌ Ｃ １ ０ ０ ０液 相 色谱 系 统 （ 美 国
凝集素亲和富集lectinaffinity亲水色谱法富集hilic酰肼富集hydrazinechemical二氧化钛富集硼酸富集以及体积排阻ultrafiltration等在这些富集方法中?凝集素富集糖基化蛋白肽段应用最为广泛?但是凝集素的价格较贵?每种凝集素只能特异性地富集一种糖型?如果规模化分析样品中的所有n糖蛋白只能多种凝集素联合使用?但是这样会使凝集素的富集效率降12?而且结合后的糖蛋白肽段需要用高浓度的糖才能够洗脱下来?操作麻烦?还容易造成样品损失?虽然可以在凝集素上直接切糖从而释放去糖基化后的肽段?但是糖链的结构信息就会丢失?富集虽然有较好的特异性?但操作步骤多?且糖型因氧化而被破坏?最近?随着亲水相互作用色谱技术的不断发展?其在多肽分离药物分析等方面都有较好的应用13段富集手段?操作简单?不破坏糖型?可以一次鉴定到糖和糖肽?具备广阔的应用前景?尽管亲水色谱法富集糖蛋白糖肽具有操作上的优点?但是该方法在糖蛋白糖肽富集上的应用相对较少?与凝集素亲和富集和酰肼富集相比较?其规模化鉴定的数量还不令人满意14在本研究中?首先将两性离子亲水zichilic材料填加到以移液枪头为载体c8膜为筛板的小柱中?制成亲水富集利用标准糖蛋白对富集效率进行考察?并将优化的方法应用于实际样本中?最终在健康人血浆中共鉴定到了来源于299糖基化位点?同时鉴定到31种不同的n糖糖型?该研究结果表明?采用自制亲水相互作用色谱小柱?可以有效富集糖链和糖肽?且操作简单?为寻找糖蛋白生物标志物提供了可靠的方法?qexactive质谱仪美国thermofisher4800plusmalditoftofms美国abieasynanolc1000液相色谱系统美国thermofisher公司?血浆样本获得知情同意并经过伦理委员会通过?采用封闭式的真空采血方法?蛋白质标准品牛血清白蛋白bovinealbumin?bsa以及牛胎球蛋白fetuin购自美国sigmaaldrich公司?pngase酶来源于美国newenglandbiolabs公司?测序级的胰蛋白酶购自美国promega公司?十二烷基磺酸钠sds甲酸fa三氟乙酸tfahplcacn碳酸氢铵尿素ureatrishclnacl等试剂均来源于sigmaaldrich公司?去离子水来源于milliqa10系统millipore公司?二硫苏糖醇dtt和碘乙酰胺iaa购于acros公司?zichili
肼化学富集法糖蛋白富集基本流程
肼化学富集法糖蛋白富集基本流程糖蛋白是一种重要的生物大分子，其研究对于了解生物体内的各种生理生化过程具有重要意义。
然而，由于糖蛋白在生物体内含量较低，结构复杂，其分离纯化和分析研究一直备受关注。
肼化学富集法是一种常用的糖蛋白富集方法，其基本流程如下：1. 样品制备糖蛋白富集的第一步是样品的制备。
一般来说，样品可以是细胞、组织或血清等生物学来源的样品。
首先需要将样品进行细胞裂解，得到总蛋白提取物。
然后通过适当的方法去除非糖蛋白成分，如超滤、离心等手段，得到纯净的糖蛋白样品。
2. 肼化学反应肼化学反应是肼化学富集法的关键步骤。
将样品中的糖蛋白进行还原，使其内部的醛基暴露出来。
通过加入肼等试剂，使得糖蛋白的醛基与肼基发生反应，形成稳定的肼酰肽键，从而将糖蛋白与其他蛋白区分开来。
3. 蛋白水解在肼化学反应之后，需要对样品中的蛋白进行水解，得到肼化学反应后的产物。
一般采用酸性水解或酶解的方法进行水解，得到富集的糖蛋白样品。
4. 富集富集是肼化学富集法的最后一步。
通过适当的方法，如亲和层析、离子交换层析等手段，将糖蛋白从样品中进一步纯化和富集，得到高纯度的糖蛋白样品，用于后续的分析研究。
肼化学富集法糖蛋白富集的基本流程如上所述。
通过这一方法，可以有效地从复杂的生物样品中富集糖蛋白，为其后续的研究提供了有力的支持。
随着科学技术的不断发展，对糖蛋白富集方法的研究也在不断深入，相信在不久的将来，会有更多更有效的糖蛋白富集方法问世，为糖蛋白研究提供更多可能性。
糖蛋白具有多种重要的生物学功能，包括参与细胞信号传导、细胞黏附、免疫反应等。
由于其特殊的生理功能和结构特点，糖蛋白的富集和纯化一直是生物化学和生物医学研究中的难点之一。
肼化学富集法作为一种常用的糖蛋白富集方法，具有富集效率高、操作简便、适用范围广等优点，在糖蛋白研究领域得到了广泛的应用。
继续概述肼化学富集法的基本流程：5. 富集后的糖蛋白的进一步处理在糖蛋白富集后，可根据具体研究的需要，对糖蛋白进行进一步的处理。
人肝脏相关cona与dsa结合型糖蛋白组学分析
铁蛋白。
图１．１ＣｏｎＡ层析图谱峰一为ＣｏｎＡ层析柱结合组分图１．２十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳图ｌ示正常人肝组织总蛋白，２示柱结合组分，３示柱不结合组分，ＭＷ蛋白分子量标准２．正常人肝组织糖基化蛋白表达谱构建通过亲和层析获得的人健康肝ＣｏｎＡ结合型蛋白，用２－ＤＥ结合ＳＹＰＲＯＲｕｂｙ总蛋白染色技术，获得人健康肝组织糖摹化蛋白表达谱（圈１．３）。
ＰＤＱｕｅｓｔ软件探测到糖蛋白质点３０１士１５个，分析图谱发现ＣｏｎＡ结合型糖蛋臼较偏酸性端和碱性端，Ｈ３—５，ＭＷ２５．４７ＫＤ区域处有多个高丰度蛋白，低分予量糖蛋白亦较多。
图ｌ｜３人健康肝组织ＣｏｎＡ结合型糖蛋白表达谱３．人健康肝组织ＣｏｎＡ结合型糖纂化蛋白质谱鉴定和数据库构建将Ａｇｒｏａｓｅ－ＣｏｎＡ亲和层析后的蛋白进行２Ｄ电泳后，紫外下切取１３９个蛋白点采用ＭＡＬＤＩ．ＴＯＦ．ＭＳ／ＭＳ质潜鉴定糖蛋白，通过ＩＰＩ数据库进行搜库分析比对，鉴定结果中：扣除杂蛋白点，ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｏｒｅ色６０共１００个蛋白，ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｏｔｅ＞８５共８０个蛋白；Ｓｅｑｃｏｖｅｒ＞２０％且Ｐｅｐ．Ｃｏｕｎｔ艺．２共７０个蛋白，ＩｎｔｅｎｓｉｔｙＭａｔｃｈｅｄ＞＿．２０共７７个蛋白。
其中有５个点鉴定为同一种糖蛋白，有ＩＯ种蛋白存在同分异构体，所以最后实际鉴定出的蛋白为８５种。
图１．４为肝羧酸脂酶的肽指纹图谱及质谱ＢＨ●ｔ一６１Ｕｏ１．０Ｉｐｒ●ｄｉｏｔ●ｄＨ一●１ＵｏｏｓＵＩ●ｔｉｏｎ●ｉｔ●●ＩｎＳｅｑｕｏｎｃ＠图１．５软件预测肝羧酸酯酶氨基酸序列的Ｎ－连接糖基化位点Ａ：肝羧酸酯酶潜在的Ｎ－连接糖基化位点；Ｂ；潜在位点糖基化及其程度判断图１．６ＣｏｎＡ结合型糖蛋白功能图博士研究生论文人肝脏相关ＣｏｎＡ和ＤＳＡ结合型糖蛋白组学研究图１．７ＣｏｎＡ结合型糖蛋白生理反应途径分类图图１．８ＣｏｎＡ结合型糖蛋白亚细胞器定位分类图讨论建立研究蛋白质糖基化修饰谱的共性平台技术，从宏观上了解糖蛋白糖基化修饰的规律，从中寻找有重要生物功能的糖蛋白，是目前国内外糖组学（Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ）研究的趋势。
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Zhang等先利用肼腙反应富集糖蛋白，再将富集的蛋白质酶解并用PNGase去除糖链，然后在去除糖链后的糖肽的N末端引入轻（H4）和重（D4）同位素标记的琥珀酸酐，
再通过比较被标记肽的同位素峰的强度差异则可得到糖肽的相对量的变化。
他们用标
准蛋白质及人血清样品对该方法进行评价。
糖基化位点的确认仅通过糖肽经 PNGase F 脱去糖链时天冬酰胺残基转变为天冬氨酸时增加0.98 Da 的差异来判断，并不够准确。
Zhang H, Li XJ, Martin DB, et al. Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry. Nat Biotech, 2003, 21(6): 660-6
除了上述的肼腙反应选择性富集糖蛋白质，还可利用凝集素能够专一识别某一特殊结
构的单糖或聚糖中特定的糖基序列的特点使用凝集素柱对糖蛋白质进行富集。
如 Qiu
和 Regnier[11-12]利用接骨木凝集素 (Sambucus nigra agglutinin, SNA) 选择性富集含唾液酸的糖肽。
Goo 等用类似的非标记定量方法比较了人正常前列腺细胞和人膀胱基质细胞的糖
蛋白质组，先对细胞中的糖蛋白质用肼腙反应富集，PNGase F 酶处理脱去糖链后进行LC-MS/MS 分析，根据肽离子流峰面积(peptide ion current area, PICA) 对蛋白质进行
定量。
结果分别从正常前列腺细胞和膀胱基质细胞中鉴定到 116 和 84 个糖基化蛋白质，其中组织蛋白酶 Cathepsin L 等在膀胱基质细胞中上调。
这类现有的非标记定量
方法的主要缺点均在于难以对糖基化程度进行定量以及没有对糖基化位点进行更准确
的确认。
Identification of secreted glycoproteins of human prostate and bladder stroma by comparative quantitative proteomics. Prostate, 2009
糖蛋白是蛋白质与糖类以共价键相连形成的复合物。
目前已知糖链与蛋白质主要有两
种连接方式: ( 1) N型连接 (如图 1A所示 ) , 一般由六到数十个糖基组成糖链, N 乙酰
葡萄糖胺 ( G lcNAc)还原端与蛋白质中天冬酰胺的酰胺氮以1 , 4糖苷键相连,能被 N
糖基化的天冬酰胺必须存在于 N XS /T /C特征序列中,其中 X为除脯氨酸外的任何氨基酸。
N型糖链内侧通常含有一个五糖核心, 即 G lcNAc2M an3。
根据核心外连接单糖
的组成可以将其分为高甘露糖型、杂合型和复杂型糖链。
N型糖蛋白主要存在于血浆
蛋白和分泌蛋白等, 又称为血浆型糖蛋白; ( 2) O型连接 (图 1B糖基或糖链的还原端与蛋白质肽链的丝氨酸、苏氨酸或羟赖氨酸残基中的羟基氧原子相连,糖链无固定结构及核心,在黏液,免疫球蛋白等中广泛存在。
Protein Glycosylation and Diseases: Blood and Urinary Oligosaccharides as Markers
for Diagnosis and Therapeutic Monitoring；Protein C-mannosylation: Facts and questions.这两篇文章
Zhang等利用化学反应固向捕获法富集糖蛋白。
主要原理: 糖蛋白的氧化和偶联。
高
碘酸氧化能够使糖链上的顺式二元醇转化为醛基和固向支持物上的酰肼基团进行反应
形成共价的腙键 (图)。
这样非糖基化的蛋白就可以被去除从而富集糖蛋白。
利用胰酶
进行蛋白酶切后, 只留有糖肽在支持物上来富集糖肽。
技术优点: 能够一次性富集两种类型的糖蛋白, 反应效率高。
缺点: 属于多步骤化学反应, 操作繁复, 条件不易控制。