糖蛋白富集

Zhang等先利用肼腙反应富集糖蛋白，再将富集的蛋白质酶解并用PNGase去除糖链，然后在去除糖链后的糖肽的N末端引入轻（H4）和重（D4）同位素标记的琥珀酸酐，

再通过比较被标记肽的同位素峰的强度差异则可得到糖肽的相对量的变化。他们用标

准蛋白质及人血清样品对该方法进行评价。糖基化位点的确认仅通过糖肽经 PNGase F 脱去糖链时天冬酰胺残基转变为天冬氨酸时增加0.98 Da 的差异来判断，并不够准确。Zhang H, Li XJ, Martin DB, et al. Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry. Nat Biotech, 2003, 21(6): 660-6

除了上述的肼腙反应选择性富集糖蛋白质，还可利用凝集素能够专一识别某一特殊结

构的单糖或聚糖中特定的糖基序列的特点使用凝集素柱对糖蛋白质进行富集。如 Qiu

和 Regnier[11-12]利用接骨木凝集素 (Sambucus nigra agglutinin, SNA) 选择性富集含唾液酸的糖肽。

Goo 等用类似的非标记定量方法比较了人正常前列腺细胞和人膀胱基质细胞的糖

蛋白质组，先对细胞中的糖蛋白质用肼腙反应富集，PNGase F 酶处理脱去糖链后进行LC-MS/MS 分析，根据肽离子流峰面积(peptide ion current area, PICA) 对蛋白质进行

定量。结果分别从正常前列腺细胞和膀胱基质细胞中鉴定到 116 和 84 个糖基化蛋白质，其中组织蛋白酶 Cathepsin L 等在膀胱基质细胞中上调。这类现有的非标记定量

方法的主要缺点均在于难以对糖基化程度进行定量以及没有对糖基化位点进行更准确

的确认。Identification of secreted glycoproteins of human prostate and bladder stroma by comparative quantitative proteomics. Prostate, 2009

糖蛋白是蛋白质与糖类以共价键相连形成的复合物。目前已知糖链与蛋白质主要有两

种连接方式: ( 1) N型连接 (如图 1A所示 ) , 一般由六到数十个糖基组成糖链, N 乙酰

葡萄糖胺 ( G lcNAc)还原端与蛋白质中天冬酰胺的酰胺氮以1 , 4糖苷键相连,能被 N

糖基化的天冬酰胺必须存在于 N XS /T /C特征序列中,其中 X为除脯氨酸外的任何氨基酸。N型糖链内侧通常含有一个五糖核心, 即 G lcNAc2M an3。根据核心外连接单糖

的组成可以将其分为高甘露糖型、杂合型和复杂型糖链。N型糖蛋白主要存在于血浆

蛋白和分泌蛋白等, 又称为血浆型糖蛋白; ( 2) O型连接 (图 1B糖基或糖链的还原端与蛋白质肽链的丝氨酸、苏氨酸或羟赖氨酸残基中的羟基氧原子相连,糖链无固定结构及核心,在黏液,免疫球蛋白等中广泛存在。

Protein Glycosylation and Diseases: Blood and Urinary Oligosaccharides as Markers

for Diagnosis and Therapeutic Monitoring；Protein C-mannosylation: Facts and questions.这两篇文章

Zhang等利用化学反应固向捕获法富集糖蛋白。主要原理: 糖蛋白的氧化和偶联。高

碘酸氧化能够使糖链上的顺式二元醇转化为醛基和固向支持物上的酰肼基团进行反应

形成共价的腙键 (图)。这样非糖基化的蛋白就可以被去除从而富集糖蛋白。利用胰酶

进行蛋白酶切后, 只留有糖肽在支持物上来富集糖肽。技术优点: 能够一次性富集两种类型的糖蛋白, 反应效率高。缺点: 属于多步骤化学反应, 操作繁复, 条件不易控制。