过氧化物酶活性测定

过氧化物酶（POD）活性测定

一、原理：

过氧化物酶含铁，广泛存在于植物组织中，可催化过氧化氢氧化酚类，产物为醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。本实验以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，当有H2O2 存在时，过氧化物酶可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚，其在470nm处有最大吸收峰，故可用分光光度计在470nm处测定其吸光值，即可求出该酶的活性。

二、实验准备：

仪器：分光光度计、离心机、秒表、研钵、磁力搅拌器、移液管、电子天平、冰箱、100ml 容量瓶、试管、胶头滴管、试管架、烧杯、吸水纸、比色皿、剪子

试剂：

0.05 mol/L愈创木酚；2%H2O2； pH 6.0的磷酸缓冲液；75%酒精；蒸馏水

试剂配制:

○1pH 6.0的磷酸缓冲液:0.2mol/l NaH2PO4 (27.6g NaH2PO4•H2O 用蒸馏水配成1000ml）取87.7ml和0.2mol/l Na2HPO4 （71.7g Na2HPO4•12H2O 或53.65g Na2HPO4•7H2O 用蒸馏水配成1000ml）取12.3ml后混合，用蒸馏水稀释至200ml即可。

○22%H2O2：取6.7ml 30%H2O2于烧杯中，再加入93.3mL蒸馏水（或加蒸馏水稀释至100mL），搅拌均匀。

○30.05 mol/L愈创木酚：准确称取6.2g愈创木酚，再用95%的乙醇配制定容至100ml即可。

三、步骤：

○1粗酶液的提取：称取一定质量的植物材料放入研钵中，加入提取液1 mL(pH 6.0的磷酸缓冲液)，研磨，再加入9 mL提取液，将匀浆全部转入离心管中，于4 000 r/min 4 ℃离心10 min，上清液即为酶的粗提取液，收集上清液于冷处（冰箱4℃保存）。

○2酶活性的测定：将4 mL反应混合液( pH 6.0的磷酸缓冲液2 mL,酶液1 mL,0.05 mol/L 愈创木酚1 mL)和1 mL 2% H202加入试管中立即摇匀并迅速倒入比色皿中，于470 nm波长下用U 2800型紫外可见分光光度计比色，立刻记录吸光度值，以后每15 s记录1次，记录

2 min ，另外以缓冲液代替酶液作为较零对照组。

注意：反应混合液要在磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解、待溶液冷却后，加入H 2O 2 （待溶液冷却后再加入，否则引起分解），混合均匀后，保存于冰箱中。

四、计算公式

W t t ⋅⋅⋅

∆=01.0V V

A 活性POD 470 ΔA 470：反应时间内吸光值的变化

W ：植物样品鲜重（g ）

V ：提取酶液总体积（ml ）

Vt ：测定时所用酶液体积（ml ）

t ：反应时间（min ）

【0.01为以吸光度值（ΔA 470）变化0.01为1个酶活性单位(u)】

注意：一般来说，都需要稀释，如果酶液稀释了，应在计算时乘上相应的稀释倍数。