冰冻切片制作与染色过程中常见问题与处理
冰冻切片实验方案和HE染色
2-3人一组，分为7组（上课时需携带实验步骤）冰冻切片操作方法及步骤：1取材：(昆明小鼠各个组织或器官)取材时不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。
2包埋：取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。
小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。
注意：大组织进行包埋时，只要使组织固定在支承器上即可，切勿浪费包埋剂。
3修平：将冷冻好的组织块，夹紧于切片机直承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。
注意：修平过程中，正确使用切片机，不要一次性大量切割组织块，以防损毁切片刀。
4切片：调好切片的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。
5调防卷板：制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。
切片时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。
这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。
6切片工作完成后，将冷冻机内的所有废物清理干净，切勿乱扔。
冰冻切片时的注意事项：1 防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。
有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。
因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。
2 多例多块组织同时需做冰冻且片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱。
3 放置组织冰冻前，应视组织的形状及走势来放置，如果胡乱放置，就不能收到很好的效果。
4 组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定前，更不能使用。
临床快速冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了的组织，反而增加了切片的难度。
冰冻切片染色步骤
冰冻切片染色的步骤如下：
冰冻切片染色的步骤如下：
1.配制染色液和分化液。
根据所需的染色效果，配制染色液和分化液。
例如，
伊红染色液的配方是在95%乙醇100ml中加入1g伊红，玻璃棒搅拌均匀；
1%盐酸酒精分化液的配方是36%-38%的盐酸1ml加入75%乙醇99ml中混匀。
2.将切片放入苏木精染液中染色一定时间，根据实际需要决定染色时间。
3.自来水洗去浮色。
4.进入分化液进行分化处理。
5.自来水冲洗半小时以上，使切片蓝化。
6.过滤后加入伊红染色液染色一定时间。
7.再次自来水洗去浮色。
8.加入伊红染色液染色一定时间，使切片呈现出所需的染色效果。
9.最后进行脱水、透明、封片等处理，完成染色过程。
请注意，在进行冰冻切片染色时，应调整试剂和制片过程中各步骤的时间，所制冰冻切片应染色鲜明，结构清晰。
冰冻切片制作与染色过程中常见问题与处理
• 切片判读正确-反映真实的科学现象
• 知识结构背景
• 组织学结构的熟悉…… • 认识病理改变：炎细胞侵润、坏死、水肿、蛋白变性、纤维化、增 生、凋亡…… • 审美观、拍照角度、视野、曝光时间、对比度……
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– 常规HE染色 – 特殊染色
• 如：Masson(Thichrome staining)，油红O，尼氏染色， 台盼蓝（肥大细胞）染色
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(1) 所有切片呈阴性
1）染色未完全严格按照操作步骤进行 2）漏加一种抗体，或抗体失活 3）缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性 4）底物中所加H2O2 量少或失活 5）复染或脱水剂使用不当
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（2）所有切片呈阳性反应，其原因：
①切片在染色过程中抗体过浓，或干片了。 ②缓冲液PH值不准确，洗涤不彻底。 ③使用已变色的显色底物溶液，或显色反 应时间过长。 ④抗体温育的时间过长。
Con. TNBS LY ZD7288
2014.4.20 TRPV1+CGRP
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L1 DRG
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ห้องสมุดไป่ตู้
4. 染色：抗体孵育和选择: 免疫组化最关 键环节
试剂公司提供标准化的试剂
• 组织固定时
– 固定液要有足够的量(固定液是组织体积的8-10倍) – 保持一定时间，快速灌注固定后，相同的固定剂再固定 2-4h（ 4℃冰箱）
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减少冰晶的形成
• 公认：未经固定的组织切片冰晶较多 • 固定后的组织切片仍然会有一定的冰晶， 为防止冰晶的形成 • 采取如下方法
冷冻切片常见问题与解决方法
冷冻切片常见问题与解决方法叶敏;刘尽国;赵兰香;张杰【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》【年(卷),期】2013(029)009【总页数】2页(P1030-1031)【关键词】冷冻切片;取材;包埋;发白;染色【作者】叶敏;刘尽国;赵兰香;张杰【作者单位】上海市胸科医院病理科,200030;上海市胸科医院病理科,200030;上海市胸科医院病理科,200030;上海市胸科医院病理科,200030【正文语种】中文【中图分类】R361.2术中冷冻切片是目前临床病理检查中最常用的快速制片方法之一。
其是在低温下将新鲜组织冷冻至一定硬度，然后再进行切片的制片方法。
由于低温时组织细胞会损伤、组织细胞着色力差及短时间内快速出片等因素的影响，制片过程中常会出现空洞和冰晶、组织细胞变形和皱缩、切片染色背景不清晰、颜色对比不协调、发白等问题。
现将上述问题及处理方法讨论如下。
1 常见问题与解决方法［1］1.1 冷冻切片出现空洞和冰晶现象(图1) (1)原因:组织内有过多水分，脱水不过关、取材时遇到水，冷冻时间过长，组织冷冻的温度过低。
(2)对策:①取材大小、厚薄要适宜，过大、过厚影响冷冻速度。
②新鲜组织应避免遇水，取材器械干燥洁净，若组织本身带水或血较多，用滤纸把水或血吸干。
取材后需用合成胶水或OCT 作组织块包埋剂，进行包埋。
合成胶水和OCT 均具有黏稠性和渗透性，能将组织牢固地固定在冷冻头上。
③冷冻时间要短，只有速冻才能减少组织内冰晶的形成，最好将速冻头压在组织上，冻好后便可切片，对容易形成冰晶的肌肉、脑组织应采取干冰或液态氮冷冻，以减少冰晶形成。
④以冷冻切片机设置的温度(冷冻头OT 为－25 ℃，CT 为－20 ℃)为宜。
温度太低，组织容易变脆、变硬，切片易出现空洞现象。
1.2 组织破碎或形成空洞现象(图2) (1)原因:组织冷冻时间过长;组织比较硬、脆。
(2)对策:可用手贴在组织上或用嘴向组织哈气稍加温使其软化即可切出完整的切片。
冰冻切片制作方法与注意事项
冰冻切片制作方法与注意事项一、固定：固定即借助化学试剂是组织和细胞中的有机和无机成分凝固或沉淀，停止发生死后组织变化，尽量保持其活体状态的过程。
固定的方法有浸泡固定法，注射、灌注固定法，蒸汽固定法，本实验用的是注射、关注固定法：某些组织块由于体积过大或固定液极难流入内部或需要对整个脏器或整个动物进行固定，就可采用灌注或灌流固定法。
固定时将固定液直接注入动物的血管，经血管分支到达整个组织或全身，从二十只得到充分固定。
固定液分为单纯固定液和混合固定液。
单纯固定液有甲醛、乙醇、氯化汞、醋酸、苦味酸等，混合固定液包括Bouin液、Zenker液、Carnoy液、中性甲醛液等。
本实验用的固定液为4%甲醛（10%福尔马林）。
固定后的处理：用水配制的固定液固定后应用流水冲洗，可是组织中的固定液随时溢出和随时洗去。
对小动物和脑组织等，应以浸泡为主，即能达到冲洗的目的，又不损害组织。
【注意事项】1.固定要及时。
2.组织块的大小要合适。
3.应有足够的固定液，一般与组织块的比例为20:1，容器勿过小，组织勿过多。
4.固定时间要合适，甲醛固定液一般固定两天左右，第一天要更换一次固定液。
5.要进行促使固定，在固定期间轻轻地搅动组织或摇动容器使组织移动有利于固定液的渗透，适当提高温度也可缩短固定时间。
6.选择合适的固定液。
7.一次取材数量过多时，应对取材部位和顺序进行编号，并及时做好记录。
二、脱水脱水就是用某些溶剂逐步将组织块内的水分置换出来的过程，使用的试剂称为脱水剂。
脱水剂有非石蜡溶剂的脱水剂如乙醇、丙酮等，和脱水兼石蜡的脱水剂如正丁醇等。
本实验所用的是乙醇脱水。
乙醇是最常用的脱水剂，其优点是脱水能力强，即能与水相混合，又能与透明剂相混，并可使组织硬化，便于切片。
缺点是穿透组织的速度快，且容易使组织收缩、变脆。
为克服这一缺点，在一般脱水中，应采用循序渐进的方法，逐步升级，经一系列不同浓度的乙醇，使组织中的水分逐渐被乙醇代替。
冷冻切片常见问题分析与预防
冷冻切片常见问题分析与预防骆新兰收稿日期:1998 03 30作者单位:广东省人民医院病理科,广州 510080作者简介:骆新兰,男,30岁,技师冷冻切片是借助低温使组织冻结达到一定的硬度进行切片的一种方法。
它是术中诊断的一种重要方法。
但由于各种原因,影响冷冻切片的质量,拖延病理报告发出的时间,直接影响着病理诊断的及时性、准确性,间接影响着病人的预后。
归结起来有以下几方面。
1 切片不全或不能切片切片不全是指切出的切片组织切面不完整、有缺损现象;不能切片是指组织块的温度过高或过低不能制作一张完整的切片。
切片不全直接影响着冷冻报告切片的准确性。
导致切片不全或不能切片的常见的原因有几下几方面。
1 1 组织内含过多的脂肪或坏死组织 脂肪或坏死组织较一般的组织冷冻的温度要低些,当活组织达到所需的温度时,其还比较软,从而影响切片的完整性和拖延冷冻报告发出的时间。
1 2 组织块过冷 组织冷冻过度易致切片破碎或呈粉沫状,不能制作一张完整的切片。
1 3 组织块冷冻不均匀 在配合使用液氮时,组织块放入液氮时不能保持水平状态且液氮量不足的情况下,可产生此现象。
1 4 冻头的温度不足 冷冻切片时要求冻头的温度保持在-25 ~-30 左右,冻头的温度达不到要求时,组织很快回软,也不能保证切片的完整。
1 5 组织块过大 预防与处理: 注意组织的性质。
冷冻切片的组织除了要保持新鲜外,还应注意避免组织内含过多的脂肪(脂肪组织除外)及坏死组织。
!组织大小要适中。
冷冻切片机内切片刀移动的范围有一定的限制,超出其范围时,易致切片不全。
一般情况下,冷冻切片的组织块大小1cm ∀1cm ∀0 3cm,但卵巢肿瘤及脂肪组织可稍为大些。
另外,包埋时,应将组织平放在冻头的中央。
#掌握好冷冻时间。
根据组织块的大小、性质,确定冷冻时间,一般13~17s(使用液氮者),若组织较大或脂肪组织时间可适当长些,而甲状腺、脑组织和淋巴结等冷冻的时间相对要短些。
术中冷冻切片的规范化操作及常见问题分析
术中冷冻切片的规范化操作及常见问题分析摘要】目的：优化冰冻切片技术，提高术中病理诊断的准确率。
方法：收集2014～2015年期间本院病理科冰冻切片2000余例，重新阅片，分析讨论发现的问题及原因。
结果：不规范的冰冻切片操作严重影响冰冻切片。
结论：规范化操作可以提高病理诊断的科学性、可靠性。
【关键词】冰冻切片；规范化操作；病理诊断【中图分类号】R636 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）06-0205-02术中冷冻切片是目前病理科最为常用的快速制片方法之一，它是借助低温冷冻将手术切除标本的组织块快速冷冻达到一定硬度进行切片的一种方法[1]。
高质量的冷冻切片对于确保术中病理诊断的科学性、可靠性具有极其重要的作用，从而有效降低术中病理诊断的风险。
1.材料与方法1.1 取材送检标本要及时、新鲜，不能沾水和放入固定液，特别是脑组织避免用生理盐水纱布包裹。
取材时尽量避开组织坏死出血区，剔除不必要的脂肪组织、毛发及钙化物等。
细小组织全取材，大组织的取材大小在1.5cm×1.5cm×0.2cm，以厚度不超过0.3cm为宜。
1.2 包埋包埋冻头使用后应用纸巾擦干净后放在冷冻切片机的冷冻台上预冷。
根据组织的特性及医生要求来确定包埋方向，囊壁组织可卷曲成团，皮肤和管腔样组织应立埋。
包埋剂应适量，大块组织可直接放置于滴加包埋剂的组织托上，再用冷冻锤压在组织块上，使其上下一起迅速制冷，既缩短冷冻的时间，又使组织块十分平整，利于切片。
小组织（如穿刺、切缘等组织）包埋时应先滴加少许包埋剂在组织托上，等包埋剂渐渐发白，再将小组织放在组织托上，再用冷冻锤压，避免应切片不完整而导致病理漏诊。
1.3 切片包埋后组织的冷冻是整个冷冻切片十分关键的步骤之一，冷冻的好坏直接影响到切片的质量。
在实践中，我们总结了不同组织的最佳冷冻温度（表1）。
冻好的组织块应先进行粗修，暴露组织的最大面后再进行切片，切片时用力均匀。
冷冻切片方法及注意事项
⑥伊红染色10－20秒。
⑦脱水，透明，中性树胶封固。
注：
固定液的选择
A中性xx溶液B95%乙醇
CAF(40%福尔马林10ml,95%乙醇90ml)
DCarnoy(纯乙醇60ml,氯仿30ml,冰醋酸10ml)
甲醛、乙醇、冰醋酸、苦味酸对组织均有固定作用。甲醛对组织的穿透力强,对组织无明显收缩和膨胀作用,但它不能抵消因冷冻所引起的细胞内液体的膨胀,所以甲醛固定的组织结构尚完好,核有肿胀、模糊。乙醇对组织有脱水收缩作用,并可沉淀白蛋白、球蛋白、核蛋白,但后者所产生沉淀可溶解于水,使核着色不良。冰醋酸对组织有明显的膨胀作用,加重了冷冻所引起的细胞内液体的膨胀,所以用含有冰醋酸的混合固定液(如D液、E液、F液)固定的组织,核肿胀明显。F液中虽然苦味酸对组织有明显的收缩作用,但有冰醋酸的存在仍然防止不了细胞的肿胀。本实验提示混合固定液对冷冻切片HE染色的效果优于单纯固定液,但最好使用不含有冰醋酸的混合液。因此,推荐冷冻切片做HE染色时首选AF固定液。
注：
①包埋剂的选用：
包埋剂是对冷冻切片质量一重要影响因素，包埋剂用量要适宜，过多或过少都会影响标本冷冻质量。常用的有三种包埋剂OCT剂、B超藕合剂以及普通胶水。B超藕合剂适用于细胞丰富质地较嫩的组织,普通胶水或OCT剂适用于纤维丰富质地偏硬组织。（OCT包埋剂骤冷时固化，其冷冻速度和软硬韧度与组织相近，其还具有水溶性，不影响染色等优点。）
分色后的水洗为自来水快洗，目的是终止分色液（
0.5%盐酸乙醇）对组织细胞的分色作用。过度分色将致使染色强度减弱，影响苏木精与伊红颜色的匹配。
蓝化后的水洗为自来水冲洗，洗掉组织中多余的碱性成分（淡氨水），为伊红染色提供适宜的染色环境。
冷冻切片常遇到的问题及解决对策
3 冻切片机工作室温度的设置 根据器官组织形态结构和 组成成分的 不同, 切片时 要相应 调 整切片机工作室温度, 我们在进行冷 冻切片 时得到 的经验 见 表 1:
表 1 没有固定的冰冻组织适合切片的温度如下
组织
标本的切片温度
脑 肝 淋巴结 肾 脾 肌肉 甲状腺 皮肤 乳腺 含脂肪乳腺 脂肪组织
- 12 - 14 - 14 - 16 - 16 - 20 - 20 - 25 - 25 - 30 - 30以下
组织冷冻切片 是借 助低 温使组 织达 到一 定的 硬度 然后 收稿日期: 2006- 04- 10
进行切片的一 种技 术方法 [ 1]。因 其制 作过 程较 传统 的石 蜡 切片相对简便、快捷, 不需经过 固定、包埋和 切片后 温箱中 烤 干处理等实验步骤, 且能很好地保存 组织抗 原和酶 的活性 而
另外, 在切片前 修整 冷 冻组 织块 最容 易损 伤刀 刃, 最好 在急冻组织块稍冻硬以后立刻修 整, 以 减少冻 硬的包 埋剂对 刀刃的损害。组织 块冷冻 时可 根据 组织 块大 小加 入适 量的 包埋剂, 我们 用市售液 体胶 水替 代进 口包 埋剂, 切 片效 果良 好, 且经济简 便。切片后 组 织要 进行 及时 固定, 固 定的 作用 在于使蛋白变性、凝固 、沉淀, 终止或 抑制酶 活性, 保持细 胞、 组织原有的形态结构和抗原性, 此外固 定还兼 有硬化 和媒染 组织切片的效果。对于不同的组 织和抗 原成分的 组织切 片, 需选择合适的固 定剂 及适宜 的温 度和 时间。 蛋白 类抗 原用 丙酮固定, 多 糖类抗原用乙醇固定效 果比较好 [ 6] 。切 片一般 在 4 固定液 5分 钟左右。
2 切片机的温度调试 高质 量 的冷 冻切 片 机一 般有 三 个设 置温 度, 工 作 室温
冰冻切片HE染色步骤
冰冻切片HE染色步骤
一、前期准备
1.准备一台离心机，一台冰冻切片机，以及一些必要的试剂。
2.准备好HE染色的染料，染色的步骤如下：第一步请准备容器，将染料加入容器，每100毫升液体添加1克染料，加入稀盐酸调节PH值为7，然后加入清水到1000毫升。
3.根据患者的病史，准备相应的脓液或活检标本，准备切片培养基，涂片器，和贴片剂。
二、冰冻切片
1.将标本放入冰冻机，调节冰冻机到适合组织切片切割的温度，一般为-30℃。
2.将冷却后的标本放入冰冻机的金属梢，使标本在梢上稳定不动。
3.在梢上的标本上调整至合适的位置，并使用钳子轻轻捏住，能稳定的切割标本。
4.将梢放入冰冻机的切割室，将刀头拉扯，然后上下拉动，从而完成组织的切割。
5.完成切割后，将切片放入保存液中，放入冰箱冷藏，保存至HE染色时使用。
三、组织贴片
1.将预先制备好的培养基，及HE染料容器加入离心机，离心至合适的转速。
2.将冷藏好的切片取出，用湿润的布蘸取适量的贴片剂，在切片表面覆盖贴片剂。
3.在贴片后的组织标本上，会见涂片器，将涂片器中加入HE染料，以及按顺序均匀地涂抹在贴片后的组织标本上。
4.将涂抹好的组织标本放入。
常规冰冻制片常见问题分析 ppt课件
每台冰冻切片机都有 一个速冻台，好的冰 冻切片机可以在几分 钟内将速冻台的温度 下 降 至 -50℃ ～ -60℃ 度之间。
冷冻锤从上面压在组 织上，可以使组织上 下两面同时冷冻
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一台冰冻切片机有多个冷冻锤
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6、液氮和急冻剂
使用液氮和急冻 剂来快速冷冻组织
7、专用冷冻机
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭 • “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我
笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
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一、冰冻切片制片中冰晶的问题
冰晶的产生：当组织缓慢冷冻时，组织间隙的 水份凝固形成的，这时由于电解质析出，渗透压 升高，细胞内的水分子渗透到细胞外，使组织间 隙的冰晶变得更大，挤压周围组织，使组织细胞 的形态发生明显的改变，严重影响病理诊断。
1、正确选择染色试剂苏木素、伊红的配方 2、注意染色过程中的细节问题
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1、苏木素、伊红配方的选择
（1）改良Gill苏木素液：
苏木2.5克溶于乙二醇250ml中。硫酸铝铵17.6克溶于蒸馏水 730ml,以上二液充分溶调后混合，加碘酸钠0.2克，使用前加 冰醋酸20ml.
（2）酸化沉淀伊红液 贮 备 液 ： 伊 红 20 克 ， 蒸 馏 水 500ml, 经 充 分 溶 解 后 加 浓 盐 酸
5、购置专用冷冻机、急冻剂、专用液氮灌
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二、常规与冰冻制片中常见问题
切片染色的问题
冰冻切片的免疫组化染色步骤
冰冻切片的免疫组化染色步骤
1.准备工作：
（1）准备正常组织冰冻切片，使用离心切片机将原有组织材料切成
5-10μm厚的片层，切片后立即放入凝胶剂（如冰冻液中的季铵盐）内，
紧急冷冻到-20℃；
（2）准备石蜡糊，将石蜡熔解并加入一定量的溶剂使其至流体状态；
（3）准备免疫染色的药品，比如羊抗体、抗原标记物（Biotinimidazole）、Streptavidin-HRP（HorseradishPeroxidase）等。
（1）将冰冻切片浸入石蜡糊中进行热融化处理，处理完毕后将其放
置于待用；
（2）将冰冻切片放置在明净的工作台上，用70％乙醇清洗，然后放
入PBS小规模洗涤，然后用清洗液（清水）浇上，以去除表面的乙醇；
（3）将冰冻切片浸泡在去除组织胶多聚体液中，液体里溶解蛋白质
类多聚体，以防止抗体与冰冻切片上的组织胶多聚体结合；
（4）将冰冻切片放置在明净的工作台上，用于抗体的定量涂布，将
抗体与切片表面的抗原结合；
（5）在抗体涂布完毕后，将冰冻切片置于含有PBS溶液的室温下供
2小时以上，使抗体能够与冰冻切片上的抗原结合；
（6）将冰冻切片从室温溶液中取出，放入冰冻液中，将表面的多余
抗体冲洗掉；。
冰冻切片制作与染色过程中常见问题与处理
夏春梅 cmxia@
1
问题思考
• • • • • • • • 组织是否足够新鲜？1w以内？ 灌注固定液、洗液PH值、离子浓度是否合适？ 一抗是选择途径，滴度如何确定的？ 是否阅读过DATASHEET? 保存，有效期，reactivity, Cross-Reactivity ？ 对该蛋白表达和分布有无预期的估计和了解? 是否设了阳性和阴性对照？ 是否排除了自发荧光？ 是不是判读正确？
– 免疫染色(immunol staining)
• 免疫荧光(immunol fluorescence) • 免疫组化(immunol histochemistry)
依据科学研究的需要选择方法
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1. 动物取材：一定要注意“平行性”
横向
纵 向 1 Control 2 Control 3 Control 4 Control 5 Control 6 Control 1 sham 2 sham 3 sham 4 sham 1 I/R 2 I/R 3 I/R 4 I/R 5 I/R 6 I/R 1 I/R+treatment 2 I/R+treatment 3 I/R+treatment 4 I/R+treatment
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2. 免疫组化染色实验组与对照组结果分析表
阳性 对照 1 2 3 4 5 6 7 － ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ 阴性 对照 － ＋ ＋ － － － － 替代 对照 － ＋ － － ＋ － － 实验 组 － ＋ － ＋ ＋ － ＋
结论
操作错误 非特异性反应 阴性对照含定位Ag 阴性对照不含定位Ag 受检组织非特异性染色 受检组织不含定位Ag 受检组织含定位Ag
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常规冰冻制片常见问题分析 ppt课件
脱蜡试剂的问题
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怎样使 切片染色更漂亮
1、正确选择染色试剂苏木素、伊红的配方 2、注意染色过程中的细节问题
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1、苏木素、伊红配方的选择
（1）改良Gill苏木素液： 苏木2.5克溶于乙二醇250ml中。硫酸铝铵17.6克溶于蒸馏水
730ml,以上二液充分溶调后混合，加碘酸钠0.2克，使用前加 冰醋酸20ml. （2）酸化沉淀伊红液 贮 备 液 ： 伊 红 20 克 ， 蒸 馏 水 500ml, 经 充 分 溶 解 后 加 浓 盐 酸
废液倒掉后，试剂瓶要清洗干净并且擦干。 更换试剂后要预先试染一批切片。 更换试剂时要注意不要弄错试剂摆放的顺序。 由于天气的原因，试剂容易挥发，要及时添加或更换。
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细节决定成败
在常规和冰冻切片制片过程中，切片染 色也是 比较重要的一个环节，如果这个环节没做好，也一 样地影响病理诊断，所以，我们在实际工作中除了 注重常规的组织标本的前期处理、冰冻切片的速冻 方法外，我们还要正确选择染色液的配方，并且在 染色过程中把每一个细节都做得很好，我们的切片 质量肯定会好的。
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2、 取材不能太大、太厚
组织块的大小、厚 薄决定了冷冻的速度， 太大、太厚的组织由 于冷冻时间长，难免 有冰晶的产生。所以， 取材组织块小于 1.5*1.5*0.3cm。
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取材3mm 厚
取材4mm厚
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3、使用吸水纸 可以吸干组织表面的水分
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4、样本托和打底胶预冷
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打底胶预冷
常规及冰冻切片制片中常见的 问题分析及解决方法
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常规、冰冻制片常见问题及对策
冰晶的问题----冰冻切片制片时如何减少冰晶 染色的问题----怎样使切片染色更漂亮 标本切开与固定----如何做好标本的切开与固
冰冻切片中常见问题分析
临安人民医院
1、组织取材对制片的影响
组织取材大小：组织块大小要适宜，冷冻切片机 内切片刀移动的范围有一定的限制，超出其范围 时，易致切片不全。一般情况下，冰冻切片的组 织大小为1.5×1.5㎝,厚2㎜。但卵巢肿瘤及脂肪组 织可稍微大些。组织块过大，切片时阻力过大， 易产生皱折，刀痕，组织易崩碎，增加制片难度， 影响诊断。如需在同一标本托上放大于两块组织 时，应尽量冻成一个平面，与刀锋平齐，以防切 片不完整，发生漏诊。若送检组织过小，请预先 速冻一冷台面，再行包埋，利于制片。另外，包 埋时，应将组织平放在冻头的中央。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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总之，对于冰冻切片的质量因素主要 有以上几点。如果能正确对待以上几 方面的问题，冰冻切片的质量方可得 到保证，且能制备出一张质量优秀的 切片，为明确病理诊断提供较为便利 的客观条件。
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6、切片皱缩或卷缩：
这也是影响切片质量的重要因素之一。常见的原因有：① 刀锋变钝。② 防卷板粘有异物，防卷板的作用是防止切 片卷缩，但若粘有异物，切片时组织会被挤压而缩在一起。 ③ 防卷板与刀锋的位置不平行、不协调。④ 组织块包埋 不完全，缺乏支撑作用。 预防与处理的方法：① 注意检查刀具，及时更换刀口， 定期磨刀。② 保持防卷板的清洁，每做一例冷冻切片， 均应将刀口及防卷板拭擦干净，防止切片的污染和切片皱 缩。③ 调整刀、防卷板的位置，保证两者平行，且防卷 板比刀锋前0.2㎜左右。④ 包埋组织应完全，没法切片者 再滴加包埋胶。
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3 、冷冻箱体工作温度对制片的影响：
一般组织设定为－18～－20℃。但对一些较特殊的组织 标本，温度应适当调整，如脂肪成分较多的组织以－30～ －35℃为宜，纤维腺瘤，子宫等为－20℃，淋巴结，甲 状腺为－18℃，切片时，表面玻璃机器盖子不要打开过大， 以免箱体回温过快，影响制片。保持冻箱的温度，做到每 次做完冷冻切片应关好冷冻箱的盖子。
冰冻切片制作与染色过程中常见问题与处理课件
加强操作人员技能培训与交流学习
总结词
加强操作人员技能培训和交流学习可以提高冰冻切片 制作和染色技术的水平。
详细描述
操作人员的技能水平对冰冻切片制作和染色结果具有 重要影响。因此，应加强操作人员的技能培训，使其 掌握正确的操作方法和技巧。此外，组织操作人员之 间的交流和学习，可以分享经验和技巧，提高整体技 术水平。同时，鼓励操作人员积极参与学术会议和技 术研讨会，了解最新的技术和进展，也是提高技术水 平的有效途径。
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冰冻切片染色常见问题及 处理方法
染色不均匀
总结词
冰冻切片染色不均匀可能是由于染色时间不足或过长、染色液浓度不合适、切片温度不均匀等原因引 起的。
详细描述
染色不均匀的问题可以通过控制染色时间和浓度来解决。一般来说，染色时间不宜过长或过短，应根 据染色液的浓度和切片厚度来适当调整。同时，确保切片温度保持均匀，避免局部温度过高或过低。
详细描述
在冰冻切片制作过程中，组织固定 是关键步骤之一。如果固定不当， 会导致细胞结构变形、组织结构松 散等问题。
处理方法
应掌握组织固定的最佳时间和方法 ，根据组织类型和实验要求选择合 适的固定剂，并严格控制固定时间 。
切片温度不适宜
总结词
切片温度不适宜可能引起细胞结 构破坏，影响切片质量。
详细描述
感谢您的观看
THANKS
总结词
切片温度和厚度的调整对切片质量和染色效果具有重 要影响。
要点二
详细描述
在冰冻切片制作过程中，应根据组织类型和实验需求 ，选择合适的切片机和切片刀，并调整切片温度和厚 度。一般来说，较薄的切片更容易染色和观察，但过 薄的切片可能会导致组织结构破坏和细胞丢失。同时 ，应根据染液特性，选择合适的染色时间和温度，以 确保染色效果。
冰冻切片的步骤要求和作用
冰冻切片的步骤要求和作用冰冻切片是一种常见的组织切割技术，它使用低温冷冻样品，然后使用切片机将样品切成非常薄的切片。
冰冻切片技术是生物学研究和医学诊断中不可或缺的重要工具。
它可用于观察许多样品的内部结构，如细胞、组织和器官等，进一步了解它们的功能和形态。
下面将详细介绍冰冻切片的步骤要求及其作用：1.样品固定：在进行冰冻切片前，样品需要进行固定以保持其形态、结构和细胞凝胶状态。
常见的固定方法包括乙醛固定和冷凝固定。
选择适当的固定方法取决于待测样品的特性和研究目的。
2.固定样品冷冻：在进行冰冻切片前，固定的样品需要在低温下冷冻。
冷冻操作的关键是控制冷冻速度和温度，以防止样品在冷冻过程中发生损伤。
常见的冷冻方法包括液氮冷冻和冷冻板冷冻。
液氮冷冻可以实现更快的冷冻速度，而冷冻板冷冻则可以更好地控制冷冻温度和速度。
3.制备切片：冷冻后的样品需要进行切片。
切片机通常用于切割样品。
在切片机工作之前，需要将切片刀冷却到适当的温度，以防止冻结的样品在切割过程中解冻。
然后，将冷冻样品放在切片机上，并调整合适的切片参数，包括切片厚度和速度等。
4.收集切片：完成切割后，收集切片并放置在适当的载玻片或载片上。
注意不要损坏或弄丢切片，同时避免切片之间的交叉污染。
将切片放置在载片上后，可以进行染色、免疫染色或其他实验处理。
5.形态学检查：切片制备完成后，可以使用显微镜对切片进行形态学检查。
通过观察切片，研究者可以进一步了解样品的内部结构，如细胞、组织或器官的形态、形状、大小、有丝分裂状态、细胞排列、器官的血供和微观解剖结构等。
6.免疫组化处理：冰冻切片的一个重要应用是免疫组化染色。
可以使用适当的抗体来标记感兴趣的分子，从而确定其在样品中的存在和定位。
这种技术可以帮助研究者确定一些蛋白质的表达情况、定位和数量，并进一步揭示其在生物学过程中的功能。
7.其他实验处理：除了免疫组化处理外，冰冻切片还可以在其它实验中应用。
例如，可以在切片上进行蛋白质或核酸的杂交实验，研究蛋白质表达的变化或基因表达的调控。
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– 未经固定的脑组织、肝组织：-10- -15℃左右 – 甲状腺、脾、肾、肌肉等组织：-15～20℃ – 含脂肪组织，-25℃左右 – 含大量的脂肪 -30℃
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保持切片的完整性
• 切片破碎不全、有缺损的常见原因
– 固定不完全 – 温度设置不当 – 组织块过冷、过硬，则切片就容易破碎 – 组织块冷冻不够，硬度和韧度达不到，切片也同
L1 DRG
1
Con. TNBS
LY ZD7288
2014.4.20 TRPV1+CGRP
Con. LY
TNBS
ZD7288
2 L1 DRG
Con. TNBS LY ZD7288
2014.4.20 TRPV1+CGRP
Con. LY
பைடு நூலகம்
载玻片上标记（铅笔）
• 组织类型 • 时间 • 组别 • 检测抗原类型
• 抑制实验：待检标本先与未标记的特异性抗体反应后再 与标记的特异性抗体染色
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2. 免疫组化染色实验组与对照组结果分析表
阳性 阴性 替代 实验 对照 对照 对照 组
1
－－
－－
结论
操作错误
2
＋＋＋＋
非特异性反应
3
＋＋－－
阴性对照含定位Ag
4
－－
－ ＋ 阴性对照不含定位Ag
5
＋－
＋ ＋ 受检组织非特异性染色
L1 DRG
3
Con. TNBS
LY ZD7288
2014.4.20 TRPV1+CGRP
同一载玻片上 • 包括各个所有组 • 染色齐性
TNBS
ZD7288
Con. LY
L1 DRG
4
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LY ZD7288
2014.4.20 TRPV1+CGRP
TNBS
ZD7288
Con. LY
TNBS
检标本同时进行免疫细胞化 学染色。 • 对照切片呈阳性结果，标为 阳性对照。
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阴性对照：
用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈 阴性结果，称阴性对照
阴性对照还应包括
• 空白对照：用PBS替代第一抗体
• 替代对照：用与第一抗体来源的同一动物前血清，来替 代第一抗体
• 吸收实验：用过量的已知相应的纯化抗原与第一抗体反 应，抗体结合点全部与抗原结合，这种被抗原吸收的抗 体不能再与组织内的抗原反应
冰冻切片制作与染色过程中 常见的问题
夏春梅 cmxia@
1
问题思考
• 组织是否足够新鲜？1w以内？ • 灌注固定液、洗液PH值、离子浓度是否合适？ • 一抗是选择途径，滴度如何确定的？ • 是否阅读过DATASHEET? 保存，有效期，reactivity,
Cross-Reactivity ？ • 对该蛋白表达和分布有无预期的估计和了解? • 是否设了阳性和阴性对照？ • 是否排除了自发荧光？ • 是不是判读正确？
为防止冰晶的形成 • 采取如下方法
– 速冻法：将组织置入低温环境，使组织骤然降 温
– 利用高渗溶液吸收组织水分子：将组织置于 20% —30%的蔗糖溶液中，置4摄氏度冰箱足够 时间（多长时间? 判定？）
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3. 切片：组织新鲜非陈旧标本是成 败首要因素
• 低温恒冷箱冰冻切片法 • 组织快速冷冻到一定的硬度(机器要预冷)
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（2）所有切片呈阳性反应，其原因：
①切片在染色过程中抗体过浓，或干片了。 ②缓冲液PH值不准确，洗涤不彻底。
③使用已变色的显色底物溶液，或显色反 应时间过长。
④抗体温育的时间过长。 ⑤H2O2 浓度过高，显色速度过快且粘
附剂太厚。
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（3）所有切片背景过深
① 内源性过氧化酶没有完全阻断 ② 切片或涂片过厚 ③ 漂洗不够 ④ 底物呈色反应过久
• 好的切片制作和染色成功的关键
– 细节决定成败
• 固定、漂洗溶液PH值，成分；切片厚度、手感；抗体效价、 特异性；切片孵育时间，湿度、温度；
• 切片判读正确-反映真实的科学现象
• 知识结构背景
• 组织学结构的熟悉…… • 认识病理改变：炎细胞侵润、坏死、水肿、蛋白变性、纤维化、增
生、凋亡…… • 审美观、拍照角度、视野、曝光时间、对比度……
• 固定剂种类：醛类、非醛类、丙酮及醇类
– 中性缓冲液配制多种聚甲醛较为常用
• 组织固定时
– 固定液要有足够的量(固定液是组织体积的8-10倍) – 保持一定时间，快速灌注固定后，相同的固定剂再固定
2-4h（ 4℃冰箱）
8
减少冰晶的形成
• 公认：未经固定的组织切片冰晶较多 • 固定后的组织切片仍然会有一定的冰晶，
(1)所染的全部切片均为阴性结
果，包括阳性对照在内。 染
色
(2)所有切片均呈阳性反应
失
败
(3)所有切片背景过深
(4)阳性对照染色良好，检测的 阳性标本呈阴性反应
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(1) 所有切片呈阴性
1）染色未完全严格按照操作步骤进行 2）漏加一种抗体，或抗体失活
3）缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性 4）底物中所加H2O2 量少或失活 5）复染或脱水剂使用不当
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3. 综合评价特异性阳性染色：
• 阳性染色特点 • 定位：胞浆、胞核、 胞膜、间质有结构 性 • 染色强度不同：颜 色深浅不一
• 非特异性染色 • 细胞与组织无区别 • 弥散性均匀
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优秀免疫组化切片: 信噪比高
A
B
C
假阳性示范图
*弥漫棕色或单一黄色的细胞染色可能是非特异性的
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4. 染色失败的几种表现：
– 阳性切片进行预试验 – 检测抗体的最佳工作浓度
• 了解哪些组织表达这些抗原
– 有助于确定阳性染色，特别是当细胞表达水平 低时尤为重要
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三、 免疫组化结果分析
免疫组化结果的判断原则： 1.必须设对照 2.抗原表达必须在特定部位 3.阴性结果不能视为抗原不表达
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1.实验分析的相关介绍
阳性对照： • 用已知抗原阳性的切片与待
依据科学研究的需要选择方法
5
1. 动物取材：一定要注意“平行性”
横向
纵 向
1 Control 2 Control 3 Control
1 sham 2 sham 3 sham
1 I/R 2 I/R 3 I/R
1 I/R+treatment 2 I/R+treatment 3 I/R+treatment
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谢 谢！
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抗体分装和保存
• 购入的抗体
– 分装在多个安瓿中 – 根据月需要量，大致每安瓿含5~20微升 – 立即放置低温冰箱内贮存（-20℃以下）
• 长期保存在4℃冰箱内会失效
– 避免反复冻融
• 抗体效价急剧下降而失效
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工作抗体的确定
• 确定对于所要研究抗原的最敏感抗体
– 已出版的文献作为参考资料(IHC和WB抗体要 注意区别)
4 Control 5 Control
4 sham 5 sham
4 I/R 5 I/R
4 I/R+treatment 5 I/R+treatment
6 Control
6 sham
6 I/R
6 I/R+treatment
横向“block”
• 预实验时早发现趋势而不被误导，减少无效率的工作量
• 减少不同组间baseline的影响，便于不同批次实验组间比较（背景，抗体效价，
环境条件对染色影响）
• 发表、修改文章图的一致性
6
举例：不同实验时间和条件下同种一染 色方法结果差异
A
B
C
Masson staining
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2. 标本固定应充分
• 固定的标准
– 切片冰晶少，细胞挤压变形小，切片完整，染色清晰
• 一般较多采用组织固定后再行切片 • 浸入法和灌注法
– 浸入法：活检、手术标本，不能进行灌注的组织固定 – 灌注法：动物实验研究
盖，降低防卷板温度
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贴片中常见问题及处理
• 载玻片粘不上切片
– 准备的载玻片温度过低 – 将载玻片置于常温即可
• 贴片时切片易碎
– 排除固定不充分等因素外 – 贴片时应注意动作轻、稳、准 – 根据切片大小，选用笔尖软硬适中、大小合适
的毛笔
根本的解决方法：多观察，多练习，熟能生巧
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贴片方式及标记
2
一、冰冻切片的优缺点
• 优点：
– 简便，快速，用时短
• 可以不需要对组织固定、脱水、透 明、包埋
• 组织变化不大
• 能很好保存脂肪，类脂
• 能够比较完好地保存各种抗原活性 及酶类
• 对有机溶剂或热的温度耐受能力较 差的细胞膜表面抗原和水解酶保存 较好。
• 缺点：
– 不容易做连续切片 – 组织不能过大-不容易冻结
或者组织冻结不均
– 不容易制作较薄的切片
– 冻结过程中容易产生水的结 晶而影响细胞的形态结构及 抗原物质的定位
– 组织结构不如石蜡切片清晰， 但是满足科研的要求
针对其缺点要注意操作条件优化，避免错误
3
二、切片制作过程中几个关键步骤
• 1. 动物取材 • 2. 组织固定 • 3. 切片制作 • 4. 切片染色
6
＋－
－ － 受检组织不含定位Ag
7
＋－－＋
受检组织含定位Ag
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阳性对 阴性对 替代对 实验
照
照
照
组
结论
6
＋