3第三章液相色谱

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液相色谱操作范文

液相色谱操作范文液相色谱（HPLC）是一种常用的分离和分析技术，主要用于化学分析、药物分析、食品分析和环境监测等领域。

液相色谱的基本原理是将待分离物质溶解在流动相中，通过与固定相的相互作用来实现分离。

一、液相色谱的基本原理液相色谱的分离原理是利用固定相与流动相中成分的相互作用来实现的。

固定相可以是多种材料，如吸附剂、离子交换剂和分子筛等。

流动相可以是有机溶剂、水或它们的混合物。

待分离物质在流动相中溶解后，通过与固定相的相互作用来实现分离，不同组分在固定相和流动相之间的分配系数不同，从而实现分离。

液相色谱通常包含以下几个基本部分：进样系统、柱子、检测器和数据分析系统。

进样系统负责将待分离物质注入到流动相中；柱子是液相色谱的核心部件，其中填充有固定相，用于分离待分离物质；检测器可以通过测量吸收度、荧光强度或电导率等来监测待分离物质的浓度；数据分析系统用于处理和分析检测到的信号，得到定量或定性结果。

二、液相色谱的操作步骤1.准备工作：首先检查液相色谱仪是否正常工作，确认流动相和固定相的可用性和质量。

根据实验要求准备样品，并将其溶解在适当的溶剂中。

2.预洗柱子：将柱子连接到液相色谱仪上，用一些纯溶剂通过柱子预洗，以去除柱子中的杂质和残留物。

3.进样：将待分离的样品通过自动或手动进样系统注入流动相中，控制样品的进样量和进样速度。

4.运行液相色谱：首先进行梯度洗脱或等温洗脱，根据实验要求调整流动相的组成和流速。

在色谱柱柱头位置，质谱柱附近安装检测器，以实时监测待分离物质的浓度。

5.数据分析：通过检测器获得的信号，使用数据分析系统处理和分析数据，得到待分离物质的浓度和组成。

6.清洗柱子：运行完液相色谱之后，将柱子从系统中取下，并用适当的溶剂清洗柱子，以去除附着在柱子上的待分离物质和杂质。

三、液相色谱的常见应用1.化学分析：液相色谱在药物、农药、生物学和材料科学等领域中被广泛应用，可以分析和鉴定待分离物质的成分和结构。

北京化工大学仪器分析第三章高效液相色谱精品文档

检测器
用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。
紫外-可见检测器荧光检测器电化学检测器蒸发光散射检测器质谱检测器
紫外-可见检测器
单波长UV检测器，光源用Hg灯，加滤光片可以到 254 ， 280 ， 313 ， 334 ， 365 等。生化中用到很多。
多波长光度计类似，光栅或棱镜分光
残留农药和兽药是食品中主要的污染物世界上许多国家制定并实施食品安全法规，但是
在美国、加拿大、欧盟以及日本食品安全法规更加严格的完善。在食品和农产品国际贸易中，残留农药和兽药的检测中非常苛刻的。
食品中残留检测
农产品 - 谷物：大米等 - 豆类：大豆、豌豆等。 - 水果：橘柑，苹果，葡萄等。 - 蔬菜：洋白菜（甘蓝）、菠菜等 - 茶叶，种子，蜂蜜等。
全多孔型担体薄壳型微珠担体
固定相 --- 化学键合
R --- 极性基团疏水基团离子交换基团
Si OO
Si
HCO S l iOC HS l i3 ()2 C RHO SiOSi3 ()2 C RH
O
SiOH
SiOSi3 ()2 C RH
固定相的化学构造
非键合相表面
键合相表面
ODC
C18
C8
C1 Phenyl
样品的分析实例
食品啤酒，清酒，葡萄酒，酱油等
体液血清，尿等
医药品肾的透析液，钙制剂等
发酵微生物培养液，酸奶等
环境工厂废水等
有机酸标准品的色谱图1
一个分析柱
1. 磷酸 2. 柠檬酸 3. 丙酮酸 4. 苹果酸 5. 琥珀酸 6. 乳酸 7. 甲酸 8. 乙酸 9. 乙酰丙酸 10. 焦谷氨酸

液相色谱定量基础知识3

第三部分定量基础知识1定性方法色谱峰的定性鉴别通过保留值(通常是保留时间)进行定性需要指定保留时间误差范围（时间窗、时间带）在相同的分析条件下保留时间相同并不肯定是同样的组份保留时间不同肯定不是同样的组份2定性确证仅仅通过保留时间并不能完全确证该物质通过加入标准物确认通过改变色谱条件确认光谱和质谱信息也可以作为进一步确证手段其他仪器方法确证3定量分析的基本要求需要有纯物质作标准被定量组分峰要与其它峰达到基线分离符合定性参数要求选择合适的定量方法45定量分析基本公式C i = f i A i C i = f i H i在某些条件限定下，被测组分的浓度与检测器的响应值成正比的关系。

（蒸发光散射检测器浓度与峰面积不成线性，分别取对数后成线性）C i ：组分浓度,f i : 响应因子，与组分的物理化学性质和检测器的性质有关A i ：组分响应面积H i ：组分响应高度实际修饰公式：Y=aX+b常用定量方法面积归一化外标法内标法标准加入法67面积归一化法公式：%100%×=∑AiAiCi 特点：1.无需做校正，简便，快速2.进样量不严格要求3.要求所有组分都流出并且被检测到4.要求所有组分的响应因子相当不能作为准确定量的方法，仅在特定情况下使用8外标法浓度C 1C 4C 3C 2浓度面积A 1A 2A 3A 4C 1C 2C 3C 4A 1A 2A 3A 4峰面积标准曲线9外标法特点：1.不需所有峰都流出或被检测到，只对目标组分作校正2.需要标准样品3.进样量必须准确4.仪器必须有良好的稳定性是实验室最常用的定量方法，定量结果准确f i ——i 组分工作曲线的斜率ii i A f C =1010单点校正法当被测试样中各组分浓度变化范围不大时，可不必绘制多点的标准曲线，而用单点校正法（比较法）。

配制一个和被测组分含量接近的标准溶液，定量进样，根据被测组分和外标组分峰面积比或峰高比计算被测组分的含量。

第三章 LC-MS

优点：形成的是单电荷的准分子离子，优点：形成的是单电荷的准分子离子，不会发生ESI 会发生ESI 过程中因形成多电荷离子而发生信号重叠、降低图谱清晰度的问题；信号重叠、降低图谱清晰度的问题；适应高流量的梯度洗脱的流动相；采用电晕放高流量的梯度洗脱的流动相；电使流动相离子化，电使流动相离子化，能大大增加离子与样品分子的碰撞频率，品分子的碰撞频率，比化学电离的灵敏度个数量级。高3 个数量级。
2）ESI接口的结构 ESI接口的结构
ESI 源主要由五部分组成：1）流动相导入源主要由五部分组成：装置；真正的大气压离子化区域；装置；2）真正的大气压离子化区域；3）离子取样孔；大气压到真空的界面；离子取样孔；4）大气压到真空的界面；5）离子光学系统。离子光学系统。
接口主要由大气压离子化室和离子聚焦透镜组件构成。组件构成。离子化室和聚焦单元之间由一根带惰性金属金或铂）包头的玻璃毛细管相通。（金或铂）包头的玻璃毛细管相通。它主要作用为形成离子化室和聚焦单元的真空差，作用为形成离子化室和聚焦单元的真空差，传输由离子化室形成的离子进入聚焦单元并隔离加在毛细管入口处的高电压。隔离加在毛细管入口处的高电压。离子聚焦部分一般由两个锥形分离和静电透镜组成，部分一般由两个锥形分离和静电透镜组成，并可以施加不同的调谐电压。并可以施加不同的调谐电压。
离子的输送：大气压条件下形成的离子，离子的输送：大气压条件下形成的离子，在电位差的趋使下（当然也有压力差的作用）差的趋使下（当然也有压力差的作用）, 通过取样孔（sampling cone）进入质谱真空区。离子流通 cone）进入质谱真空区。过一个加热的金属毛细管，进入第一个降压区，过一个加热的金属毛细管，进入第一个降压区，在毛细管的出口处形成超声速喷射流。在毛细管的出口处形成超声速喷射流。由于分析物带电荷并且动量大，物带电荷并且动量大，可通过下游处于低电位的锥形分离器的小孔，进入第二降压区，锥形分离器的小孔，进入第二降压区，经聚焦后进入质谱。进入质谱。而与分析物离子一同穿过毛细管的少量的溶剂，由于呈电中性而且动量小，量的溶剂，由于呈电中性而且动量小，则在第一和第二降压区被抽走。和第二降压区被抽走。

1从分离原理、仪器构造及应用范围上简要比较气相色谱及液相

解:液相色谱中提高柱效的途径主要有: 1.提高柱内填料装填的均匀性; 2.改进固定相
减小粒度; 选择薄壳形担体; 选用低粘度的流动相; 适当提高柱温其中,减小粒度是最有效的途径.
4. 液相色谱有几种类型?它们的保留机理是什么? 在这些类型的应用中,最适宜分离的物质是什么?
解:液相色谱有以下几种类型:液-液分配色谱; 液-固吸附色谱; 化学键合色谱;离子交换色谱; 离子对色谱; 空间排阻色谱等.
毛细管凝胶电泳(CGE) 是毛细管内填充凝胶或其他筛分介质，如交联或非交联的聚丙烯酰胺。荷质比相等，但分子的大小不同的分子，在电场力的推动下在凝胶聚合物构成的网状介质中电泳，其运动受到网状结构的阻碍。大小不同的分子经过网状结构时受到的阻力不同，大分子受到的阻力大，在毛细管中迁移的速度慢；小分子受到的阻力小，在毛细管中迁移的速度快，从而使它们得以分离。这就是CGE的分离原理．
解:在离子色谱中检测器为电导检测器,以电解质溶液作为流动相,为了消除强电解质背景对电导检测器的干扰,通常除了分析柱外,还增加一根抑制柱,这种双柱型离子色谱法称为化学抑制型离子色谱法.
例如为了分离阴离子,常使用NaOH溶液为流动相，钠离子的干扰非常严重，这时可在分析柱后加一根抑制柱，其中装填高容量H+型阳离子交换树脂，通过离子交换，使NaOH转化为电导值很小的H2O，从而消除了背景电导的影响．
二者均具分离能力高、灵敏度高、分析速度快，操作方便等优点，但沸点太高的物质或热稳定性差的物质难以用气相色谱进行分析。而只要试样能够制成溶液，既可用于HPLC分析，而不受沸点高、热稳定性差、相对分子量大的限制。
2.液相色谱中影响色谱峰展宽的因素有哪些? 与气相色谱相比较, 有哪些主要不同之处?

高效液相色谱分类及工作原理

阳离子交换：阳离子交换：
R
SO3 H
- +
+
M
+
R
SO3-M+
+ H+
阴离子交换：
R
NR3+Cl-
+
X
-
R
NR3+X-
+ Cl-
一般形式：
R一A＋B ＝ R－B＋A
达平衡时，以浓度表示的平衡常数（达平衡时，以浓度表示的平衡常数（离子交换反应的选择系数）：的选择系数）：
KB / A
[B]r [ A] = [B][ A]r
X + nSad = Xad + nS
达平衡时,有达平衡时有
Kad
[ X ad ][S] = n [ X ][Sad ]
n
其中Kad为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂为吸附平衡常数，其中为吸附平衡常数上保留强，难于洗脱。值小,则保留值弱上保留强，难于洗脱。Kad值小则保留值弱，易值小则保留值弱，于洗脱。试样中各组分据此得以分离。于洗脱。试样中各组分据此得以分离。Kad值可通值可通过吸附等温线数据求出。过吸附等温线数据求出。
这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量受限制。最大允许量受限制。
柱之内径
长度
填充材料粒度
使用压力
分离时间
㈡与气相色谱法比较，HPLC的优点与气相色谱法比较，的优点

液相色谱基本原理

液相色谱基本原理
液相色谱（Liquid Chromatography，简称LC）是一种基于溶
液流动性的分离技术，广泛应用于化学、生物、医药等领域。

其基本原理是将待分析的混合物通过溶液流动，并在固定相上进行分离。

液相色谱的基本原理包括以下几个方面：
1. 手段：液体作为流动相，传递溶解后的待测物进入色谱柱中。

2. 色谱柱：色谱柱是液相色谱的核心部件，通常由一根加有固定相（Stationary Phase）的管道组成。

固定相的选择取决于待
分离物质的性质，如极性、分子大小等。

3. 固定相：液相色谱中的固定相可以是脂肪、硅胶、酸性树脂等。

固定相的选择应根据待测物质的极性、溶解性等特点。

4. 流动相：流动相在液相色谱中起到溶解、输送待测物质的作用。

流动相可以是无机溶液、有机溶剂或其混合物。

5. 分离机理：在液相色谱中，样品分离主要通过样品分子在固定相表面上与流动相的相互作用来实现。

不同成分在固定相上的相互作用力量差异较大，从而导致它们在色谱柱中以不同速度移动。

6. 检测器：液相色谱的检测器用于检测分离出的各个组分，并将其转化为电信号进行记录和分析。

常用的检测器包括紫外-
可见吸收检测器、荧光检测器、电子喷雾检测器等。

液相色谱的基本原理是基于分子之间的相互作用力差异实现物质的分离。

通过调整流动相的成分、固定相的性质或改变操作条件等，可以实现对不同成分的定量分离和分析。

液相色谱具有灵敏度高、分析速度快、选择性好和适用性广等特点，成为许多实验室和工业界的常用分析技术之一。

高效液相色谱分析

（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。
（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。
五、影响分离的因素 1. 影响分离的因素（1）影响分离的因素与提高柱效的途径
• 在高效液相色谱中 , 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项 B/U较小，可以忽略不计，即： H=A+Cu 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。
5. 离子色谱 ion chromatography 离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一中技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，
是测定混合阴离子的有效方法。
6. 尺寸排斥色谱 size- exclusion chromatography
固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；
化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。
C-18柱（反相柱）。
2. 液-固吸附色谱 liquid-solid adsorption chromatography
固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使
用的是5～10μm的硅胶吸附剂；

高压高速
3 . 流程及主要部件（1）流程
（2）主要部件
① 高压输液泵
主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。
为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（ <10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性

表 3 液相色谱梯度洗脱条件

表 3 液相色谱梯度洗脱条件随着科学技术的不断进步，液相色谱技术在生物化学、医药、环境监测等领域得到了广泛的应用。

其中，梯度洗脱是液相色谱法中一种常见的分离技术，能够有效地提高分离效率和分析速度。

梯度洗脱技术的优势在于可以通过改变洗脱溶剂的混合比例，使不同组分在不同时间点得到分离和检测。

本文将介绍液相色谱梯度洗脱条件的具体内容，提供给需要的读者参考。

一、梯度洗脱条件的基本原理在液相色谱法中，梯度洗脱是基于组分在不同溶剂混合比例下的亲和力不同，从而实现分离的原理。

梯度洗脱条件是通过调整流动相的组成，使得不同组分在不同时刻被洗脱出来。

通常，梯度洗脱条件由起始缓冲液组成和洗脱溶剂组成两个部分，二者按照一定的比例混合，根据实际需要来设定。

二、梯度洗脱条件的优化1. 起始缓冲液的选择在梯度洗脱条件中，起始缓冲液的选择是至关重要的。

通常选用的起始缓冲液是对样品无害的、能够提供稳定的pH值和离子强度的缓冲液，比如磷酸盐缓冲液、乙醇胺缓冲液等。

起始缓冲液的选择应考虑对待分离溶质的溶解度和分离度的影响。

2. 洗脱溶剂的选择洗脱溶剂是梯度洗脱条件中的另一个关键因素。

一般情况下，洗脱溶剂的选择应考虑样品的性质、目标分离度以及流动相系统的耐受性。

常见的洗脱溶剂包括甲醇、乙腈等有机溶剂，它们能够提供足够的洗脱力，使得待分离的成分在一定时间范围内逐渐被洗脱出来。

3. 梯度洗脱程序的设计在实际的梯度洗脱条件中，需要根据待分离的样品性质和分离要求来设计梯度洗脱程序。

一般而言，梯度洗脱程序可以分为线性梯度和非线性梯度两种。

线性梯度是在整个洗脱过程中，洗脱溶剂按照固定的斜率逐渐改变混合比例；非线性梯度则是在不同的时间段内采用不同的斜率来改变混合比例。

梯度洗脱程序的设计需要充分考虑样品的特性和目标的分离度，以及流动相系统的适应性。

4. 梯度洗脱条件的验证在设定梯度洗脱条件后，需要对其进行验证和调整。

通常，可以通过改变洗脱梯度的斜率、时间和起始缓冲液的pH值等参数来验证梯度洗脱条件的有效性，从而最大程度地提高分离效率和分析速度。

仪器分析第4讲高效液相色谱法

经典液相色谱法 75-600 0.01-1.0 1-20 50-200 2-50 1-10
高效液相色谱法 3-50（常用5-10）
20-300 0.05-1.0
2-30 104-105 10-6-10-2
2．高效液相色谱法与气相色谱法
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20％．对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析．
3. 柱外效应
由于色谱柱之外的因素引起的色谱峰的展宽，例如进样系统、连接管路及检测器的死体积等。
3-3 高效液相色谱的类型及其分离原理
液—液分配色谱及化学键合相色谱液—固吸附色谱离子交换色谱离子色谱空间排阻色谱
1、液-液分配色谱
liquid- liquid partition chromatography
4、离子色谱
ion chromatography
离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分析和应用受到限制。例如，对于那些不能采用紫外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景电导信号掩没而无法检测。
2、液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatography
流动相为液体，固定相为固体吸附剂
分离原理：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异
分离前提：K不等或k不等
液—固吸附色谱
固体吸附剂主要类型：极性的硅胶（应用最广）氧化铝分子筛非极性的活性炭
1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一书，标志着高效液相色谱法（HPLC）正式建立。

Waters液相色谱教程3

©2004 Waters Corporation
液相色谱检测模式
响应类型
RI 折射率
通用型
UV/VIS FLUOR 紫外/可见荧光
选择性选择性
ECD 电化学
选择性
COND ELSD 电导蒸发光散射
选择性半通用
灵敏度
µg
ng
pg
pg
pg
ng
线性范围 104
105
103
106
105
103
流速敏感 Yes
– 两个压力传感器感应并调整柱塞内压力，柱塞间交换平稳
– 没有出口阀，减少故障率
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2695溶剂输送系统的特点
独立的柱塞杆驱动马达
– 双压力传感器，监视系统及柱塞腔压力 – 软件根据传感器的反馈，控制所有功能 – 完全没有压力的脉动 – 只有两个进口阀，没有出口阀，可靠性极高
的工作
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2695 样品管理系统:特点
全电子设计,除电源外,
不需其它任何动力
极佳的线性范围及进样
重现性
交差污染极小（全自动
进样针内、外清洗装置）
低维护成本
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2695:样品管理系统
样品瓶数目: 120, 分装于5个样品盘(24瓶/盘) 进样次数: 每瓶可进1 到99次标准样品瓶: 2 mL 样品室温控: 4 到40℃ ,增量 1℃ 进样体积: 标准配置:0.1 到100 uL 定量环选件: 0.1到2000 uL 最小样品量: 10 uL, 用低体积的内插式小瓶 (Insert) 最小进样量: 0.1 uL

仪器分析第三章高效液相色谱分析

主要分离机理
吸附能，氢键疏水分配作用溶质分子大小库仑力立体效应生化特异亲和力
主要分析对象或应用领域
异构体分离、族分离，制备各种有机化合物的分离、分析与制备高分子分离，分子量及其分布的测定无机离子、有机离子分析手性异构体分离，药物纯化蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析
第二节影响色谱峰扩展及色谱分离的因素
同时消耗样品少。
2、HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：
（1）速度快-通常分析一个样品在15～30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。（ 2 ）分辨率高 - 可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。（3）灵敏度高-紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。（ 4 ）柱子可反复使用 - 用一根色谱柱可分离不同的化合物。（ 5 ）样品量少，容易回收 - 样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。
基本要求： ①流量稳定，其RSD应＜0.5%，这对定性定量的准确性至关重要；②流量准确可调，0.1～10 ml/min， ③输出压力高，一般应能达到 150 ～ 300kg/cm2 ；④液流稳定，无脉动；⑤ 死体积小，要求小于0.5ml。⑥密封性能好，耐腐蚀。
泵的使用及注意事项： ①防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先过滤除去流动相中的任何固体微粒，泵的入口都应连接砂滤棒。 ②流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏，甚至只是由于溶液的静臵，就可能析出盐的微细晶体，这些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。因此，用后必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂（如对于反相键合硅胶固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。

大学师范类化学专业仪器分析学科第三章高效液相色谱法

HPLC
阳离子交换
- + M++ RSO3 H
H+ + RSO3 M+
-
阴离子交换
Cl X RNR+ + 3
阳离子交换树脂
RNR3 X + Cl-
+

-
3、流动相
水相缓冲液+有机溶剂
调节选择性的主要参数
盐种类及浓度 pH值
各种阴离子的在阴离子交换剂上的滞留次序：
2 2 2 柠檬酸离子 SO4 C 2O4 I NO3 CrO4 Br
( BH+ RSO3 )m ( BH+ RSO3 ) s
离子对
+ + 通式 B+ + A ( ) ( B B A A )s m 疏水性离子对不易在水中离解而迅速进入有机相中，存在下述萃取平衡：
X+水相+ Y-水相
[B A ]s [ B A ]s KB A [B ]m [B ]m [A ] m
故要减小He，提高柱效，应采用小颗粒固定相并填充均匀。
HPLC
2、分子扩散相Hd（纵向扩散项）
cd Dm Hd u
cd ：常数
Dm ：分子在流动相中的扩散系数
u :
流动相流速
Dm 一般很小，当u较大时，Hd很小，Hd可忽略
HPLC
3、传质阻力项
HPLC
（1）固定相传质阻力项
Hs Cs d f Ds u
硅烷化反应
硅胶
十八烷基氯硅烷
ODS(C18)键合相非极性
键合固定相类型疏水基团烷烃（C8和C18）、苯基等极性基团丙氨基氰乙基醚和醇等

色谱知识 ,气相液相色谱

硅胶吸附剂有两大类：表面多孔型（Porous Layer Bead)和全多孔型(Totally Porous)。
全多孔型
表面多孔型
Slide #3
全多孔微粒硅胶按形状又分为球形、非球形，后者又称为无定形。非球形硅胶加工工艺简单，价格比较便宜。球形硅胶机械强度好，颗粒度均一，是比较好的高效液相色谱填充物。颗粒度一般为5～10um，3um的也有商品供应。一般选5um比较合适。表面多孔型硅胶是一种薄壳型微珠，中心是一个没有孔的坚硬内核（玻璃，硅胶或惰性聚合物等）和一个薄的多孔型外壳所组成。外壳的厚度为固体核直径的1/10～1/30，它可以是硅胶，氧化铝或离子交换树脂等。表面多孔型硅胶填料颗粒度较大，短孔，但表面积小，容量低。吸附剂的孔径和表面积对溶质保留和分离有影响，选择孔径主要根据溶质分子的大小，小分子选用7～12nm孔径的，大分子选用30nm的，一般来说孔的直径要比被分析的样品分子的直径大 3倍。最后是吸附剂表面的酸碱性。硅胶表面的pH值大约为5，碱性氧化铝的pH值为12。由于硅胶表面的pH值对大多数样品没有催化和强保留现象，因此常常使用硅胶柱。对于碱性化合物，例如吡啶和胺类，选择硅胶可能不合适，但这类样品可选用键合固定相实现分离与分析，因此氧化铝已很少使用。 •流动相在吸附色谱中，固定相是吸附剂，因此流动相多以非极性溶剂为主。可作为流动相的溶剂很多，这些溶剂大致可分为三类：一类是非极性溶剂，如正己烷等烃类。一类是中等极性的，主要是卤代烃、酯类；一类是极性的，如醇和乙腈等。水虽然是极性很强的溶剂，但水分子会永久地吸附在吸附剂的表面上而导致活性降低而失去分离作用。一旦柱子因水的吸附而失效则需要再生。
第三章液相色谱分离方法
一、前言
在液相色谱中通常都强调流动相的作用，如流动相的极性，流动相的选择性和流动相的优化等等，这是因为在液相色谱中流动相参与柱色谱过程的分配作用，而且组分的最佳分离在很大程度上取决于流动相的选择和优化，并因此而忽略了柱子在液相色谱分离过程中的作用。然而世界上成千上万种化合物是否能被一类固定相分离呢？也就是说，只要选择合适的流动相而不必选择固定相呢？事实恰恰相反，固定相在不同类化合物的分离中起着相当重要的作用，它决定了物质的分离过程，也决定了流动相的基本性质。其实液相色谱的主要分类方法就是根据固定相或溶质与固定相之间的分配形式而分类的。如吸附色谱以吸附剂为固定相；分配色谱以键合相为固定相；离子色谱以离子交换剂为固定相；排阻色谱以多孔惰性小球为固定相；旋光异构体色谱以手性固定相为固定相；亲和色谱使用配体固定相等等。

液相色谱原理

液相色谱原理
液相色谱（HPLC）是一种高效、精确的色谱分析技术，广泛应用于生物化学、药学、环境监测等领域。

其原理基于样品在流动相中与固定相相互作用，通过分离和识别不同成分。

下面我们将详细介绍液相色谱的原理。

首先，液相色谱的分离原理是基于不同成分在流动相和固定相之间的分配系数
不同而实现的。

样品溶液首先被注入流动相中，然后流经填充有固定相的柱子。

在柱子内部，不同成分与固定相发生相互作用，导致它们在流动相和固定相之间分配系数不同，从而实现了成分的分离。

其次，液相色谱的分离原理还与吸附、分配、离子交换、排阻等作用有关。

在
吸附作用中，样品成分与固定相表面发生吸附作用，实现分离。

在分配作用中，样品成分在流动相和固定相之间发生分配，实现分离。

在离子交换作用中，样品成分与固定相中的离子交换树脂发生离子交换作用，实现分离。

在排阻作用中，样品成分在固定相孔隙中发生排阻作用，实现分离。

此外，液相色谱的分离原理还与流动相的性质、固定相的性质、柱温度等因素
有关。

流动相的选择直接影响着样品成分在固定相中的分配情况，固定相的选择直接影响着样品成分的吸附、分配、离子交换、排阻作用，柱温度的控制可以影响样品成分在固定相中的分配系数，从而影响分离效果。

总的来说，液相色谱的原理是基于样品成分在流动相和固定相之间的相互作用
实现的。

它利用了吸附、分配、离子交换、排阻等作用，通过流动相和固定相的选择以及柱温度的控制，实现了对样品成分的高效分离和识别。

液相色谱技术的发展为化学分析领域带来了巨大的便利，也为科学研究和工程实践提供了重要的技术支持。

第3章+高效液相色谱分析

不同待测离子与反离子形成离子对的能力不同，分配系数存在差异，导致在固定相中滞留时间不同，从而实现色谱分离。
离子对的容量因子k可表示为：
VS 1 k DX K XY [Y ]水相 VM
则组分的保留时间：
L 1 t R (1 K XY [Y ]水相） u
分析实例：
§3-4 液相色谱的流动相
当固定相选定时，流动相的种类、配比能显著地影响分离效果，因此流动相的选择很重要。
1.选择流动相时应注意的几个问题
（1）尽量使用高纯度试剂作流动相（防止微量杂质长期累积，损坏色谱柱和使检测器噪声增加) 。（2）避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度。（4）溶剂的黏度小些为好。（5）流动相同时还应满足检测器的要求。比如当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。
子或反离子)，加到流动相中与溶质离子结合形成疏
水性离子对，从而控制溶质离子的保留行为。阴离子分离：对离子常用烷基铵类，如氢氧化十六烷基三甲铵。阳离子分离：对离子常用烷基磺酸(己烷磺酸钠)。反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C18 柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样
离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X-。
固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。相对分子质量在100～105范围内的化合物按质量分离。
空间排阻色谱固定相
（1）软质凝胶葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构。水为流动相。适用于常压排阻分离。（2）半硬质凝胶苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶。非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂（3）硬质凝胶多孔硅胶、多孔玻珠等；如可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。化学稳定性，热稳定性好，机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。