第三章液相色谱分析演示文稿

四、流程及主要部件
1.流程
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2.主要部件
(1) 高压输液泵 主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm） ，液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因 此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。
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(1) 高压输液泵 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀 等特性 可分为恒流泵和恒压泵两大类。 恒流泵包括气动泵和机械泵两大类 机械泵：螺旋传动注射泵、单活塞往复柱塞泵、双 活塞往复泵和往复式隔膜泵
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单活塞往复柱塞泵
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气动放大泵
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（2）脱气装置
流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形 成气泡。气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐的 噪音峰。小气泡慢慢聚集后会变成大气泡，大气泡进 入流路或色谱柱中会使流动相的流速变慢或出现流速 不稳定，致使基线起伏。气泡一旦进入色谱柱,排出 这些气泡则很费时间。在荧光检测中,溶解氧还会使 荧光淬灭。溶解气体还可能引起某些样品的氧化或使 溶液pH值发生变化。
到前面的一些成分分离不完全，而后面的一些成分 分离度太大，且出峰很晚和峰型较差。为了使保留 值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并 达到相互分离，往往要用到梯度洗脱技术。
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梯度洗脱操作
高压梯度： 一般只用于二元梯度，即用两个高压泵 分别按设定的比例输送A和B两种溶液至混合器，混 合器是在泵之后，即两种溶液是在高压状态下进行 混合的 。 低压梯度： 只需一个高压泵，与等度洗脱输液系统 相比，就是在泵前安装了一个比例阀，混合就在比 例阀中完成。
第二节 主要分离类型与原理
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一、 液-固吸附色谱
固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常 使用的是5～10μm的硅胶吸附剂； 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：组分在固定相吸附剂上有吸附作用，且 吸附力有差异，经过多次吸附与解吸而被分离；
适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样， 对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性； 缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；
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一、高效液相色谱的发展
气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性 质稳定的有机化合物，而HPLC则只需要样品 能够制成溶液，大多数情况下不需要加热，所 以对样品的挥发性没有要求。因此对于那些用 气相色谱难以分析的物质，如挥发性差、极性 强、具有生物活性、热稳定性差的物质（约占 有机物质的75％～80％）也能够分析。现在， HPLC的应用范围已经远远超过气相色谱，位 居色谱法之首。
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光电二极管阵列检测器
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c.示差折光检测器
除紫外检测器之外应用最多的检测器； 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光 指数差值。差值与浓度呈正比； 通用型检测器 （每种物质具有不 同的折光指数）； 灵敏度低、对 温度敏感、不能用 于梯度洗脱。
d. 荧光检测器
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（2）脱气装置 真空脱气装置： 将流动相通过一段由多孔性合成
树脂膜制造的输液管，该输液管外有真空容器，真空 泵工作时，膜外侧被减压，分子量小的氧气、氮气、 二氧化碳就会从膜内进入膜外而被脱除。一般的真空 脱气装置有多条流路，可同时对多个溶液进行脱气。
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（3）梯度淋洗装置 在进行多成分的复杂样品的分离时，经常会碰
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（2）脱气装置
目前，液相色谱流动相脱气使用较多的是离线 超声波振荡脱气、在线惰性气体鼓泡吹扫脱气和在 线真空脱气。
超声波振荡脱气： 将配制好的流动相连容器放入超声 水槽中脱气10-20min。
惰性气体鼓泡吹扫脱气： 将气源（钢瓶）中的气体（ 氦气）缓慢而均匀地通入储液罐中的流动相中，氦气 分子将其它气体分子置换和顶替出去，而它本身在溶 剂中的溶解度又很小，微量氦气所形成的小气泡对检 测无影响。
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二、高效液相色谱法的特点
高压、高效、高速、高灵敏度、应用范围广 高沸点、热不稳定有机物及生化试样的高效分离分析 方法。
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三、高效液相色谱仪器（Waters）
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三、高效液相色谱仪器（安捷伦）
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三、高效液相色谱仪器（岛津）
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（4）进样装置 流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的
六通阀进样装置，其结构如图所示：
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（5）高效分离柱 柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长
5～40 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高 柱效。
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（6）液相色谱检测器 a. 紫外检测器，应用最广，对大部分有机化合物有 响应。特点：
高灵敏度、高选择性； 对多环芳烃，维生素B、 黄曲霉素、卟啉类化合物 、农药、药物、氨基酸、 甾类化合物等有响应；
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e. 蒸发光散射检测器
ELSD是基于溶质 的光散射性质的检 测器。由雾化器、 加热漂移管（溶剂 蒸发室）、激光光 源和光检测器（光 电转换器）等部件 构成。
第三章 高效液相色谱分析法
灵敏度高；线形范围宽； 流通池可做的很小（1mm × 10mm ，容积 8μL）； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。
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b. 光电二极管阵列检测器 紫外检测器的重要进展；1024个二极管阵列，各检测特 定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。
第三章液相色谱分析演示文稿
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（优选）第三章液相色谱分析
一、高效液相色谱的发展
在所有色谱技术中，液相色谱法是最早（1903年 ）发明的，但其初期发展比较慢。
20世纪60年代后期，将已经发展得比较成熟的气相 色谱的理论与技术应用到液相色谱上来，使液相色谱 得到了迅速的发展。液相色谱仪于1969年商品化。从 此，这种分离效率高、分析速度快的液相色谱就被称 为高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）。