野生型根癌农杆菌对马铃薯的遗传转化研究

野生型根癌农杆菌对马铃薯的遗传转化研究朱永莉1,戴朝曦2(1.上海商学院艺术设计学院,上海200235;2.甘肃农业大学农学院,甘肃兰州730070)摘要用不同的野生型根癌农杆菌(A g r o bacteri um tum efac ien s)T37、B6、T FA16Y E、T FA16YK对马铃薯普通栽培种甘农薯1号的块茎圆片、茎段、叶切片、试管苗,美国引进品种褐皮・布尔班克的块茎圆片以及新型栽培种NW-174实生苗的子叶及下胚轴等组织进行了离体侵染和整株侵染实验,发现:不同的菌种对同一组织以及相同的菌种对不同组织的侵染效果均不同。

在供试菌株中,以T FA16YE的转化效果最好。

对NW-174新型栽培种实生苗的子叶、下胚轴进行的侵染实验表明,这两种组织的转化率较高。

结果表明,在离体转化程序中,外植体的生理状态、发育阶段以及供试菌株的代谢活性及培养条件等均是影响转化效率的重要因素。

关键词马铃薯;野生型根癌农杆菌;遗传转化中图分类号S532文献标识码 A 文章编号0517-6611(2007)27-08427-03S tud y on th e G e n e t ic T ra n s fo r m a t ion o f Po ta to w ith W ild T yp e A grobacteriu m t u m ef aciensZHU Y on g-li e t a l(C o llege o f A rt D e sign,S h an gh a i B u sin e ss S ch oo l,S h an gh a i200235)A b s tra c t Inth e stu d ie s,tube r discs,stemse gm en ts,lea f sec tion s an d th e te st tu be p lan tle ts fro m So lanum tube r o su m cv.G an n on g sh u N o.1.R u sse t bu r-ban k an d th e co ty ledon s and h ypo co ty ls froma N eo-tu be rosumb reed i n glin e NW-174w e re i n fe cted in v itro w ith A gro bacteriumtu m e f aciens stra in s T37,B6, T FA16Y E an d T FA l6YK.I t w a s fou n d th a t th e in fection e ffe cts w e re d iffe ren t am on g th e ba cte riumstra i n s in th e sam e in fec ted tissu e as w e ll a s d iffe ren t am on g th e d iffe ren t tissu e s in fected w ithth e sam e ba cte riumstra in.T h e ba cte ria T F A16YEh ad a best tran s fo rm a tion e ffect.T h e co ty ledon s an d h ypoco ty ls fromth e NW-174h ad th e h igh es t tran s fo rm a tion e fficien cy.T h e resu lts sh ow ed th a t th e ph ys io log ica l an d dev e lopm en ta l sta tu s o f exp lan ts,t h e m e tabo lism ch a racte rs an d cu ltu re con d ition s o f th e ba cte ria w e re th e cr itica l facto rs a ffectin g gen e tic tran sfo rm a tion e ffic ien cy.K e y w o rd s P o ta to;W ild type A g robac teriu mt um efac iens;G en e tic tran sfo rm a tion马铃薯是重要的粮菜兼用型作物,当前影响其生产发展的主要因素是品种问题,由于马铃薯普通栽培种基因库贫乏,用常规的育种方法选育出的品种,在抗病性和抗逆性以及高蛋白含量等性状方面很难有新的突破[1]。

近年来发展起来的基因工程技术,可以创造或引进新的基因,从根本上改变植物的遗传性,特别是在抗病或者抗逆性育种方面具有重要的应用价值,因而在马铃薯育种中具有重要意义[2]。

植物基因工程的发展要求建立一种简便、快速、有效的遗传转化系统,把外源基因导入受体细胞,进而从转化的细胞中再生出完整的工程植株。

在这一实验体系中,一方面要求探寻合适的外源基因载体及相应的受体,另一方面还应摸索建立切实可行的转化系统。

根癌农杆菌(A grobacteri um tu m efacien s)是目前应用于植物遗传转化的一类农杆菌,其中含有T i(诱瘤)质粒,在农杆菌感染植物受伤部位时,T i质粒内的一特定片段(即可转移DN A,称为T i T-DN A)能共价地整合到植物染色体上进行复制、转录和表达。

T-DN A上有生长素和细胞分裂素合成基因,当它们转移到植物中后能进行表达,产生出大量植物激素,从而使植物产生冠瘿癌瘤[3]。

近年来大多数的研究都忽视了野生型根癌农杆菌的作用,使其未能作为转基因的载体,其主要原因是由于野生型T i质粒的致癌基因破坏了植物的激素平衡,癌瘤组织难以分化成苗。

因而在基因工程实验中大多采用改建型质粒,但改建型质粒在筛选过程中必须加入能抵抗某些抗生素的基因,这些基因转入基因工程植株后可能会对人体产生不良的副作用,给转基因植物在食品市场的推广带来一定影响,而野生型农杆菌的一个最大优点是可以用无激素的培养基进行筛选,无需引入分解抗生素基因等选择标记基因[4]。

此外,由于农杆菌T-DN A在植物染色体上的整合位置不固定,因而整合后可以引起许多不同突变,如果这些突变是有利的,则野生型农杆菌可以作为一种诱变因素。

因此,有必要进一步作者简介朱永莉(1970-),女,甘肃天水人,硕士,高级工程师,从事植物育种与观赏园艺的研究。

收稿日期2007-06-08研究利用野生型农杆菌进行遗传转化的方法。

该实验通过不同的根癌农杆菌菌株对马铃薯普通栽培种甘农薯1号、美国引进品种褐皮・布尔班克及新型栽培种NW-174不同组织(器官)的侵染,旨在摸索行之有效的转化系统,为今后转移目的基因打下基础。

1材料与方法1.1 材料的来源及繁殖1.1.1 块茎。

实验所用块茎为甘肃农业大学农业生物工程研究所培育的品种甘农薯1号和美国引进的品种褐皮・布尔班克,它们均为4倍体普通栽培种。

块茎贮藏于4℃冰箱中2～5个月备用。

1.1.2 试管苗。

试管苗均为甘农薯1号,用它提供所需的茎段、叶片以及小植株侵染的材料。

试管苗用单节切段法保存和繁殖,即将带有1个腋芽的茎段扦插于M S培养基中,置于25℃左右,室内散射光下培养和保存,每隔30～50d继代繁殖1次。

所用扦插培养基为:M S+0.5m g/L IAA+3.0%蔗糖+0.6%琼脂(pH值5.8)。

1.1.3 子叶、下胚轴。

所用实生种子为新型栽培种NW-174。

它的消毒方法是:先将实生种子在70%酒精中浸泡30s并不断搅拌,再用10%次氯酸钠溶液浸泡20m in,最后用无菌水冲洗3～4次,在无菌吸水纸上吸干水分。

将消毒过的实生种子播种在M S无机盐的琼脂(0.6%)培养基上,在室温和连续光照(2000lx)下培养7～10d,待实生苗子叶刚张开时,取子叶及下胚轴切段接种农杆菌。

1.2 细菌培养和菌液制备1.2.1菌落培养。

所用野生农杆菌菌株为TFA16YK、TFA16YE、B6、T37,均在固体培养基(Y EM或Y EB)上培养:将保存的菌种在YEM(YE B)培养基上用接种针进行平板划线法接种,每24～48h划线1次,连续划2～3次,以纯化菌种。

划好的菌种置于25～28℃恒温箱中黑暗培养。

1.2.2 菌液的制备。

将连续培养48h的新鲜透明菌落,用接种针挑于配备好的PB S溶液或不加琼脂的Y EB(YEM)溶液中,一般每15～20m l中挑5～6个菌落,在旋涡混匀器上安徽农业科学,Jo u rn a l o f A n h u i A g r i.S c i.2007,35(27):8427-8429责任编辑孙红忠责任校对李菲菲粉碎后,在25℃黑暗条件下振荡培养6h过夜,此时细菌正好处于生长对数期。

细菌的浓度用血球计数板或分光光度计测定,一般含有细菌108个/m l。

培养基配方如下:①YEM:K2H PO40.5g/L+M gSO4・7H20.2g/L+N aC l0.1g/L+甘露醇10.0g/L+酵母提取物0.4 g/L+0.8%琼脂(pH值6.9);②YE B:牛肉浸膏5g/L+酵母浸膏1.0g/L+蛋白胨5.0g/L+蔗糖5.0g/L+M gSO4・7H20 0.5g/L+0.8%琼脂(pH值7.2);③PB S溶液:KH2PO4430 m g/L+N a2H PO41480m g/L+N aC l720m g/L(pH值7.2)。

1.3 转化方法1.3.1 块茎侵染。

将备用两个品种的块茎洗干净,用吸水纸吸干水分后,放入15%～20%的次氯酸钠溶液中浸泡15 m in,用灭菌水冲洗4～5次,用灭菌刀削去表皮,用直径9m m 的无菌打孔器打成长条,削去两端,再用无菌刀切成4m m厚的圆片浸入菌液中,浸泡15m in,再将切块取出置于无菌吸水纸上吸干表面菌液,然后平放于0.8%的水琼脂培养基上,每皿放6～9块薯块。

同时设置对照(用无任何细菌的PB S溶液浸泡)。

封好的培养皿均放在25℃左右、2000lx连续光照的人工气候箱中培养,培养15d左右,将长出的2～3m m的癌瘤切下置于补加0.5m g/m l羧苄青霉素(C b)的M S培养基上生长,每7～10d继代培养1次。

培养4～5次后一般均可得到无菌癌瘤组织,置于分化培养基上促进其分化。

分化培养基:M S+GA3(5、3、5、10m g/L)+6-BA(2.25、1.50、6.00、10.00m g/L)+3.0%蔗糖+0.5%琼脂(pH值5.8) 1.3.2 茎段和叶盘侵染。