4.1植物遗传转化方法和技术
植物基因转化常用方法(植物遗传,农杆菌、病毒介导和基因枪转化法)
一. 植物遗传转化的方法植物遗传转化技术可分为两大类：一类是直接基因转移技术，包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等，其中基因枪转化法是代表。
另一类是生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。
二.农杆菌介导的基因转化方法（一）农杆菌的Ti质粒与T-DNA的整合机制几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染，而产生根瘤。
它是一种革兰氏阴性土壤杆菌（A. tumefaciens）。
其致瘤特性是由Ti（tumor－inducing）质粒介导的。
农杆根瘤菌之所以会感染植物根部是因为植物根部损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质可以诱导Vir（Virulence region)基因的启动表达，Vir基因的产物将Ti质粒上的一段T－DNA单链切下，而位于根瘤染色体上的操纵子基因产物则与单链T－DNA结合，形成复合物，转化植物根部细胞。
T－DNA上有三套基因，其中两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤。
第三套基因合成冠瘿碱，冠瘿碱有四种类型：章鱼碱（octopine）、胭脂碱（nopaline）、农杆碱（agropine）、琥珀碱（succinamopine），使农杆菌生长必需的物质。
1. Ti质粒的结构在发现根瘤农杆菌诱发冠瘿瘤的本质是Ti质粒后，Ti质粒便成为冠瘿瘤形成基因鉴定与分析的主要研究对象。
Ti质粒大约在160～240kB之间。
其中T-DNA大约在15kb-30kb。
Vir基因区在36kb 左右。
除此之外，Ti质粒上还存在Con区（region encoding conjugation)和Ori区（origin of replication)。
T-DNA上共有三套基因和左右两个边界，LB和RB是长为25bp的末端反复重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。
生物学中的植物遗传转化与基因编辑技术
生物学中的植物遗传转化与基因编辑技术植物遗传转化与基因编辑技术在生物学中的应用植物遗传转化与基因编辑技术是生物学领域中的重要研究方向，它们可以用于改良植物品种、提高农作物产量和抵抗力、开发新型植物药物等。
一、植物遗传转化技术的原理和方法植物遗传转化是指将外源基因或DNA片段导入植物细胞，并使其稳定地遗传给后代。
常见的植物遗传转化方法包括农杆菌介导的遗传转化、基因枪法和凯南法等。
1. 农杆菌介导的遗传转化农杆菌介导的遗传转化是最常用的植物遗传转化方法之一。
该方法利用土壤中广泛存在的植物病原性农杆菌将外源基因导入目标植物细胞。
首先，将外源基因插入农杆菌质粒的T-DNA区域，然后将农杆菌通过注射或浸泡等方式导入植物细胞。
在遗传转化后，利用选择标记基因或报告基因进行筛选和检测。
2. 基因枪法基因枪法是将DNA载体以高速射击的方式直接导入植物细胞。
将外源基因负载在金粒等微粒表面，然后使用高压氦气或火药等加速器将其射入植物细胞。
在转化后，通过培养基中的选择性筛选剂来筛选转化的细胞。
3. 凯南法凯南法是一种基于物理和化学手段的遗传转化方法。
通过利用聚乙烯醇（PEG）或电击等方法，使DNA能够与植物细胞质融合，然后通过培养和筛选等步骤来获得转化的植物细胞。
二、基因编辑技术在植物遗传改良中的应用基因编辑技术是指通过精确地修改植物基因组中的特定位置，实现遗传改良的方法。
常见的基因编辑技术包括CRISPR-Cas9系统、TALENs和ZFNs等。
1. CRISPR-Cas9系统CRISPR-Cas9系统是一种高效、快速和精确的基因编辑技术。
它利用CRISPR RNA（crRNA）和转录单元RNA（tracrRNA）组成的复合物与Cas9蛋白结合，以形成靶向特定基因序列的复合物。
在植物中，CRISPR-Cas9系统被广泛应用于基因敲除、基因敲入和基因修饰等方面。
通过将CRISPR-Cas9系统导入植物细胞，可以实现对植物基因组的精确编辑。
植物遗传转化步骤
植物遗传转化步骤植物遗传转化是指通过外源DNA的导入，使植物细胞或组织发生基因改变，从而获得具有特定性状的转基因植物。
这一技术在农业、医学和工业等领域有着广泛的应用。
下面将介绍植物遗传转化的基本步骤。
步骤一：选择外源DNA在植物遗传转化中，首先需要选择外源DNA，也就是我们要导入到植物细胞中的目标基因。
这个目标基因可以来自于其他物种，也可以是人工合成的。
目标基因的选择取决于我们希望在转基因植物中表达的特定性状。
步骤二：构建转化载体将目标基因导入植物细胞需要使用载体。
载体是一种专门设计用于植物遗传转化的DNA分子。
通常，载体由多个组成部分组成，包括启动子、终止子、选择标记和目标基因。
这些组成部分的功能是确保目标基因能够在植物细胞中正确表达。
步骤三：转化载体导入植物细胞一旦构建好转化载体，接下来就需要将其导入到植物细胞中。
目前，有多种方法可以实现这一步骤，包括农杆菌介导转化、基因枪法和电穿孔法等。
这些方法都可以有效地将外源DNA导入植物细胞，使其成为转基因细胞。
步骤四：筛选转基因细胞一旦植物细胞被导入外源DNA，我们需要对其进行筛选，以确定哪些细胞成功地获得了目标基因。
为了实现这一步骤，常常会在转化载体中加入选择标记基因，如抗生素抗性基因。
只有携带了目标基因的细胞才能存活下来，而其他细胞则会被筛选掉。
步骤五：培养和再生转基因植物筛选出的转基因细胞可以通过培养和再生来获得完整的转基因植物。
这一过程通常需要在培养基上进行，通过提供适当的营养物质和激素来促进细胞分裂和分化。
经过一段时间的培养，转基因细胞可以发展成为转基因植物。
步骤六：鉴定转基因植物需要对获得的转基因植物进行鉴定，以确认其是否成功地获得了目标基因。
这一步骤通常需要使用分子生物学技术，如PCR和Southern blot等，来检测目标基因的存在和表达。
只有经过鉴定的转基因植物才能用于进一步的研究或应用。
总结：植物遗传转化是一项复杂的技术，需要经历多个步骤才能成功。
植物遗传转化
花椰菜遗传转化方法如图： 发根农杆菌介导 根瘤农杆菌介导
（三）林木遗传转化的技术
目前以掌握了杨树、白桦、桉树、落叶松、核 桃、苹果、沙田柚等树种外源基因转化技术。主要 转化方式是农杆菌介导法。增强植物抗病、耐高温、 耐旱等方面。
（四）药用植物遗传转化的技术
主要采用农杆菌介导法，其他方法成功的例子 极少。
第十七章：植物遗传转化
Section 1: 植物遗传转化的方法
Section 2: 转化植株的检测 Section 3: 几种植株遗传转化的 技术
植物遗传转化 （plan genetic transformation): 应用重组DNA技术、细胞组织培养 技术或种质 系统转化技术，有目的地将外源基因或DNA片 段插入到受体植物基因组中并通过减数分裂获 得新植株的技术。
•
（2）方法：人们将目的基因插入到经过 改造的T—DNA区，借助农杆菌的感染实现外 源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过 细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中， 近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物 (尤其是水稻)中也得到了广泛应用。
（3）转化步骤可简单概括为以下方面：
Section 2: 转化植株的检测
以报告基因检测为例：
报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶
的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被 鉴定的基因。目前主要的报告基因如下：
Section 3: 几种植株遗传转化的技术
（一）大田作物遗传转化的技术
①油菜的遗传转化技术 农杆菌介导转化法：根据不同的基因型选择适的培养基。
1、获取目的基因。用限制酶切割下目的基因。 2、基因表达载体的构建。将目的基因与载体（大 多数选用质粒）用DNA连接酶连接起来。 3、将目的基因导入受体细胞。将含目的基因的重 组质粒导入农杆菌（农杆菌为受体细胞）。 4、目的基因的检测与鉴定。用DNA分子杂交技术/ 分子杂交技术/抗原-抗体杂交/个体生物学水平鉴定 （这个方法需要导入重组后的细胞的植物体，详见 第五步） 几种方法进行检验（根据要求选取不同方 法）。 5、最后将成功表达的细胞导入植物体内，对植物 体进行个体生物学水平鉴定。
植物遗传转化步骤
植物遗传转化步骤
植物遗传转化是指通过人为手段，将外来基因导入植物细胞内，使其产生新的遗传特征。
植物遗传转化的步骤主要包括以下几个方面： 1. 基因载体构建：基因载体是将所需基因导入植物细胞内的载体，包括质粒、病毒、人工染色体等。
构建基因载体需要选择适当的载体和适合的启动子、终止子、选择标记等元件。
2. 转化体系建立：植物遗传转化需要建立一套合适的转化体系，包括培养基的配制、细胞培养和再生体系等。
转化体系的搭建需要考虑到不同物种、基因载体和转化方法的特点。
3. 基因导入：基因导入可以通过直接基因转移、基因炮击、农
杆菌介导转化等手段进行。
其中，农杆菌介导转化是最常用的基因导入方法。
在基因导入过程中，可以使用选择标记来筛选生产基因转化植株。
4. 识别和筛选：基因转化后的植物细胞需要进行识别和筛选。
常用的识别方法包括PCR检测、Southern杂交、Northern杂交等。
筛选方法可以通过细菌耐草酸和遗传标记等手段进行。
5. 品系选育：经过基因转化的植物需要进行品系选育，通过选
择有利的基因型和表型，后代将具有更好的遗传特征。
品系选育需要进行多代重复筛选，最终得到具有稳定表达和优良性状的转化植株。
6. 安全评价：基因转化后的植物需要进行安全评价，包括对植
物生长性状、代谢产物、土壤微生物等方面的评价。
安全评价是确保基因转化植物的生态安全性和食品安全性的重要环节。
植物遗传工程研究植物遗传改良的技术和方法
植物遗传工程研究植物遗传改良的技术和方法植物遗传工程是一门综合性的科学，通过应用现代分子生物学和基因工程等先进技术，研究植物的遗传改良和基因转化。
在农业领域，植物遗传工程的研究对于提高作物的抗病害能力、增加产量以及提高品质具有重要意义。
本文将介绍一些常用的植物遗传工程技术和方法。
一、基因克隆和表达1. 重组 DNA 技术重组 DNA 技术是植物遗传工程的基础，它包括 DNA 片段的切割、连接、克隆等步骤。
首先，利用限制酶对目标 DNA 片段进行切割，然后将所需的 DNA 片段与载体 DNA 进行连接，形成重组 DNA。
最后，将重组 DNA 转化到宿主细胞中，并利用筛选标记来鉴定带有目标基因的细胞株。
2. 基因表达基因表达是指将外源基因成功转化到植物细胞中，并使其在细胞中进行表达。
常见的基因表达技术包括利用细菌介导的直接基因转化、农杆菌介导的转染、基因枪法等。
这些技术可以将外源基因导入到植物细胞的核或线粒体中，并通过转录和翻译过程使其在植物中表达出来。
二、基因编辑和突变1. CRISPR-Cas9 技术CRISPR-Cas9 是一种常用的基因编辑技术，它能够精确地修改植物的基因组。
该技术利用 CRISPR RNA 导向 Cas9 蛋白定位到目标 DNA 上，并通过剪切目标 DNA 来引发基因组编辑。
通过调整导向 RNA 的序列，可以精确地编辑植物基因组中的特定部分，实现基因的添加、删改或突变。
2. 诱导突变技术诱导突变技术是一种利用物理或化学方法诱导植物基因组中的突变。
常用的诱导突变方法包括化学物质诱导突变、辐射诱导突变和基因靶向突变等。
通过诱导突变，研究人员可以获得大量的突变体，进而研究突变体在形态、生理和遗传等方面的变化，为植物育种提供新的资源。
三、转基因和基因导入1. 转基因技术转基因技术是指将外源基因嵌入到植物的基因组中，并使其稳定遗传。
转基因技术在植物遗传改良中有着广泛的应用，例如通过转入特定基因来增强植物对病原体的抵抗力，或者提高植物的产量和质量等。
[医学]第十一章植物的遗传转化技术
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二、植物遗传转化方法
1.农杆菌介导法 农杆菌是一类革兰氏阴性土壤杆菌（G－），活在植物
根的表面依靠由根组织渗透出来的营养物质（冠瘿碱）生 存的一类细菌。
农杆菌可分为根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciems （含Ti质粒）和发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes （含 Ri质粒） ，在植物基因工程中以根瘤农杆菌的Ti质粒介导 的遗传转化最多。
二、植物遗传转化方法
1.农杆菌介导法 Ti质粒的改造 除去T-DNA上的生长素（tms）和分裂素（tmr）生物合成基因， 因为大量的生长素和分裂素会抑止细胞再生长为整株植物； 除去T-DNA上的有机碱生物合成基因（tmt）；因为有机碱的合成 大量消耗精氨酸和谷氨酸，影响植物细胞的生长； 除去 Ti 质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体的长度； 安装大肠杆菌复制子，使其能在大肠杆菌中复制，以利于克隆操作； 安装植物细胞的筛选标记，如 neor 基因，使用植物基因的启动子 和polyA化信号序列； 安装多聚人工接头以利于外源基因的克隆。
一、植物遗传转化的受体系统
二、植物遗传转化方法
转基因方法 概括起来说主要有两类： 第一类是以载体为媒介的遗传转化，也称为间接转移 系统法。如农杆菌介导法、病毒介导法。 第二类是外源目的DNA的直接导入。如基因枪法、电 激法、超声波法、显微注射法、花粉管通道法等。
二、植物遗传转化方法
载体介导转移系统 最常见的转基因方法。 将外源基因重组进入适合的载体系统，通过载体将携 带的外源基因导入植物细胞，整合在核染色体组中并随核 染色体复制和表达。 农杆菌Ti质粒（tumor-inducing plasmid）或 Ri质粒 (root-indcing plasmid)介导法是迄今为止植物基因工程中应 用最多、机理最清楚、最理想的载体转移方法。
植物生物技术：第十章 植物遗传转化技术和方法
2. 无菌苗制备
3. 外植体与农杆菌共培养
取7d左右的棉花无菌苗置于无菌平皿，迅速切成0.5-0.7cm左右 的小段，放入农杆菌工程菌液，放置5-10min；期间摇动三角瓶 数次，然后取出下胚轴小段，置于干燥的无菌滤纸上，吸干材 料表面的菌液，吹5分钟使表面稍为干燥，分散布于垫有滤纸的 共培养培养基(MS无机盐+B5有机物+2,4-D 0.1mg/l+ KT0.1mg/l+葡萄糖30g/l + 琼脂7.5g/l, pH 5.6 )中，19-21℃, 暗 培养48小时结束共培养。
进行花序侵染前先剪掉角果和花，然后将拟南芥的花序浸 泡于含农杆菌的渗透培养基里2-3分钟，可用吸管轻轻搅拌 农杆菌浸染缓冲液，以利于转化，浸染结束后将植株平放 于吸水纸上干燥数分钟，以免农杆菌菌液滴落到莲座叶上 ，同时也避免过高浓度的农杆菌对植株有毒害作用。
转化完成后套黑色塑料袋进行暗培养，1天后，揭开塑料 袋进行光照培养直至角果成熟。
抗3’和5’外切核酸酶及内切核酸酶的降解 加工好的单链T-DNA复合体穿过由VirB蛋白形成的类接合孔进入植物受
体细胞，然后由VirD2和VirE2的核导向作用进入植物细胞核
（6）T-DNA的整合
当单链的T-DNA转移到植物细胞之后，在有关的 植物细胞酶体系的催化作用下，便会合成出互 补链形成双链形式的T-DNA分子。 在一系列酶 的参与下整合进植物基因组。
（4）外植体的类型和生理状态
1997年Villemont研究指出，转化只发生在细胞分裂的一个 较短时期内，只有处于细胞分裂S期的细胞才具有被外源基 因转化的能力。因此，细胞具有分裂能力是转化的基本条 件。 一般来说，发育早期（幼年期）的组织细胞转化能力较强。
植物基因工程实验教案：遗传转化技术的应用和优化
植物基因工程实验教案：遗传转化技术的应用和优化植物基因工程是一种将目标基因移入植物细胞内的方法，以实现改良作物品种的过程。
这一技术可以应用于许多方面，如增强作物产量、提高作物品质、促进作物抗病抗虫能力等。
植物基因工程是一个极具潜力的领域。
本文将介绍植物基因工程实验教案中的遗传转化技术的应用和优化。
一、遗传转化技术遗传转化技术是一种将外源基因转移入植物细胞中的方法，该方法包括四个主要步骤：选择载体、制备载体、转化载体和鉴定基因。
选择载体：目前用于植物基因工程的两种载体是农杆菌和冷冻冻融法。
农杆菌转化法是最常用的方法之一，农杆菌以同源重组的方式在植物细胞中形成感染斑。
农杆菌将外源基因植入植物细胞中，目标基因将被插入植物细胞的染色体中。
制备载体：载体是一种可以将外源基因植入植物细胞内的DNA分子。
在制备载体的过程中，需要用到回收携带目标基因的载体。
常用的载体包括质粒和病毒，质粒是一种带有目标基因的圆形DNA分子，可以将目标基因直接植入质粒中。
转化载体：转化载体是指将目标基因输送至植物细胞内的过程。
转化方法主要有两种：物理转化和生物转化。
物理转化是指通过高斯粒子加速器等物理手段将目标基因输送至植物细胞内；生物转化是指使用农杆菌或病毒将外源基因输送至植物细胞内。
鉴定基因：鉴定基因是指确定转化后的植物细胞中是否成功植入了外源基因。
通常使用PCR和Southern杂交等方法对植物细胞进行鉴定。
二、遗传转化技术的应用1. 增强作物产量：遗传转化技术可以实现植物细胞的营养分配和代谢的调节，从而提高作物的生长速度和生产力；2. 提高作物品质：通过遗传转化技术，可以改善作物的色、香、味等特征；3. 促进作物抗病抗虫能力：外源基因的应用可以帮助作物提高其对病菌、虫害等的抵抗力；4. 创建新的生物技术：可以通过遗传转化技术创建新的生物技术，例如转基因药物、疫苗等。
三、遗传转化技术的优化虽然遗传转化技术在基因工程领域中应用较为广泛，但是该技术仍存在一些问题。
遗传转化的方法和技术
遗传转化的方法和技术常见的遗传转化方法和技术包括农杆菌介导法、基因枪转化法和聚乙二醇-介导法等。
其中，农杆菌介导法是植物基因转化中使用最普遍的一种方法。
其Ti质粒具有将DNA整合到植物染色体上，并使之与植物内源基因同步表达的能力。
农杆菌介导法的具体步骤如下：1. Ti质粒的构建：利用农杆菌进行遗传转化前，必须对Ti质粒进行改造。
改造的目的有以下几点：去除T-DNA区的激素基因，因为激素基因的产物会导致转化细胞激素水平的不平衡而引起细胞的无限分裂，阻碍正常植株的再生。
保留T-DNA区的左右边界，尤其是左边界，以保证T-DNA的正常转化。
在去除的T-DNA区，增加至少一个可以在植物体内表达的选择基因，以使转化细胞易于被检测出来。
在T-DNA区外加一个可以克隆外源目的基因的多聚接口。
在T-DNA区外加一个抗菌素基因标记质粒，该基因只能在细菌中表达，而不能在植物中表达。
2. 外源基因的转化：除Ti质粒外，发根农杆菌的Ri质粒也已成为植物基因工程载体家庭中的新成员。
发根农杆菌感染植物伤口，向目的植物转入Ri质粒中的T-DNA，经一段时间后被感染的植物会在不定的部位生出发状根。
发状根没有向地性，可在无激素的培养基上培养生长，生长迅速并产生许多分枝，其增长速度一个月可增殖数倍到数百倍。
发根农杆菌对植物的这种作用主要依赖于其菌体中的Ri质粒。
例如通过发状根培养来生产只有在高度的根趋向分化细胞中才能产生的有用次生代谢物质等。
3. 外源基因的转化：一般而言，农杆菌只感染双子叶植物；但利用Ti质粒作载体已将外源基因导入了水稻、玉米、吊兰、石刁柏、香蕉等某些单子叶植物中。
农杆菌介导的遗传转化技术简单，易于掌握，对植物受体要求不严，绝大多数双子叶植物和少数单子叶植物的组织或器官均可，且转化频率较高，转化周期较短，是目前应用最广的一种植物遗传转化方法。
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植物遗传转化及其农业应用
植物遗传转化及其农业应用植物遗传转化是指将外源基因或DNA序列稳定地导入植物细胞或组织，并使其遗传表现进行改变的技术。
随着这项技术不断发展和完善，越来越多的植物种类被进行遗传转化，其应用也越来越广泛。
在农业生产领域，植物遗传转化技术被广泛应用，如提高农作物的生产力、耐旱、耐盐等性状，研发新品种等，对于推进农业现代化起到了重要作用。
一、植物遗传转化技术及其分类植物遗传转化技术可分为两类：直接转化和间接转化。
直接转化是指将外源DNA直接导入植物细胞或组织，利用种种手段促使外源DNA整合入植物基因组，从而改变其遗传表现。
直接转化分为生理、物理和化学三种方法。
生理方法是将植物组织培养在含有激素和其他化合物的培养基上，使其形成愈伤组织和再生植株，再利用农杆菌或冷杆菌等载体导入外源DNA。
物理方法是利用生物粒子枪，通过高速粒子冲击将DNA导入植物细胞或组织中。
化学方法是利用钙离子或聚乙烯醇等高分子材料电转化植物细胞或组织。
间接转化是指将外源基因先导入细菌或酵母等微生物细胞中，再利用这些细胞的载体介导导入植物细胞或组织中，使其发生遗传改变。
间接转化主要的手段是农杆菌介导转化。
农杆菌T-DNA 的导入具有高效、选择性和可重复性等优点，因此也是植物遗传转化中最常用的技术。
二、植物遗传转化在农业生产中的应用1. 提高农作物产量和品质通过基因工程技术对农作物进行遗传改良，可以提高作物产量和品质。
例如，利用玉米中的赤霉烯合成酶基因调控葡萄果实的脱落酸合成，可以延长果实的寿命和保留其营养成分，提高果实的品质；利用独苗菜中的β-半乳糖苷酶基因使西瓜果肉中木瓜素和木瓜苷的含量降低，从而提高西瓜的口感和品质。
2. 研发新品种通过植物遗传转化技术，可以引入新的基因或遗传材料，从而研发新的品种。
例如，将水稻中的鱼腥草酸合成酶基因导入玉米中，产生了抵抗昆虫的转基因玉米；将独苗菜中的组氨酸脱羧酶基因引入番茄中，产生了抗沙漠化的转基因番茄。
植物遗传转化步骤
植物遗传转化步骤植物遗传转化是一种通过改变植物的遗传物质来实现特定目的的技术。
这一技术已经被广泛应用于植物育种、基因工程和农业生产中。
下面我们将介绍植物遗传转化的具体步骤。
一、选择目标植物和目标基因在进行植物遗传转化之前，首先需要确定目标植物和目标基因。
目标植物通常是经济作物或者重要的研究对象，而目标基因则是具有特定功能的基因，如抗病性、耐旱性等。
二、构建载体构建载体是进行植物遗传转化的重要步骤之一。
载体是将目标基因导入植物细胞的媒介，通常由DNA序列构成。
在构建载体时，需要将目标基因插入到适当的表达载体中，并加入其他必要的DNA片段，如启动子、终止子和选择标记基因等。
三、转化载体到植物细胞将构建好的载体导入植物细胞是植物遗传转化的核心步骤。
目前常用的转化方法有农杆菌介导的转化和基因枪法。
农杆菌介导的转化是将构建好的载体转化到农杆菌中，然后利用农杆菌侵染植物组织，将载体导入植物细胞。
基因枪法则是利用高压气体将载体直接“射击”到植物细胞中。
四、筛选转化植株在转化植物细胞后，需要进行筛选以获得含有目标基因的转化植株。
为了区分转化植株和未转化的植株，常常会在载体中加入选择标记基因。
选择标记基因通常会使转化植株对某种抗生素或除草剂具有耐受性，在培养基中添加相应抗生素或除草剂后，只有含有目标基因的转化植株能够生长下去。
五、培养和繁殖转化植株筛选出含有目标基因的转化植株后，需要进行培养和繁殖。
通常会将转化植株移至含有适当营养物质的培养基中进行生长，以获得足够数量的转化植株。
六、鉴定转化植株在培养和繁殖转化植株后，需要对其进行鉴定，确认其是否成功转化。
鉴定方法包括PCR扩增、Southern印迹和Western印迹等。
通过这些方法，可以检测目标基因在转化植株中的存在和表达情况。
七、后续分析和应用一旦确认转化植株成功，就可以进行后续的分子生物学和生理学分析，如基因表达分析、蛋白质功能研究等。
此外，转化植株也可以用于基因工程和农业生产中，如改良作物品质、提高产量等。
植物遗传转化研究植物基因工程和遗传转化技术
植物遗传转化研究植物基因工程和遗传转化技术植物遗传转化研究：植物基因工程和遗传转化技术植物遗传转化研究是现代生物技术领域的一个重要分支，它通过操纵植物的基因来改变其性状和功能，为农业、生物医学和环境保护等方面提供了广阔的应用前景。
本文将介绍植物基因工程的原理和遗传转化技术的发展现状，以及其在农业和医学领域的应用。
一、植物基因工程原理植物基因工程是指通过人为干预植物基因组，将外源基因导入植物细胞，并使其在植物中表达。
其核心技术是DNA重组技术，具体包括以下几个步骤：1. 外源基因的克隆：将具有特定功能的基因从其他生物体中分离出来，并经过体外扩增，得到足够的DNA片段。
2. 载体构建：将目标基因与适当的表达载体连接，构建成重组DNA。
常用的载体包括质粒和病毒。
3. 转化方法：将重组DNA导入植物细胞。
常用的转化方法有农杆菌介导的转化和基因枪介导的转化等。
4. 选择与筛选：利用选择标记基因或者报告基因等，对经转化的植株进行筛选和鉴定，确保目标基因已经成功导入植物细胞。
5. 后续培养：将转基因植株培养至成熟植株，并进行繁殖和观察，验证目标基因的功能和表达。
二、遗传转化技术的发展现状随着生物技术的不断进步，植物遗传转化技术也得到了广泛应用，取得了许多重要成果。
目前常用的植物遗传转化技术包括农杆菌介导的转化、基因枪介导的转化、电击法等。
农杆菌介导的转化是最常用的植物遗传转化技术之一，利用农杆菌通过水分或创伤进入植物细胞，将外源基因导入植物基因组。
该技术具有高效性和选择性，并且适用范围广泛，在获得转基因植株方面具有重要作用。
基因枪介导的转化是一种直接将外源DNA通过高速银粒枪或金粒枪射入植物组织的方法。
该技术能够克服农杆菌介导的转化对组织的要求较高的限制，使得更多的植物种类能够进行遗传转化。
电击法是一种利用暴露在电场中的植物细胞的特定瞬间可逆孔效应，使得外源DNA通过电穿孔方式导入细胞的方法。
该技术常用于难以转化的植物种类，如谷物、树木等。
植物遗传转化的名词解释
植物遗传转化的名词解释植物遗传转化是一种创新性的生物技术手段，利用现代分子生物学和遗传学技术方法，将外源基因导入植物细胞或组织中，使其在遗传层面上发生改变和转化。
这一技术突破了传统育种手段的限制，可以快速地实现植物功能基因的扩增与转移，从而获得具有新的性状和特性的转基因植物。
植物遗传转化技术的基本原理是将外源基因通过特定的载体和转化方法导入植物细胞，然后利用植物细胞再生和组织培养的技术手段，通过筛选和鉴定获得转基因植物。
这一过程中，外源基因会在植物细胞中整合到染色体中，与宿主基因相互作用，从而改变植物的基因组和表型。
植物遗传转化技术的应用范围非常广泛。
首先，它可以用于植物抗病虫害的育种。
通过导入具有抗病虫害基因的外源基因，可以使植物获得抗性，减少使用农药的量，提高农作物的产量和质量。
其次，植物遗传转化技术可以用于植物的耐逆性改良。
通过导入耐旱、耐寒、耐盐等逆境胁迫基因，可以使植物在恶劣环境中更好地生长和发育。
此外，植物遗传转化还可以用于植物的品质改良，例如提高水稻的粮质、改善果实的营养含量等。
在植物遗传转化中，最常用的转化方法包括农杆菌介导的转化和基因枪法。
农杆菌介导的转化是将外源基因导入农杆菌中，然后利用农杆菌与植物细胞的基因组相容性，使其效应质粒转移至植物细胞。
基因枪法则是将外源基因以微粒金属或植物病毒颗粒的形式，通过加速装置射入植物细胞中。
在植物遗传转化中，关键的一步是选择适合的载体。
常用的载体包括质粒和病毒。
质粒是一种可以自我复制的遗传物质，通常由起始位点、启动子、终止子、选择标记基因和目的基因等组成。
而植物病毒则是利用其某些特性，将外源基因导入植物细胞。
近年来，随着基因编辑技术的出现和发展，植物遗传转化的技术手段也得到了进一步的改良。
基因编辑技术可以直接修饰植物基因组中的目的基因，而无需导入外源基因。
这一技术的出现，使得遗传转化更为高效、精确和安全。
尽管植物遗传转化技术在农业生产和植物科学研究中有着广泛的应用前景，但也引发了一些争议。
植物的遗传改良与转基因技术
转基因植物的应用领域
01 抗病虫害
转基因植物具有抗病虫害能力，减少农药使 用
02 耐逆性
转基因植物对环境逆境有较强的适应能力
03 提高产量
转基因技术可以增加植物的产量，提高农作 物产量
转基因技术的争议
01、
安全性问题
转基因食品对人体安全性存在争议
部分人担心转基因食品可能引发健康问题
03、
02、
● 04
第四章 植物的基因编辑技术
基因编辑技术的 原理
基因编辑技术是一种 通过编辑植物基因组 中的特定位点，实现 精准基因改良的技术。 通过定点编辑，可以 准确调整植物的遗传 特性，进而培育出具 有目标性状的植物品 种。
基因编辑技术的应用
快速培育植 物品种
提高育种效率
增加植物抗 病能力
提高生存率
植物遗传改良是指通 过选择、杂交和变异 育种等手段改善植物 的遗传性状，以提高 产量、抗逆性等特性。 在农业生产中，植物 遗传改良起着关键作 用，帮助人类获取更 好的作物品种。
植物遗传改良的历史
农业起源时 期
人类最早开始进 行植物遗传改良
现代育种技 术
运用现代科学技 术加速植物遗传
改良进程
遗传学发展
精准改良遗 传特性
实现目标性状
基因编辑技术的前景
基因编辑技术为植物遗传改良带来了新的可能性， 有望进一步提高植物的遗传性状。随着技术的不 断发展，植物育种领域将迎来更多创新与突破。
基因编辑技术的挑战
01、
伦理挑战
涉及植物基因改良的道德问题
影响与利益的平衡
02、
法律限制
监管标准的制定与遵守
植物基因改良的法律法规
植物遗传改良对于实 现粮食安全、保护生 态环境等方面具有重 要意义。然而，也面 临着来自社会、伦理 和科技等多方面的挑 战。
植物遗传转化
从1986年首批转基因植物被批准进入田间试验
，至今国际上已有30个国家批准数千例转基因
植物进入田间试验，涉及的植物种类有40多种 。主要包括延熟番茄 , 抗除草剂的玉米、棉花 、大豆和油菜,抗虫的马铃薯、棉花和玉米,抗 病毒的西葫芦、南瓜和番木瓜 , 雄性不育的玉 米和莴苣 , 以及改变油脂特性的油菜和大豆等 。
。
优点： 不受宿主范围的限制 操作简便 成本底 缺点： 一般只适用于原生质体的转化，而原生质体 再生植株并不容易，转化效率低; 再生植株常不可育或形态异常、多拷贝插入等 现象。
• 花粉管通道法 利用开花植物授粉后形成的花粉管通道，直接将 外源目的基因导入尚不具备正常细胞壁的卵、合子或 早期胚胎细胞，实现目的基因的转化。 步骤： １）去除花冠; ２）用微量注射器从断面沿花柱中轴插入子房长度的约 １／４处，再退回２毫米左右; ３）注入含外源目的基因的缓冲液; ４）正常管理，收获种子, 经筛选获得转基因植株。
转基因块茎中花色苷含量分析
一种基于同源重组构建多基因双元载体的方法张兴国按目的基因导入位置细胞核叶绿体按启动子的类型组成型启动子特异性启动子遗传转化的主要方法农杆菌介导的遗传转化基因枪法电击法注射法化学药剂诱导转化花粉管通道法根癌农杆菌ti质粒转化系统外植体农杆菌共培养芽诱导抗生素筛选生根培养植株再生分子检测转基因植株获得技术特点
整合后外源基因结构变异小
操作简便等优点
该技术已成为转化成功最多的一种转化方法
• 基因枪法(particle gun) 又称微弹轰击法 (microprojectile bombardment或 particle bombardment) 。 该法借助高速运动的金属 粒子将附着于其表面的核 酸分子引入受体细胞，外 源基因进入受体细胞核后 整合到染色体组，然后通 过组织培养再生出完整个 体(植株)。
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大豆子叶节器官发生系统的优化
1.
2. 3. 4. 5.
大豆无菌苗的获得
外植体的制备（类型、生理状态） 高分化率基因型的选择 丛生芽诱导培养基的确定 丛生芽伸长培养基的确定
6.
7.
生根培养基的确定
移栽
7
每外植体芽数 Shoots per explant
6 5 4 3 2 1 0
14 12 35 29 丰 丰 豆 林 丰 一 科 黄 13 号 6
该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒 性，故称之为毒性区。 T-DNA
T-DNA区与Vir区在质粒DNA上彼此相邻， 合起来约占Ti质粒DNA的三分之一。
Vir LB
RB
③ Con区（regions encoding conjugations）
该区段上存在着与细菌接合转移的有关基因（tra）， 调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因， 诱导Ti质粒转移，因此称之为接合转移编码区。 ④ Ori区（origin of replication） 该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制 起始区。
棉花
1. 共培养
2. 在选择培养基上筛选
3. 筛选获得的抗性愈伤
F
5. 胚萌发成苗
6. 转基因植株移栽大田
4. 抗性愈伤分 化成胚状体
(a) Embryogenic calli generated from the scutella of mature seeds. Arrowheads show actively growing calli appropriate for Agrobacterium inoculation. (b) Inoculation of calli with A. tumefaciens. (c) Proliferation of hygromycin-resistant calli on N6D-S medium 3 weeks after transfer. Left calli are resistant to hygromycin and right calli are sensitive. (d) Shoot regeneration from calli resistant to hygromycin on MS-NK medium 3 weeks after transfer. (e) Rooting and growth of transgenic rice plants.
双元载体（反式载体）
野生型Ti质粒不能直接作为植物基因工程载体：
① Ti质粒分子量过大，一般在160～240kb； ② 分布各种限制酶的多个切点； ③ T-DNA区内含有许多编码基因，干扰宿主植物中内源激 素的平衡，转化细胞长成肿瘤，阻碍细胞的分化和植株 的再生； ④ Ti质粒不能在大肠杆菌中复制, 即使得到重组质粒， 也只能在农杆菌中进行扩增； ⑤ Ti质粒上还存在一些对于T-DNA转移不起任何作用的基 因。
一、根癌农杆菌介导法
根癌农杆菌介导法的分子机制 农杆菌介导法需要具备的条件 农杆菌介导法的基本流程
（一）根癌农杆菌介导法的分子机制
1、植物冠瘿瘤——植物的一种癌症
（1）冠瘿瘤的起因： 由根癌农杆菌对植物的侵染而引起。 （2）冠瘿瘤的侵染过程：
细菌通过伤口进入植物，在基因水平 上转化植物。细菌DNA中的编码基因在植 物细胞中表达，刺激植物细胞不受控制的 分裂，形成瘤。
缺点：材料局限，转化率低。
3.原生质体再生系统
原生质体恢复细胞壁具有分化再生能力，是应用最早 的再生受体系统之一。 优点：高效、广泛地摄取外源DNA或遗传物质，获得基因 型一致的克隆细胞，所获转基因植株嵌合体少，适用于多 种转化系统； 缺点：不易制备、再生困难和变异程度高。
4.胚状体再生系统
是指具有胚胎性质的个体。 优点：个体数目巨大、同质性好，接受外源基因能力强， 嵌合体少，易于培养、再生。 缺点：技术含量高，多数植物不易获得胚状体。
1.愈伤组织再生系统
外植体材料经过脱分化培养诱导形成愈伤组织，转化（含 目的基因质粒的农杆菌侵染），分化培养获得再生植株。
优点：外植体来源广，繁殖快，易接受外源基因，
转化效率高。
缺点：遗传稳定性差、嵌合体
因此需要连续的再生系统
2.直接分化再生系统
外植体材料细胞不经过脱分化形成愈伤组织阶段，而 是直接分化出不定芽形成再生植株。 优点：周期短、操作简单，体细胞变异小，遗传稳定；
花粉粒的内壁通过花粉外壁上的萌发孔（或沟）向外 伸出的细管。一般每个花粉粒萌发时产生一个花粉管， 具多萌发孔的花粉粒开始可以同时长出数个花粉管， 但最终只有一个继续生长。花粉管是靠其末端生长的， 在高倍显微镜下可见花粉管末端有一个透明的半球形 区域称帽区。帽区之后的细胞质中含有多种细胞器， 这与花粉管的生长有关。花粉管长到一定长度后，原 来花粉粒中的内含物全部集中到花粉管的前端，花粉 管从柱头经花柱到子房，再进入胚珠及胚囊，将花粉 管中的两个精子及全部内含物释放到胚囊中，以便受 精作用的进行。花粉管是雄配子体的一部分。
第四章 植物基因工程
天津大学 杨少辉
植物基因工程是近20年来随着DNA重组技术、
植物遗传转化技术及植物组织培养技术而发展起
来的现代生物技术。 通过植物基因工程获得转基因植物，在农业 生产发展及植物分子生物学研究中有十分重要的 意义。目前，已获得很多有重大经济价值的转基
因植物。
基因工程的基本步骤
目的基因的获取
基因载体的选择与构建
目的基因与载体的拼接 重组子导入受体分子
重组子的检测
外源基因的表达和产物的分离
第一节 植物遗传转化方法
本节主要内容 根癌农杆菌介导法 基因枪介导法 其它转化方法
常用的植物转基因方法：
到目前为止, 已确立了11种植物转基因方法。根据
其转化原理，可分为三大类，即利用载体的转化系 统，不用任何载体，采用物理、化学方法直接将外 源基因导入受体细胞的直接转化系统以及利用植物 生殖细胞等种质媒介的种质转化系统。 现将这三大类系统的载体、转化原理、转化方法和 受体细胞等归纳如图4-1。
等），能高效、稳定地再生无性系，并能接受外
源DNA整合，对转化选择抗生素敏感的再生系统。
A. 植物基因转化受体系统的条件
（1）高效稳定的再生能力 （2）较高的遗传稳定性 （3）具有稳定的外植体来源 （4）对选择性抗生素敏感 （5）对农杆菌侵染有敏感性 （6）具有经济价值或理论研究意义。
B. 植物基因转化受体系统的类型
5、农杆菌介导的转化质粒的构建
目的基因 报告基因，选择标记基因
Ampr
P
G1
T
P
G2
T NOS
LB
RB
启动子的选择
35S, cauliflower mosaic virus 35S promoter
CaMV 35S is a strong promoter that is active in essentially all dicot plant tissues.
最常用的有：新霉素磷酸转移酶基因( NPTⅡ)、新霉 素抗性基因（neo）、庆大霉素抗性基因（gent）、 潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）,以及膦丝菌素乙酰转 移酶基因（bar）等。
A、新霉素磷酸转移酶基因（Npt-II）
新霉素抗性基因是从大肠杆菌转座子Tn5中分离的， 其对应失活的选择试剂为卡那霉素、新霉素和 G418。 对茄科植物（烟草、马铃薯、番茄）转化特别有 效，对豆科和单子叶植物效果不佳。
2、操作步骤：
immature embryos
（1）制备DNA微弹；
（2）准备靶外植体材料； （3）DNA微弹轰击； （4）培养轰击后的外植体．
high osmotic media prepare calli
3、转化率影响因素：
金属微粒：金粉颗粒较钨粒性质优良,但是价格昂 贵.
DNA沉淀辅助剂：这些化合物对DNA在微粒上的黏 附有重要作用,但对植物受体细胞也产生一定的伤 害.
2、Ti质粒 根瘤农杆菌染色体外的遗传物质，为共 价闭合环状的DNA分子。
（1）Ti质粒的功能
① ② ③ ④ ⑤
为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力； 参与寄主细胞合成激素的能力； 诱发植物产生冠瘿瘤；
赋予寄主分解冠瘿碱的能力；
决定寄主范围。
（2）Ti质粒的功能区域
– – – –
T-DNA区 Vir 区 Con 区 Ori 区
DNA纯度及浓度 微弹速度
植物材料内在因素
4、基因枪转化法的特点：
基因枪法的优点： 无宿主限制； 靶受体类型广泛； 可控度高； 操作简便。 问题： 1. 转化效率低； 2. 嵌合体多； 3. 稳定性差，瞬时表达； 4. 外源基因沉默； 5. 整合机理不详。
花粉管通道法
B、庆大霉素抗性基因（gent）
该基因编码一种乙酰转移酶，属抗生素标记基因， 它通过对庆大霉素的乙酰化而使其失活。
该选择系统目前也有一定的应用，例如矮牛、烟
草和番茄。
C、潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）
潮霉素是一种很强的细胞抑制剂，对许多植物都 有很强的毒性。潮霉素磷酸转移酶可通过对潮霉素 磷酸化而使其失活。
D、膦丝菌素乙酰转移酶基因（bar）
该基因是从吸水链霉菌中克隆的一种基因，其对 应的选择试剂为膦丝菌素（basta），膦丝菌素 可抑制谷氨酰胺合成酶的活性，从而导致非转化 细胞发生氨的致死性累积。
（三）农杆菌介导法的基本流程
大豆子叶节法为例：
大豆子叶节器官发生系统的优化 大豆农杆菌转化系统的优化