SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤
SDS-PAGE电泳实验步骤
SDS-PAGE电泳实验步骤垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋⽩质⼀、实验⽬的学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋⽩质的分⼦量的原理和基本操作技术。
⼆、实验原理蛋⽩质是两性电解质，在⼀定的pH条件下解离⽽带电荷。
当溶液的pH⼤于蛋⽩质的等电点(pI)时，蛋⽩质本⾝带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH⼩于蛋⽩质的等电点时，蛋⽩质带正电，在电场中将向负极移动；蛋⽩质在特定电场中移动的速度取决于其本⾝所带的净电荷的多少、蛋⽩质颗粒的⼤⼩和分⼦形状、电场强度等。
聚丙烯酰胺凝胶是由⼀定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合⽽成的三维⽹状孔结构。
本实验采⽤不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺⽤量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分⼦量的蛋⽩质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同⽽表现出不同的迁移率。
由于上层胶的孔径较⼤，不同⼤⼩的蛋⽩质分⼦在通过⼤孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进⼊⼩孔胶时，分⼦量⼤的蛋⽩质移动速度减慢，因⽽在两层凝胶的界⾯处，样品被压缩成很窄的区带。
这就是常说的浓缩效应和分⼦筛效应。
同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，采⽤两种缓冲体系；上层胶pH=6.7—6.8，下层胶pH＝8.9；Tris —HCI缓冲液中的Tris⽤于维持溶液的电中性及pH，是缓冲配对离⼦；CI-是前导离⼦。
在pH6.8时，缓冲液中的Gly-为尾随离⼦，⽽在pH＝8.9时，Gly的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离⼦的解离度，进⽽达到控制其有效迁移率之⽬的。
不同蛋⽩质具有不同的等电点，在进⼊分离胶后，各种蛋⽩质由于所带的静电荷不同，⽽有不同的迁移率。
由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分⼦筛效应及电荷效应，使不同的蛋⽩质在同⼀电场中达到有效的分离。
如果在聚丙烯酰胺凝胶中加⼊⼀定浓度的⼗⼆烷基硫酸钠(SDS)，由于SDS带有⼤量的负电荷，且这种阴离⼦表⾯活性剂能使蛋⽩质变性，特别是在强还原剂如巯基⼄醇存在下，蛋⽩质分⼦内的⼆硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋⽩质分⼦与SDS充分结合，形成带负电性的蛋⽩质—SDS复合物；此时，蛋⽩质分⼦上所带的负电荷量远远超过蛋⽩质分⼦原有的电荷量，掩盖了不同蛋⽩质间所带电荷上的差异。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定蛋白质分子量
(4)聚丙烯胺凝胶的生成：
四、实验步骤：
1、贮液的配制：
2、凝胶的制备： 2.1 胶板的制备： 2.2 分离胶的制备： 2.3 浓缩胶的制备：
3、蛋白样品的制备：
4、装槽、点样： 5、电泳： 6、剥胶、染色、脱色：
2.1 胶板的制备：
3、植物组织蛋白质提取：
称取大豆叶片1g放在研钵中用液氮研磨，加
第二、不连续系统中的三种物理效应：
①电荷效应：
②分子筛效应: ③浓缩效应:
三、实验材料、仪器和试剂：
1、实验材料：黄瓜叶片(芽黄叶和正常叶)
2、仪器、器皿：
(1)垂直板电泳装置
（电泳槽，玻璃板，胶条，电泳梳子，制胶架等）； (2)稳流稳压电泳仪； （4）电子天平； （6）瓷盘、微量进样器； （3）高速冷冻离心机； （5）电冰箱；
②光聚合：
催化剂是核黄素（VB2 ），在痕量氧存在下，核黄素光
解形成无色基，无色基再被氧氧化成自由基，激活单体发 生聚合。光聚合形成的凝胶孔径较大，且不稳定，适于制 备大孔径的浓缩胶。
5)聚丙烯酰胺凝胶结构上的特点：
① 聚丙烯酰胺的基本结构为丙烯酰胺单体构成的长 链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起；
⑧支持物筛孔大小：
孔径小，电泳速度慢，反之则快。
2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）
SDS-PAGE电泳的基础原理和试验步骤
SDS-PAGE电泳的基础原理和实验步骤概述十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，简称SDS-PAGE）是聚丙烯酰胺凝胶电泳中最常用的一种蛋白表达分析技术。
此项技术的原理，是根据检体中蛋白质分子量大小的不同，使其在电泳胶中分离。
在大肠杆菌表达纯化外源蛋白的实验中，SDS-PAGE更是必不可少的操作，其通常用于检测蛋白的表达情况（表达量，表达分布），以及分析目的蛋白的纯度等。
SDS-PAGE作用机理蛋白中含有很多的氨基（+）和羧基（-），不同的蛋白在不同的pH值下表现出不同的电荷，为了使蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关，我们在上样前，通常会进行一些处理（上样缓冲液）。
即在样品中加入含有SDS和β-巯基乙醇的上缓冲液。
SDS即十二烷基磺酸钠（CH3-（CH2）10-CH2OSO3-Na+），是一种阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构；β-巯基乙醇是强还原剂，它可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键。
电泳样品加入样品处理液后，经过高温处理，其目的是将SDS与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构同时使整个蛋白带上负电荷；另外样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于监控整个电泳过程；另外样品处理液中还加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以快速沉入样品凹槽底部。
当样品上样并接通两极间电流后（电泳槽的上方为负极，下方为正极），在凝胶中形成移动界面并带动凝胶中所含SDS负电荷的多肽复合物向正极推进。
样品首先通过高度多孔性的浓缩胶，使样品中所含SDS多肽复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层）。
电泳启动时，蛋白样品处于pH6.8的上层，pH8.8的分离胶层在下层，上槽为负极，下槽为正极。
出现了pH 不连续和胶孔径大小不连续：启动时Cl¯解离度大，Pro¯解离度居中，甘aaCOO¯解离度小，迁移顺序为（pH6.8）Cl¯>Pro¯>—COO¯。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE测定蛋白质分子量
02 实验材料
所需的试剂和溶液
丙烯酰胺（AA）：用于制备凝胶，是聚合反应 的单体。
甲叉双丙烯酰胺（MBA）：交联剂，增加凝胶 的交联度。
N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）：催化剂， 加速交联聚合反应。
所需的试剂和溶液
过硫酸铵（APS）
引发剂，产生自由基，引发聚合反应。
SDS
十二烷基硫酸钠，用于变性蛋白质并促使其 带负电荷。
发展新型分离技术
随着生物技术的不断发展，可以发展新型的蛋白质分离技术， 如二维电泳、毛细管电泳等，以提高蛋白质分离的分辨率和准
确性。
应用多维度分析
在后续实验中，可以将SDS-PAGE与其他蛋白质分析技术相结 合，如质谱技术、免疫学检测等，进行多维度分析，更全面地
了解蛋白质的性质和功能。
THANKS FOR WATCHING
白质带负电荷，从而在电场中向正极移动。
聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，能够根据蛋白质分子量的不同
03
对其进行分离。
蛋白质的分子量测定
通过比较标准蛋白的迁移率和已知分 子量的标准蛋白，可以大致测定出待 测蛋白质的分子量。
蛋白质的迁移率与其分子量的对数成 反比，因此可以通过计算待测蛋白与 标准蛋白的相对迁移率来推算其分子 量。
甘氨酸
作为分子量标准品。
Tris-HCl缓冲液
维持电泳过程中的pH值稳定。
所需的仪器和设备
电源
为电泳提供电力。
凝胶板
放置凝胶的框架。
垂直电泳槽
提供电泳所需的基 本结构。
移液器
精确添加试剂和溶 液。
紫外透射仪
检测蛋白质条带。
实验前的准备事项
清洗电泳槽和相关器具，确保无残留物。 准备好所需的试剂和溶液，并确保其在有效期内。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）CHANG X C[实验目的]（1）掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。
（2）SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。
[实验原理]电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。
许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。
电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。
电泳过程必须在一种支持介质中进行。
最初的支持介质是滤纸、醋酸纤维素膜和硅胶，这些介质适合于分离小分子物质，操作简单、方便。
但对于复杂的生物大分子则分离效果较差。
凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。
最初使用的凝胶是淀粉凝胶，但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。
蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE）分为“连续系统”和“不连续系统”两种电泳系统，在本实验中选用不连续系统。
“不连续系统”最大的优点在于大大提高了样品分离的分辨率。
这种电泳的主要特点是：①使用两种不同浓度的凝胶系统；②配制两种凝胶的缓冲溶液成分及pH不同，并且与电泳槽中电泳缓冲液的成分、pH也不相同。
在本实验中，电泳凝胶分为两层：上层胶为低浓度的大孔胶，称为浓缩胶或成层胶，配制此层胶的缓冲液是Tris-HCl，pH6.7；下层胶则是高浓度的小孔胶，称为分离胶或电泳胶，成胶的缓冲液是Tris-HCl，pH8.9；电泳槽中的电极缓冲液则是Tris-甘氨酸，pH8.3。
可见，凝胶浓度、成胶成分、pH与电泳缓冲系统各不相同，形成了一个不连续系统。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)实验报告一、实验目的1.学习SDS-PAGE分离蛋白质的原理；2.掌握垂直板电泳的操作方法。
二、实验原理1、电泳：(1)定义：是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。
(2)影响电泳效果的因素：①带电颗粒的大小和形状：颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快；②颗粒的电荷数：电荷越少，电泳速度越慢，反之越快；③溶液的粘度：粘度越大，电泳速度越慢，反之越快；④溶液的pH值：影响被分离物质的解离度，离等电点越近，电泳速度越慢，反之越快；⑤电场强度：电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快；⑥离子强度：离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快；⑦电渗现象：电场中，液体相对于固体支持物的相对移动；⑧支持物筛孔大小：孔径小，电泳速度慢，反之则快。
2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）(1)定义聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。
SDS-PAGE:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）(2)SDS的作用SDS是一种阴离子去垢剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。
由于SDS带有大量负电荷，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖,即消除了蛋白质分子之间电荷差异。
因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小(3) SDS-PAGE分类：¾SDS-PAGE按照缓冲液pH值和凝胶孔径差异分为连续系统和不连续系统两大类：连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统：缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度均不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳(4)聚丙烯胺凝胶的生成：聚丙烯胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳简单原理和步骤
C. 银染检测灵敏度高100-1000倍。
精选版课件ppt
8
精选版课件ppt
9
1.2ml 4.3ml 1.9ml 112ul 5ul
精选版课件ppt
5
2. 浓缩胶制备的方法
(1). 将丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体储备液 0.6ml，浓缩胶缓冲液888u1、水2ml、10 ％过硫酸铵56ul、TEMEDl0ul混合均匀后， 立即灌胶。
(2). 将预先制备好的浓缩胶慢慢地灌进狭槽中， 然后将所需的样品梳(形成加样孔)插于夹 心槽上部，并上下轻轻拉动梳子，小心地 去除粘附在梳齿顶部的小气泡，待聚合完 全后即可拔去梳子，准备电泳。
精选版课件ppt
2
二、试剂
A. 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体溶液(Acr和Bis) 称取丙烯 酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加水至100ml，过滤后存 于棕色瓶中，于4℃保存。
B. 4X分离胶缓冲液 称取Tris 18．17g，加入10%SDS贮备液 4ml，用12mol/L HCl调pH至8，8，定容至100ml。
精选版课件ppt
6
3. 样品制备及电泳
(1). 样品处理：蛋白质样品和分子量标准蛋白质在 上样电泳前均需变性。通常是将样品蛋白质溶 液与等体积的样品缓冲液混合后置于eppendorf 管中，将混合物置于95-100℃加热5分钟，立即 置于冰上，或于-20℃储存，以便再次分析时使 用。
(2). 上样：样品制备好以后，即可上样电泳。先将 样品梳子移去，用双蒸水淋洗每个样品孔，然 后在样品孔中加入电泳缓冲液，同时在电泳槽 中也加满电泳缓冲液。处理完毕后，根据实验 的需要加样电泳。
C. 4X浓缩胶缓冲液 称取Tris 6.06g，加入10%SDS 4ml，用 l2mol/L HCI调pH至6．8，定容至100ml。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)实验原理和操作步骤实验原理：SDS-PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。
该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。
SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中.SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比.在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后,电荷因素可被忽略。
蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。
试剂和器材：试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml):0。
6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10％的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1％溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。
可在4℃保存数周,或在－20℃保存数月。
2。
凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0。
8g，加重蒸水溶解后,定容到100ml。
过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月.3。
pH8。
9分离胶缓冲液：Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8。
9，定容至100ml，4℃保存。
4。
pH6.7浓缩胶缓冲液：Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml,加重蒸水80ml使其溶解，调pH6。
7，定容至100ml，4℃保存.5。
TEMED（四乙基乙二胺）原液6.10%过硫酸铵(用重蒸水新鲜配制）7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8。
3后，用蒸馏水定容至1000ml。
置4℃保存，临用前稀释10倍。
8. 考马斯亮蓝G250染色液:称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7。
5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml,搅拌1小时,小孔滤纸过滤。
器材：电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。
实验操作（一）样品制备将蛋白质样品与5X样品缓冲液（20ul＋5ul)在一个Eppendorf 管中混合。
SDS-PAGE电泳实验步骤
垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质一、实验目得学习ＳDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法(ＳDS—ＰAGＥ)测定蛋白质得分子量得原理与基本操作技术、二、实验原理蛋白质就是两性电解质,在一定得ｐH条件下解离而带电荷。
当溶液得pH大于蛋白质得等电点(pＩ)时,蛋白质本身带负电,在电场中将向正极移动;当溶液得pH小于蛋白质得等电点时,蛋白质带正电,在电场中将向负极移动;蛋白质在特定电场中移动得速度取决于其本身所带得净电荷得多少、蛋白质颗粒得大小与分子形状、电场强度等。
聚丙烯酰胺凝胶就是由一定量得丙烯酰胺与双丙烯酰胺聚合而成得三维网状孔结构、本实验采用不连续凝胶系统,调整双丙烯酰胺用量得多少,可制成不同孔径得两层凝胶;这样,当含有不同分子量得蛋白质溶液通过这两层凝胶时,受阻滞得程度不同而表现出不同得迁移率。
由于上层胶得孔径较大,不同大小得蛋白质分子在通过大孔胶时,受到得阻滞基本相同,因此以相同得速率移动;当进入小孔胶时,分子量大得蛋白质移动速度减慢,因而在两层凝胶得界面处,样品被压缩成很窄得区带。
这就就是常说得浓缩效应与分子筛效应。
同时,在制备上层胶(浓缩胶)与下层胶(分离胶)时,采用两种缓冲体系;上层胶ｐＨ=6、7—6。
8,下层胶pH=8.9;Tris—HCＩ缓冲液中得Triｓ用于维持溶液得电中性及pＨ,就是缓冲配对离子;ＣI－就是前导离子。
在pH6.８时,缓冲液中得Gly—为尾随离子,而在pH＝8、９时,Gly得解离度增加;这样浓缩胶与分离胶之间ｐH得不连续性,控制了慢离子得解离度,进而达到控制其有效迁移率之目得。
不同蛋白质具有不同得等电点,在进入分离胶后,各种蛋白质由于所带得静电荷不同,而有不同得迁移率、由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在得浓缩效应,分子筛效应及电荷效应,使不同得蛋白质在同一电场中达到有效得分离。
如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度得十二烷基硫酸钠(SDS),由于SDＳ带有大量得负电荷,且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性,特别就是在强还原剂如巯基乙醇存在下,蛋白质分子内得二硫键被还原,肽链完全伸展,使蛋白质分子与SDS充分结合,形成带负电性得蛋白质—SDS复合物;此时,蛋白质分子上所带得负电荷量远远超过蛋白质分子原有得电荷量,掩盖了不同蛋白质间所带电荷上得差异、蛋白质分子量愈小,在电场中移动得愈快;反之,愈慢。
SDS-PAGE原理、方法详解
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）一、材料准备（1）丙烯酰胺单体（Arc）：在交联剂作用下形成聚丙烯酰胺（2）N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）：交联剂（3）10%十二烷基硫酸钠（SDS）：阴离子去污剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。
由于SDS带有大量负电荷，当与蛋白质形成复合物后好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖，即消除了蛋白质分子之间电荷差异。
配制方法：10g SDS，用双蒸水溶解并定容至100ml，室温保存。
（4）10%过硫酸铵（Ap）：引发剂。
配制方法：0.1 g过硫酸铵溶解于1ml双蒸水中。
过硫酸铵会缓慢分解，应新鲜配制。
（5）N、N、N’、N’－四甲基乙二胺（TEMED）：其碱基催化AP产生氧自由基，激活单体形成自由基，发生聚合。
配制方法：原液使用。
应使用电泳级TEMED。
（6）30%丙烯酰胺凝胶贮液（Arc-Bis贮液）配制方法（50mL体系）：14.55 g丙烯酰胺＋0.45 g N，N-甲叉双丙烯酰胺，先用40ml双蒸水溶解，搅拌，直到溶液变成透明，再用双蒸水稀释至50 ml，0.45μm滤膜过滤。
用棕色瓶储存于4℃（丙烯酰胺单体贮液在储存过程中因光和碱催化发生脱氨反应，会缓慢转化成丙烯酸和双丙烯酸，储存液应测定pH值不超过7.0。
丙烯酰胺单体贮液应在暗色瓶中保存，每隔数月须重新配制。
丙烯酰胺具有很强的神经毒性和致癌性，并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。
称量时必须戴手套和面具。
）（7）分离胶缓冲液（pH8.8的Tris-HCl缓冲液）：1.5M Tris-HCl，pH8.8。
配制方法：9.08 g Tris溶解在40ml 双蒸水中，用4 mol/L盐酸调节pH值8.8，再用双蒸水加至50ml。
4℃保存。
（8）浓缩胶缓冲液（pH6.7的Tris-HCl缓冲液）：1.0M Tris-HCl，pH6.8。
配制方法：6.06 g Tris溶解在40 ml双蒸水中，用4 mol/L盐酸调节pH值6.8，再用双蒸水加至50 ml。
聚丙烯酰胺凝胶电泳技术原理
[1] [2] [3]
西安市西部大学城陕西师范大学烯酰胺凝胶电泳技术的原理
SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳根据带电颗粒在电场 中泳动的电荷效应，分子筛效应（聚丙烯酰胺凝胶为网状结构， 具有分子筛效应）和浓缩效应来达到分离蛋白质和寡居核苷 酸的目的。[1]
◇电荷效应：
蛋白质带负电荷，在电场中从阴极到阳极泳动。
阴极
阳极
◇分子筛效应：
◇浓缩效应：
浓缩胶（堆积作用）
分离胶（分离作用）
凝胶浓度较小，孔径较大，把较 稀的样品加在浓缩胶上，经过大 孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至 一个狭窄的区带。当样品液和浓 缩胶选pH6.8的TRIS/HCl缓冲液， 电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开 始后，HCl解离成氯离子，甘氨 酸解离出少量的甘氨酸根离子。 和蛋白质一起向正极移动，其中 氯离子最快，甘氨酸根离子最慢， 蛋白居中。电泳开始时氯离子泳 动率最大，超过蛋白，因此在后 面形成低电导区，而电场强度与 低电导区成反比，因而产生较高 的电场强度，使蛋白和甘氨酸根 离子迅速移动，形成以稳定的界 面，使蛋白聚集在移动界面附近， 浓缩成一中间层。[3] 最后经过 分离胶分离开来。
聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。 SDS-PAGE仅根据
蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质 。因为:
SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内 和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二、三级结 构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的 二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚 成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所 带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分 子间的电荷差异和结构差异。[2]
蛋白质相对分子质量的测定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
蛋白质相对分子质量的测定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法一、实验目的1、学会SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法原理。
2、掌握用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量的操作技术。
二、实验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。
该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。
SDS与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。
SDS-蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。
由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。
SDS-PAGE因易于操作和广泛的用途，使它成为许多研究领域中一种重要的分析技术。
Acr和bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但在具有自由基团体系时就能聚合。
引发自由基的方法有化学法和光化学法两种。
化学法的引发剂是过硫酸铵（Ap），催化剂十四甲基乙二胺（TEMED）；光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸铵，在紫外光照射下引发自由基团。
采用不同浓度的acr、bis、Ap、TEMED使之聚合，产生不同孔径的凝胶。
因此可按分离物质的大小、形状来选择凝胶浓度。
SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。
三、实验器材及数据30%分离胶储存液、10%浓缩胶储存液、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、电泳缓冲液、样品溶解液、染色液、脱色液；标准蛋白，样品蛋白；电泳槽，移液管1ml，烧杯100ml四、注意事项1、acr和bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时应戴口罩和手套，纯化应在通风处内进行。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS－聚丙烯酰胺凝胶 电泳分离血清蛋白质
一、பைடு நூலகம்的要求
1.学习电泳原理和技术
2.掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的工作原
理和操作方法
二、实验原理
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联
剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺 (TEMED)和催化剂过硫酸铵((NH4)2S2O8 ，AP) 的作用 下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支
持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。
TEMED(加速剂)
Acr(单体)+Bis(交联剂)
AP(催化剂)
凝胶
聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有 电荷效应、分子筛效应。
电荷效应（电泳物所带电荷的差异性） 分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的 大小形状不同所致） PAGE同时还具有浓缩效应与体系的不连续性。
四、 操作步骤
固定玻板
制备分离胶 制备浓缩胶 加样 电泳
染色和脱色
1.安装夹心式垂直板电泳槽
安装好后，在长玻璃板下端与硅胶模框
交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂糖。其目 的是封住空隙，凝固后的琼脂糖中应避免有 气泡。
2、配制凝胶
7.5%分离胶 （10ml） DDW 30%Acr-Bis 4.85 2.5 3%浓缩胶 （5ml） 3.16 0.5
6 .染色与脱色
电泳结束后，取下凝胶模，卸下胶框，用小 刀或镊子撬开短玻璃板，从凝胶板上切下左上 角作为加样标记。加入染色液染色1-2 h，再用 脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰。
将楔子插进，将底部插紧
插入梳子
加缓冲液
加 样
电泳
剥胶
五、实验结果
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
一,实验目的 掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电 聚丙烯酰胺凝胶电 掌握 泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE , )的工作原理和操作方法
二,实验原理 不同蛋白质具有不同的分子量, 不同蛋白质具有不同的分子量,并在 一定的pH溶液中带有不同的电荷 溶液中带有不同的电荷. 一定的 溶液中带有不同的电荷.但 经过SDS处理后的蛋白质,分子表面 处理后的蛋白质, 经过 处理后的蛋白质 完全被负电荷所覆盖,因此在电泳时, 完全被负电荷所覆盖,因此在电泳时, 电泳迁移率近取决于蛋白质的分子量 大小而与其所带电荷的性质无关. 大小而与其所带电荷的性质无关.
6. 上样:将样品梳拔出,用电极缓冲液 上样:将样品梳拔出, 冲洗样品孔. 冲洗样品孔.样品与样品缓冲液按一 定比例混合好. 定比例混合好.用微量注射器加入加 样孔,加样量为20l. 样孔,加样量为 . 7.电泳:100V恒压电泳至溴酚蓝指示剂达 电泳: 电泳 恒压电泳至溴酚蓝指示剂达 到浓缩胶和分离胶界面, 到浓缩胶和分离胶界面,然后调电压 至120V,再恒压电泳,约1.5 h,待染 ,再恒压电泳, , 料前沿的溴酚蓝迁移至凝胶的底部, 料前沿的溴酚蓝迁移至凝胶的底部, 停止电泳.取下胶板, 停止电泳.取下胶板,将胶片置于白 瓷盘内. 瓷盘内.
4. 制备浓缩胶:待胶凝固后(胶与水之间有 制备浓缩胶:待胶凝固后( 一清晰界面), 将水倒掉, 一清晰界面), 将水倒掉,用ddH2O冲 冲 洗胶面,滤纸将水吸干净.配制好浓缩胶. 洗胶面,滤纸将水吸干净.配制好浓缩胶. 倒入浓缩胶插好样品梳, 倒入浓缩胶插好样品梳,注意避免气泡滞 留在梳子与胶液的界面, 放置约15 留在梳子与胶液的界面,30 ℃放置约 min,直至使浓缩胶凝固. ,直至使浓缩胶凝固. 5. 电泳:将胶模装好,去胶条后,装入电泳 电泳:将胶模装好,去胶条后, 槽中,检查是否漏液后,倒入电泳缓冲液, 槽中,检查是否漏液后,倒入电泳缓冲液, 胶模内侧的液面没过矮板但不可超过高板 矮板在内). (矮板在内).
(完整版)SDS-PAGE原理步骤详细介绍含图片
一、SDS-PAGE的基本原理
（一）蛋白质分子的解聚 样品介质和聚丙烯酰胺中加入离子
去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的 电泳迁移率主要取决于亚基分子量的 大小，而电荷因素可以被忽略
1、SDS
阴离子去污剂 变性剂 助溶性试剂
断裂分子内和分子间的氢键 分子去折叠 破坏蛋白质分子的二级和三级结构
2、强还原剂 巯基乙醇（β-mercaptoethanal）
下的反应： 蛋白质本身的电荷被屏蔽 氢键断裂 疏水相互作用被取消 多肽被去折叠(二级结构破坏),并形成椭球型
①还原SDS处理 当加入还原试剂DTT或β-二巯基乙醇后，
蛋白质被完全去折叠，只根据分子量分离
②带有烷基化作用的还原SDS处理 烷基化作用可以很好地并经久牢固地保护
SH基团，而得到窄的电泳带
3、影响SDS电泳的关键因素 （1） 溶液中SDS单体浓度 大多数蛋白质与SDS结合的重量比 为1：1.4 （2） 样品缓冲液的离子强度 低离子强度的溶液中，SDS单体才 具有较高的平衡浓度
（3） 二硫键是否完全被还原 当二硫键被彻底还原后，蛋白质分
子才能被解聚，SDS才能定量地结合 到亚基上而给出相对迁移率和分子量 对数的线性关系。
蛋白带迁移距离 Rf= ————————
溴酚蓝迁移距离
蛋白带迁移距离 固定前的凝胶长度 Rf= ————————— X —————————
干燥后的凝胶长度 溴酚蓝迁移距离
2、作图 以已知蛋白质分子量的常用对数值为纵坐
标，Rf为横坐标绘图
3、通过测定未知蛋白质的Rf值，便可在标 准曲线上读出他的分子量
二、去污剂的选择 无离子去污剂：Lubro W；Brij35， Tween Triton 阳离子去污剂：cetyltrimethyl ammonium bromide （CTAB） cetylpyyridinium （CPC） 阴离子去污剂：SDS deoxychol理方式的不同
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳SDSPAGE实验原理和操作步骤
S D S聚丙烯酰胺凝胶电泳S D S P A G E实验原理和操作步骤The pony was revised in January 2021SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤实验原理：SDS-PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。
该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。
SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。
SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。
在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略。
蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。
试剂和器材：试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。
可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。
2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。
过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。
3. pH8.9分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml，4℃保存。
4. pH6.7浓缩胶缓冲液： Tris5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH6.7，定容至100ml，4℃保存。
5. TEMED（四乙基乙二胺）原液6.10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。
置4℃保存，临用前稀释10倍。
8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。
sds-page原理
sds-page原理
SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）是一种常用的蛋白质分离
和纯化技术。
其原理基于蛋白质在电场中的迁移速度与其分子量成反比的特性。
首先，将待测蛋白质样品经过还原剂（如巯基乙醇）和SDS （十二烷基硫酸钠）处理，使蛋白质在溶液中全部变成带负电荷的复合物。
SDS具有两个主要功能：一是在蛋白质分子表
面均匀地吸附SDS分子，使蛋白质带有大量负电荷；二是通
过SDS分子的疏水尾部与蛋白质间的相互作用，使蛋白质变
为线性构象。
然后，将经过处理的样品加入含有聚丙烯酰胺的凝胶电泳胶质中。
聚丙烯酰胺经过电极电解质反应形成网状物质，构成凝胶。
聚丙烯酰胺凝胶可以形成一系列孔隙，这些孔隙可以按照分子量的大小分离蛋白质。
在电泳进行时，电场的作用下，带负电的蛋白质复合物会向着电极迁移，迁移的速度与蛋白质分子量成反比。
较小分子量的蛋白质移动速度相对较快，而较大分子量的蛋白质移动速度相对较慢。
因此，蛋白质在凝胶中的分离程度与其分子量有关。
在电泳完成后，可以通过染色（如银染、荧光染等）或利用特定的蛋白质探针（如抗体或荧光标记探针）来检测和可视化分离的蛋白质。
然后，可以根据蛋白质的迁移距离和已知分子量蛋白质的迁移距离之间的关系推断待测蛋白质的分子量。
总之，SDS-PAGE通过利用电场迁移速度与蛋白质分子量之间的关系，实现了对蛋白质样品的分离与纯化。
它是一种简便、快速且广泛应用的分析方法，在生物学和生物化学领域中具有重要作用。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理及步骤
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳目的要求（1）学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。
（2）掌握SDS-PAGE测定蛋白质分子量的操作方法。
原理SDS-PAGE是PAGE是一种特殊形式，SDS是带负电荷的阴离子去污剂。
用SDS-PAGE 测定蛋白质分子量时，蛋白质需经样品溶解液处理。
在样品溶解液中含有巯基乙醇及SDS，各种蛋白质样品在巯基乙醇作用下，还原成单链，再进一步与SDS结合形成带大量负电荷的SDS-蛋白质复合物。
因此各种蛋白质分子在SDS-PAGE中，只能按其分子量大小而分离。
SDS-PAGE有连续体系（b）及不连续体系两种(d)，这两种体系有各自的样品溶解液及缓冲液，但加样方式，电泳过程及固定、染色与脱色方法完全相同。
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳。
这种凝胶是以丙烯酰胺单体（Acrylamide，简写为Acr）和交联剂N，N'-甲叉双丙烯酰胺（N,N'-Methylena Bisacrylamide，简写为Bis）在催化剂的作用下聚合而成的。
Acr 和Bis 在它们单独存在或混合在一起时是稳定的，且具有神经毒性，操作时应避免接触皮肤。
但在具有自由基团体系时，它们聚合。
引发产生自由基团的方法有两种，即化学法和光化学法。
化学聚合的引发剂是过硫酸铵(NH4)2S2O3（Ammonium persulfate，简写为Ap），催化剂是N，N，N',N'-四甲基乙二胺（Tetramethylenediamine，简写为TEMED）。
在催化剂TEMED的作用下，由过硫酸铵（Ap）形成的自由基又使单体形成自由基，从而引起聚合作用。
TEMED 在低pH 时失效，会使聚合作用延迟；冷却也可使聚合速度变慢；一些金属抑制聚合；分子氧阻止链的延长，防碍聚合作用。
这些因素在实际操作时都应予以控制。
光聚合以光敏感物核黄素（即V B2）作为催化剂，在痕量氧存在下，核黄素经光解形成无色基，无色基被氧再氧化成自由基，从而引起聚合作用。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实
验原理和操作步骤
实验原理：
SDS-PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。
该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。
SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。
SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。
在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略。
蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。
试剂和器材：
试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml 蒸馏水。
可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。
2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。
过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。
3. pH8.9分离胶缓冲液：Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml，4
℃保存。
4. pH6.7浓缩胶缓冲液：Tris
5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH
6.7，定容至100ml，4℃保存。
5. TEMED（四乙基乙二胺）原液
6.10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）
7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。
置4℃保存，临用前稀释10倍。
8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。
器材：电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。
实验操作
（一）样品制备
将蛋白质样品与5X样品缓冲液（20ul＋5ul）在一个Eppendorf 管中混合。
放入100℃加热5－10min，取上清点样。
（二）分离胶及浓缩胶的制备1 将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用ddH2O 冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干；
2 将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，按照Bio-Rad Mini Ⅱ/Ⅲ说明书提示装好玻璃板；
3 按如下体积配制10％分离胶8.0 ml，混匀；
ddH2O 3.0 ml
1.0 mol/LTris-HCl pH=8.8
2.1 ml
30% Acr-Bis 2.8 ml
10% SDS 80 ul
10%AP 56 ul
TEMED 6 ul
4 向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约20 min后胶即可聚合；
5 按如下体积配制6％浓缩胶3.0 ml，混匀；ddH2O 1.0 mol/LTris-HCl pH=6.8 30% Acr-Bis
2.0 ml 400 ul 600 ul
10% SDS 10% AP TEMED
36ul 24ul 4ul
6 将上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳；
7 装好电泳系统，加入电极缓冲液，上样20 μl;
8 稳压200V，溴酚蓝刚跑出分离胶时，停止电泳，约需45 min～1hr.
9 卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色1～2 hr；加入脱色液，置于80 rpm脱色摇床上,每20 min更换一次脱色液（10 ml 冰乙酸；45 ml乙醇；45 ml蒸馏水）至完全脱净。
如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！。