075第五章电镜样品的制备
电镜生物样品制备技术
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四、脱水
要求：不改变样品的体积和表面积的情况 下，去除样品中的水份。
常用的脱水剂：乙醇、丙酮 方法：梯度脱水 时间：视样品大小而定 注意事项：避免裸露，夹伤
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五、干燥
目的：去除样品中的脱水剂
方法：空气干燥法、冷冻干燥法、 叔丁醇干燥法、临界点干燥法等
常用干燥法：叔丁醇干燥法、临界点干燥法
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A B
SEM觀察苗木下表皮氣孔分 佈及葉部組織之微細構造 A：氣孔密度(橫線=120mm) B：氣孔形態(橫線=12mm) C：葉組織(橫線=120mm)
注意事项： 在保证不破坏观察面的条件下，充分暴露观察面 不要损伤观察面或者使样品膨胀、收缩等 不要将样品裸露在空间，防止样品皱缩变型
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清洗液的选择
一般组织：等渗生理盐水 游离组织细胞：缓冲液、等张液 表面覆有大量黏液的组织（如胃肠粘膜）：
低浓度蛋白水解酶 组织培养细胞：组织培养液 特殊样品：特殊洗液（如生药表面的蜡质，
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一、 取 材
要 点： 确定观察样品的目标
要求及注意事项：
做好充分准备（试剂、仪器、器械等）
保护观察面，作好标记
速度要快 ，每次取材数量不宜过多 大小要合适 10 × 10 × 5毫米 避免拉割、挤压
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二、清洗
目的：去除观察面的杂质，充分暴露观察面
方法：物理方法: 漂洗、换洗、加压冲洗、振荡超声。 化学方法: 用酶消化法
第五章 扫描电镜生物样 品制备技术
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1
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第一节 常规生物样品SEM 制备技术
关于透射电镜和扫描电镜等的样品制备
制作载网的材料大多是铜，因此习惯上将载网 称为铜网，不过制作载网的材料还可以是金、 银、镍、铝、铂及尼龙。载网的大小随电镜的 需要而不同，一般直径为3mm。网孔的形状有 圆形、方形、单孔形等，网孔有50、100、200、 300及400目等多种规格。常用一般普通组织超 薄切片选用200-300目的载网，对于过小的和过 碎的样品，可选用400目的载网；对于不易查 找的样品，可选用带字母标记的载网。
对复型材料的主要要求： ①复型材料本身必须是“无结构”或非 晶态的； ②有足够的强度和刚度，良好的导电、 导热和耐电子束轰击性能。
复型的种类
按复型的制备方法，复型主要分为： 一级复型 二级复型
萃取复型（半直接样品）
碳一级复型
（1）用常规方法将试样的表面抛光、腐蚀，其腐蚀深 度较一般金相腐蚀略深。断口最好为新鲜断口。 （2）在真空镀膜仪中将试样表面喷镀一层碳膜，厚度 控制在10~20nm。 （3）用刀片或针尖将碳膜表面划成3×3mm的小方块。 （4）将试样在专用的电解液中进行电解。当碳膜的边 角翘起或有个别碳膜脱落时，取出试样并放到无水乙 醇溶液中轻轻晃动，使碳膜脱落。 （5）再用无水乙醇或水将碳膜轻轻漂洗2~3次，再在 溶液中停留几分钟，将电解液彻底清除干净。 （6）用铜网捞出晾干即可。
Formvar支持膜的制备
在使用之前，新网和旧网都需要进行清洗，清洗 的目的除了使载网清洁之外，还有除去载网的静 电以便捞片的作用。对于新的载网，直接用95％ 的乙醇浸泡一下，再用重蒸水冲洗后自然晾干即 可。旧载网的清洗方法有以下两种：
氯仿法：把旧网放入锥形瓶中，用氯仿浸泡若干 天，经常晃动帮助残存的样品从载网上脱落，接 着用重蒸水冲洗数次，再用100％乙醇洗一次后， 放在垫有滤纸的培养皿中自然晾干。
电镜样品制备流程图
组织处理机
化学固定 / 脱水
临界点干燥仪
SEM图像分析 镀膜仪
扫描电子显微镜
Leica EM Workflows
Leica CLEM Workflow Solution
From Eye to Insight
制样流程 – 常温TEM（生物）
高压冷冻-冷冻替代流程
高 压冷 冻
冷冻替代仪
修块机
超薄切片机 TEM图像分析 玻璃制刀机
组织处理机
将样品树脂包埋块修成金 字塔形，便于超薄切片
修块机
超薄切片机
TEM图像分析
玻璃刀用于修块及常规切片
玻璃制刀机
染色机 透射电子显微镜
Leica EM Workflows
Leica CLEM Workflow Solution
From Eye to Insight
制样流程 – 常温SEM（生物）
TEM图像分析
多功能离子减薄仪 TEM样品离子束减薄
透射电子显微镜
Leica EM Workflows
From Eye to Insight
From Eye to Insight
Leica EM Workflows
透射电子显微镜
Leica EM Workflows
Leica CLEM Workflow Solution
From Eye to Insight
制样流程 – SEM分析，利用离子束切割/研磨技术（固体材料样品）
精研一体机
样品预处理
离子束切割/离子束抛光 （用于大样品）
SEM图像分析
镀膜
扫描电子显微镜
精研一体机 样品预抛光 面积< 40mm²
离子束抛光
电镜样品制备 临床医学考试微生物备考
电镜样品制备临床医学考试微生物备考为了帮助参加临床医学试的考生顺利复习，跨考考研整理了相关知识，供大家参考，希望可以帮助广大考生顺利通过考试!电镜样品制备用电子显微镜观察的样品也要经过认真细致的处理，以至于今天出现了一门非常有用的技术科学—电子显微镜学。
电子显微镜观察样品的方法很多，基本上可以分为透射型和扫描型两类。
前者是电子流通过观察样品而形成图象;后者则是用来观察微生物的表面细节，分辨率大约在7纳米左右。
待观察的样品则必须进行相当复杂的处理，而且有些处理方法是和用光学显微镜观察时很不相同的，因为在进行电子显微镜观察时受到一些特殊限制。
首先，由于样品处于高真空环境中，样品必须尽可能保持原状，所以微生物样品要进行固定和脱水处理;第二，要使电子束全部透过样品，所以样品必须尽可能薄;第三，为了便于观察，图象的反差要大，光学显微镜是靠光的吸收差异来达到，而电子显微镜则靠电子散射程度，决定电子散射程度的是元素的质量和厚度，为此常用重金属处理，例如金、铂等处理。
投射电子显微镜的观察样品的主要制备方法是：1、投影法。
在真空条件下，用电子散射能力强的重金属原子来喷镀样品表面，这样在样品和没有喷镀的区域形成了较强的反差，而没有喷镀的部分成了样品的投影，根据投影我们可以了解样品的立体形状、高度，通常用这种方法来观察细菌的鞭毛或病毒的颗粒。
2、负染法。
因为这种方法是将样品的背景染色以突显样品，所以称为负染。
一般是用电子密度高，本身不会显示任何结构，又和样品不起反应的物质，例如磷钨酸的钠盐将样品包围，同时染色剂还会投入观察对象的内部，这样，既能显示外形，又可在一定程度上反应样品的内部结构。
用这种方法可以观察细菌细胞、病毒等。
3、超薄切片法。
这是最常用的方法，因为可以观察细胞或其它样品内部的细微结构。
通常是要按照一定程序对样品进行固定，脱水，然后包埋在树脂中作为支持物，用超薄切片机切成极薄的切片。
因为只有在20—100纳米厚度的切片用投射电子显微镜才能观察，所以一般细菌样品，一个细胞要分割成10片到50片。
电镜样本制备原理
电镜样本制备原理
1.固定：将取下的组织块及时投入
2.5%戊二醛固定液中，以固定细胞的形态。
这一步非常重要，因为固定液可以迅速凝固组织中的蛋白质和核酸，从而保持细胞的原有结构和功能。
2.脱水：将固定好的组织块进行脱水处理，通常使用乙醇或丙酮进行脱水。
脱水可以使组织块变硬，以便于进行后续的包埋和切片操作。
3.包埋：将脱水后的组织块放入包埋剂中，经过加热等处理后，使包埋剂凝固，将组织块固定在其中。
包埋剂的硬度适中，可以确保切片时能够切出较薄的样品。
4.切片：使用超薄切片机将包埋的组织块切成薄片，通常厚度在40-50纳米之间。
切片的厚度和质量对于后续的观察和鉴定非常重要，因此需要非常精细的操作。
5.染色：将切好的薄片放在载玻片上，用染色液进行染色，以增强细胞的对比度和结构细节的可见度。
这一步是为了使细胞的结构更加清晰，以便于在电镜下观察。
6.电镜观察：将染色后的薄片放入电镜中观察，可以使用透射电镜或扫描电镜进行观察。
在电镜下，可以观察到细胞的超微结构和细节，如细胞膜、细胞器、细胞核等。
总的来说，电镜样本制备原理需要经过多个步骤，每个步骤都需要严格的操作和质量控制，以确保最终观察到的细胞结构和功能的准确性。
电镜样品制备
透射电镜细胞样品制备技术和观察方法(一)原理透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)是利用阴极发射的电子，通过阳极中央的微孔形成的电子束穿透样品获得样品的电子信号，经物镜、中间镜和投影镜等多级电子放大至数百至数千万倍，最后成像在荧光屏上便可即时观察，或是投射到照相底片感光片上作为永久记录。
由于标本必须置于高真空中进行电镜观察，所以电镜观察的生物标本必须特殊制备，不能含水，离体的生物标本要迅速加以固定，以防产生结构改变。
另外，电子的穿透力很弱，这就需要把样品制成50nm～100nm厚的超薄切片(一个细胞切成100～200片)。
为了使柔软的生物组织能够制成这样薄的切片，并使切片耐受高真空和电子轰击，所以在切片前要进行包埋。
超薄切片技术是透射电镜观察成功的关键。
超薄切片制作样品过程大体分为取材、固定、漂洗、脱水、渗透包埋与聚合、切片、染色等。
细胞超薄切片技术中如何把细胞完整无损地从培养瓶皿壁上包埋下来是最大的难题。
新的定型产品无菌聚苯乙烯塑料薄膜的使用解决了这个难题，把薄膜放在培养瓶皿中，让细胞直接长在塑料薄膜上，不仅细胞生长效果好，而且可与细胞一起包埋切片，省去了许多麻烦。
(二)超薄切片基本操作步骤试剂和器具准备：（1）0.2 mol/L PBSA液：磷酸氢二钠（Na2HPO4·2H2O）35.61g加双蒸水溶解至1000ml。
B液：磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）31.21g加双蒸水溶解至1000ml。
（2）2.5%戊二醛（C5H8O2）固定液：25%戊二醛10ml，0.2mol/L PBS 50ml，加双蒸水40ml。
（3）1%四氧化锇（OsO4）固定液1）2%储存液：取1g OsO4 安瓿泡酸48h，冲洗48h，双蒸水漂洗30mins。
干后用玻璃刀刻划1或2道痕，置入棕色磨口瓶，加双蒸水50ml，用力摇动使安瓿破碎。
静止48h OsO4溶解后备用。
电镜样品制备
）、固定 （二）、固定
固定目的：为了在处理和观察样品过程中， 固定目的：为了在处理和观察样品过程中， 样品的原有形态变化最小。 使样品的原有形态变化最小。 常用固定剂： 常用固定剂： 戊二醛 四氧化锇 甲 醛
O H C CH2 CH2 CH2 C O H
OsO4 O H C H
电镜常用双固定的方法。 电镜常用双固定的方法。
电镜生物样品制备
赵翔 细胞生物
一 、透射电镜样品制备
透射电镜照片
透射电镜样品制备
取材 固定 脱水 包埋 切片 染色
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
（一）取材
快、小、准
超微结构对缺血缺氧敏感，在缺 超微结构对缺血缺氧敏感， 血缺氧几分钟后就会有明显变化，因 血缺氧几分钟后就会有明显变化， 此要求取材速度很快，一般在1分钟 此要求取材速度很快，一般在1 内进入固定液。 内进入固定液。 固定剂渗透能力有限， 要求样品 固定剂渗透能力有限 ， 一定要小。一般在１mm3 左右。 一定要小。一般在１ 左右。
（四）、干燥水滴 ）、干燥
临界点干燥法
液体和气体是分子的不同聚集 状态， 状态，温度和压力可改变其聚集状 临界点干燥法是利用物质的临 态。临界点干燥法是利用物质的临 界状态这一物理性质来完成干燥的。 界状态这一物理性质来完成干燥的。
气体的压强—密度等温曲线
P P d
a O
理想气体
b
ρ
P= RT
（五）、镀膜
扫描电镜是电子束在样品上扫 样品必须导电。 描 ， 样品必须导电 。 使生物样品导 的办法是在其上覆盖一层金属膜， 的办法是在其上覆盖一层金属膜 ， 这种方法叫镀膜。 这种方法叫镀膜。 同时金属二次电子产率高， 同时金属二次电子产率高 ， 可 以提高样品的反差。 以提高样品的反差 。 常用的金属有 (Au)和铂(Pt)。 和铂(Pt) 金(Au)和铂(Pt)。
电镜样品制备
电子显微镜样品的制备一、透射电镜样品超薄切片常规制作规程1．取材：根据实验目的取材，要求部位准确，体积小于2mm32．醛类固定：用2%-3%的戊二醛固定2小时；3．清洗：用磷酸缓冲液清洗3次，每次10min；4．锇酸固定：用1%-2%的锇酸固定2~3小时；5．清洗：用磷酸缓冲液清洗3次，每次10 min；6．脱水：用50%、70%、80%、90%乙醇梯度脱水各15min，再用100%乙醇脱水3次，每次30min；7．置换：用环氧丙烷或丙酮置换3次，每次30min;8.浸渍：10hr以上，浸渍过程如下：①丙酮：包埋剂=3：1的浸渍液浸渍（动物样品1hr，植物样品2~3hr）；②丙酮：包埋剂=1：1的浸渍液浸渍（动物样品1hr，植物样品2~3hr）；③丙酮：包埋剂=1：3的浸渍液浸渍（动物样品4hr，植物样品12~24hr）；④纯包埋剂浸渍（动物样品4hr，植物样品12~24hr）；9．包埋：将样品放入xx包埋剂的包埋板中；包埋剂配方中Epon812，MNA，DDSA，DMP-30的比例见附表10．聚合：将包埋板置于40C、60℃条件下各聚合48hr；11．修块：将包埋头修成梯形，且样品表面积小于0.2mm×0.2mm12．超薄切片：切片厚度50-90nm13．染色：铀染色5~15min清洗铅染色5~10min清洗二、扫描电镜样品常规制备规程1．取材：根据实验目的取材，要求部位准确2．清洗：用磷酸缓冲液反复清洗样品表面的灰尘、杂质等附着物3．固定：用2%-3%的戊二醛固定2小时4．清洗：用磷酸缓冲液清洗3次，每次10 min5．脱水：用50%、70%、80%、90%乙醇梯度脱水各15min，再用100%乙醇脱水3次，每次30min；6．置换：用叔丁醇置换3次，每次30min7．干燥：用xx仪干燥样品8．粘样：用双面胶带将样品粘到样品台上9．镀膜：用离子溅射仪给样品镀10nm金膜（二）电镜样品制备技术电镜样品制备技术较复杂，种类也较多，分为普通样品制备技术和特殊样品制备技术。
电镜样品制备标准方法
电镜样品制备标准方法
试剂
0.2 mol/ L磷酸盐缓冲液，pH 7.2
甲液：
Na2HPO4·2H2O 35.61 g 或Na2HPO4·12H2O 71.64 g
加双蒸水到1000 mL
乙液：
NaH2PO4·H2O 27.60 g 或NaH2PO4·2H2O 31.21 g
加双蒸水到1000 mL
甲液360 mL
乙液140 mL
0.1 mol/ L磷酸盐缓冲液（PBS工作液，pH 7.2）
0.2 mol/ L磷酸盐缓冲液250 mL
加双蒸水到500 mL
2.5 % 戊二醛固定液
25 %（m/v）戊二醛水溶液10 mL
0.2 mol/ L磷酸盐缓冲液，pH 7.2 50 mL
加双蒸水到40 mL
实验流程
一．取材与固定
单层培养细胞或悬浮培养细胞样品
1.3000 rpm离心5 min，收集细胞样品，尽量多的吸弃培养液上清（注意若是
贴壁细胞请用胰酶消化细胞）。
2.加入4℃预冷PBS液，充分吹吸混匀，静置4 min，3000 rpm离心5 min，吸
弃上清。
3.重复步骤2两次。
4.加入预冷的血清，充分吹吸混匀，3000 rpm离心10 min，吸弃大部分上清，
留少部分（大约3-5mm），吹吸悬浮沉淀细胞。
（或离心后吸弃上清，留少部分上清，不悬浮沉淀细胞，视样品浓度而定）
5.沿着EP管壁缓慢加入戊二醛固定液，小心放入4℃冰箱，固定过夜。
电镜样品的制备
切片
总结词
切片是将包埋后的样品切成薄片，以 便于电镜观察。
详细描述
切片时应选择合适的刀具和切片厚度， 以保证切片的完整性和均匀性。切片 后应进行修整和染色处理，以提高观 察效果。
染色
总结词
染色是为了增强样品的对比度，以便于电镜观察和拍照记录。
05 电镜样品制备的常见问题 及解决方案
样品固定不充分
总结词
样品固定是电镜样品制备过程中的关键步骤，如果固定不充分，会导致样品在电镜观察时发生形变或 溶解。
详细描述
在固定过程中，应选择适当的固定剂，如戊二醛或锇酸，并确保样品在固定剂中充分浸泡。对于不易 固定的样品，可以采用预固定或二次固定反复清洗样品，以去 除固定液和其他杂质。
脱水操作示例
脱水剂选择
选择适当的脱水剂，如乙醇、丙 酮等，根据脱水剂的浓度和脱水
时间进行操作。
脱水方法
将清洗后的样品放入脱水剂中，逐 渐增加脱水剂的浓度，并在适宜的 温度下进行脱水。
清洗
脱水完成后，用适量的缓冲液清洗 样品，以去除脱水剂和其他杂质。
取样工具
使用锋利的刀片或剪刀， 确保工具清洁并经过灭菌 处理。
样品处理
将取下的组织或部位放入 预先准备好的容器中，加 入适量的固定液，确保样 品与固定液充分接触。
固定操作示例
固定液选择
根据样品类型和观察目的 选择适当的固定液，如戊 二醛、四氧化锇等。
固定方法
将样品放入固定液中，确 保样品完全浸没，并在适 宜的温度和环境下固定一 定时间。
行复染或补染。
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第五章透射电子显微镜生物样品制备技术
一、取材
从动、植物体上获得所需实验材料的过程叫 取材。 1、取材的方法 动物和植物的取材方法稍有不同。 动物组织的取材：取动物材料时需要先处死动 物，然后要在尽短的时间内（要求在１分钟之 内）把所需要的组织取出放入预冷（ 40C ）的 固定液中，稍加固定后再切成适当大小的块(要 求１立方毫米大小）； 植物组织的取材：植物材料可直接切成适当大 小的块，放入预冷的固定液中，
2、脱水：用脱水剂逐渐取代掉组织中水分的 过程叫脱水。 常用的脱水剂有酒精、丙酮。因丙酮对组 织内的物质有抽提作用，因此，在制作超薄切 片时，组织的脱水都用酒精，很少用丙酮。 脱水是采用逐渐提高脱水剂浓度的方法对 样品进行逐级脱水。脱水剂设置的浓度级差一 般有：50％、70％、80％、90％、100％（2 次）。在每级中脱水的时间据材料的质地不同 有一定变化，动物组织一般每级20分钟；植物 样品应加长脱水的时间。对一些含水多，柔软 的样品，应适当增加脱水剂的浓度级差，可从 30％开始脱水。
3、脱水时的注意事项 （1）、整个脱水过程应在较冷的环境中进行 （要求4摄氏度）。 （2）、在更换液体的过程中一定要避免样品的 自然干燥。 （3）、当进入高浓度的脱水剂时，要及时盖好 容器的盖子，防止空气中的水分进入脱水剂， 也要避免低浓度的脱水剂过多的带入高浓度 的脱水剂中。 （4）、脱水一定要彻底、干净。否则，会造成 包埋剂不能渗透到组织细胞的每个部位，使 制片失败。
第一节 透射电子显微镜 生物样品的 超薄切片制备技术
透射电镜的样品制备技术，主要有超薄切 片技术、负染色技术和冷冻蚀刻复型技术。
超 薄切片样品制作技术，是透射电镜生物医学样品 制备的最常用技术，其制作程序和石蜡切片的方法 步骤基本相同，但是在所使用的某些化学试剂及切 片机是完全不同的，对各技术步骤的操作要求要比 石蜡切片严格很多。一个能满足透射电镜观察要求 的超薄切片应具备以下几点： 1、切片厚度均匀，厚度在50～70nm. 2、切片无划痕、无震颤、无人工污染。 3、耐高真空，在真空中不变形、不升华。 4、耐电子束的轰击。
第五章 电镜样品的
另外， 另外，也有人发现固定液的 渗透压，稍处于偏高状态， 渗透压，稍处于偏高状态，可有 效地防止样品膨胀； 效地防止样品膨胀；亦可加入非 电解质物质加以调节， 电解质物质加以调节，可得到合 乎要求的高渗液体；还有人提出， 乎要求的高渗液体；还有人提出， 在固定液中加入钙离子成份（ 在固定液中加入钙离子成份（如： 0.5％氯化钙），亦可达到防止 ），亦可达到防止 ％氯化钙）， 组织膨胀的作用。 组织膨胀的作用。据报导若固定 液中加入适量的电解质， 液中加入适量的电解质，除可防 止样品膨胀外，还具有减少细胞 止样品膨胀外， 内物质被“抽提”之作用。 内物质被“抽提”之作用。
“小”：固 小 定液的穿 透能力都 比较弱， 比较弱， 所以为了 保持样品 近于生活 状态的微 细结构， 细结构， 取材大小 当然要与 固定液的 穿透速率 相适应， 相适应，
一般以 1mm3 为宜。 为宜。 样品过 大时内 部固定 不良， 不良， 样品过 小时观 察的目 标又会 受到局 限。
具体操作方法：先准备好取材用器材及剂， 具体操作方法：先准备好取材用器材及剂，写好取材 标签” 取大小适中的玻璃平皿，其内放好冰块， “标签”．取大小适中的玻璃平皿，其内放好冰块， 在冰上放好软塑料板或牙科蜡板， 在冰上放好软塑料板或牙科蜡板，而后在板上滴预 冷固液内， 定液内，以一分为二的双面保险刀 片把样品切割成1mm3的 片把样品切割成 小块， 小块， 迅速投人预冷的固 定液小瓶内， 定液小瓶内，并在小瓶上 贴好标签。 贴好标签。对于胚胎及脑 等柔软易碎组织， 等柔软易碎组织，可切成 稍大的组织小块， 稍大的组织小块，放入固 定液内15分钟左右 分钟左右， 定液内 分钟左右，再细 的组织快固定。 切为 1mm3的组织快固定。
超薄切片应达到以下几点 要求： 要求： （1）细跑的超微结构得 ） 到良好的保存， 到良好的保存，没有明显的 人工假象； 人工假象； （2）切片厚度一般为 ） 50nm（500Å）左右，较薄 （ ）左右， 的切片分辨力较高， 的切片分辨力较高，但反差 较弱， 较弱，而较厚的切片反差虽 好，但分辨力则稍差
第五章SEM样品制备技术
SEM生物样品的制备与观察
一、扫描电镜样品观察特点
(一) 能够直接观察样品表面的结构;
(二)景深大，图象富有立体感。扫描电镜的景深较 光学显微镜大几百倍，比透射电镜大几十倍;
(三) 样品可以在样品室中作三度空间的平移和旋转， 因此，可以从各种角度对样品进行观察; (四) 在观察形貌的同时，还可利用从样品发出的其 他信号作微区成分分析。
二、扫描电镜样品的制备
（一）要求1.尽可能保来自生物活体时的近似形态结构。2.有较高的耐电子轰击能力, 有较好的导电性能 和较高的二次电子发射率。
二、 、扫描电镜样品的制备
（二）样品的类型及处理程序 1.硬组织 如毛发、骨、牙齿、贝壳、花粉、孢子、种 子、木材和其它质地较硬含水量较少的样品等。
样品处理程序： 取样 →清洁 →装台 →导电处理 →电镜观察。
(1) 粒子细；
(2) 镀膜均匀；
(3) 用金量少；
(4) 镀膜时间短。 缺点： 由于样品处于电场中会有些损伤(样品不 能太近)。
（四）样品的导电处理
注意事项： (1) 样品应充分干燥，镀膜时会产生紫蓝色弧光。
(2) 不同的金属靶会有它不同的溅射条件。
(3) 镀膜时如真空度大幅度下降应立即停止溅射。
（7）临界点干燥样品优点： a、临界点干燥后生物样品少变形或不变形。 b、 临界点干燥仪操作简单方便。 C、相对于冰冻干燥时间短。 缺点： a、要使用专用临界点干燥仪。 b、干燥真菌孢子等易脱落。
（三）干燥的方法
（8）临界点干燥注意事项： a.样品装入干燥篮时防止表面干燥。 b.临界点干燥样品杯要先预冷至10 0C以下。 c.一次干燥样品不宜太多。 d.冲入CO2流量速度要慢(以免压力改变太快 有损样品)。 e、操作要轻(特别是装样入篮时)。
电镜样品制备
2014
（读书报告、研究报告）
考核科目:学生所在院（系）：学生所在学科:
材料电子显
材料科学与
材料工程
微分析实践
工程学院
学
生Байду номын сангаас
姓
名：
季
相
儒
学
号：
1 5
S1
0 9 2 7 2
学
生
类
别：
工
程
硕士
考
核
结
果
阅卷人
透射电镜样本的制备
➢超薄切片制样 ➢负染
超薄切片
由于电子的穿透能力弱，一般的组织细胞的切片，无法在 电镜下获得清晰的图像。阻碍了电子显微镜的发展。
1957年，英国Huxley发明超薄切片机。
超薄切片制片过程
取材
固定
染色
切片
脱水
浸透 包埋
取材
快小冷准净
取材
迅速
部位 少带
放入
0.5-
低温 准确 血液
5mL 10mL 20mL 30mL 40mL 50mL
2.495 0.62 1.885 0.085 2.57 0.31 2.12 0.085 2.425 0.925 1.65 0.085
4.99 9.98 14.97 19.96 24.95 1.24 2.48 3.72 4.96 6.2 3.77 7.54 11.31 15.08 18.85 0.17 0.34 0.51 0.68 0.85 5.14 10.28 15.42 20.56 25.7 0.62 1.24 1.86 2.48 3.1 4.24 8.48 12.72 16.96 21.2 0.17 0.34 0.51 0.68 0.85 4.85 9.7 14.55 19.4 24.25 1.85 3.7 5.55 7.4 9.25 3.3 6.6 9.9 13.2 16.5 0.17 0.34 0.51 0.68 0.85
Epon812 DDSA（十二烷基琥珀酸酐） MNA （甲基内次甲基邻苯二甲酸酐） DMP-30（2,4,6三，二甲氨基甲基苯酚）
固化剂：控制软度 固化剂：控制硬度 加速剂
包埋剂配方
季节配比 包埋液成份
春秋 夏 冬
Epon812 DDSA MNA DMP-30 Epon812 DDSA MNA DMP-30 Epon812 DDSA MNA DMP-30
【电子显微镜,分类和电镜样品制备技术】电镜样品制备
【电子显微镜,分类和电镜样品制备技术】电镜样品制备电子显微镜分类和电镜样品制备技术电子显微镜技术简称电镜技术，它包括电子显微镜(electronmicroscope)和样品制备技术(techniquesofsamplepreparation)两大方面。
电子显微镜的基本原理与光学显微镜相同，但光源和透镜有所不同，电镜利用电子束作光源，电磁场做透镜，因而最佳分辨率可达1-2，放大倍率达150万倍。
样品制备技术是制作电镜标本的综合技术，比光学显微镜制片过程更精细和复杂。
它包括普通样品制备技术(如超薄切片技术)和特殊样品制备技术(如电镜酶细胞化学技术)。
第一台电镜诞生于1931年，至今已有70余年的历史，经过不断的改进和提高已从最初的一种电镜发展为多种电镜，分辨率可达到1。
近年来，随着电镜计算机的一体化，使新型电镜的操作更为简便，图像获取更快捷，而且电镜图像在观察过程中可以得到即时储存和统计分析等，大大提高了电镜的使用效率。
电子显微镜技术是研究细胞超微结构最重要的手段。
广泛应用于医学生物学等各个学科，在现代医学科学研究和临床疾病的诊断中发挥着重要的作用。
(一)电子显微镜的种类电子显微镜是以电子束作光源、电磁场作透镜、具有高分辨率和放大倍率的显微镜。
电镜通过收集、整理和分析电子与样品相互作用产生的各种信息而获得物体的形貌和结构等。
电镜的类型也是利用电子信号的不同和成像的不同而进行分类。
主要分为透射电子显微电镜、扫描电子显微电镜、分析电子显微镜和高压电子显微镜。
1、透射电子显微电镜透射电子显微电镜(transmmisionelectronmicroscope)，是发展最早、应用最广泛的电镜，一般所说的电镜指的便是透射电镜。
透射电镜主要用于观察组织细胞的内部结构。
透射电镜由三大系统组成，包括镜体系统、真空系统和电子线路系统。
镜体系统是电镜的主体，结构相当复杂，又分为照明系统、成像系统和观察记录系统。
照明系统由电子枪和聚光镜组成，电子枪发射电子作为电镜的照明光源。
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2.真空干燥法：含水分或脱水剂样品置于真空干燥器内， 抽低真空使液态物质挥发，使样品干燥。
特点：干燥速度快，效果与自然干燥法相近。
镀膜 镜检
3.冷冻干燥法：超低温快速冷冻
液氮、丙烷
取材 固定 脱水 制冷剂 真空升华
粘样
取材 清洗
样品干燥法 4.临界点干燥法（critical piont drying method CPD)
(1)干燥原理：
固定 脱水 干燥 粘样 镀膜 镜检
在密闭容器中加热，使液态干燥剂 变为气态，当气态与液态物质的密 度相等时，相界消失。这时液态干 燥剂的分子内聚力为零，此时液体 的表面张力系数为零(即临界状态)。CO2 在临界状态下继续对容器加热，同 时以一定速度排出气体，直到排净为 止。这时样品在无表面张力的临界状 况下得以干燥。
固定
2.熏蒸固定：固体培养基培养的菌丝类样品。用锇酸蒸汽 熏蒸固定0.5~1小时。
脱水 3.双固定： 戊二醛(1~3h)—锇酸(0.5~1h)
干燥 4.冷冻固定：液氮超低温快速冷冻可保存样品的生活状态。
粘样 5.不固定：干种子、花粉、孢子类样品。
镀膜 四、脱水：梯度系列脱水法。
镜检
注意：根据材料性质和大小而调节脱水时间。
固定
方法：因材料而异，通过破碎、解剖、切割、 分离、提纯等手段，获取样品最佳观察面。
脱水 干燥
2.动作轻巧：保护好拟观察面。
解剖器械要锋利，不能对材料施加锯、挤、拉压 的外力。含水分多的、幼嫩材料最好冷冻断裂法。
粘样 镀膜 镜检
3.厚度小：满足观察条件的最小体积，厚度为1~2毫米
4.纯净防混杂：花粉、孢子类样品注意防尘、防混杂 5.悬浮液样品要求合适的浓度：
清洗 固定 脱水 干燥 粘样 镀膜 镜检
要求： 镀膜必须薄而均匀，本身无结构，能够再现样品表面的
固有形态，化学性质稳定，不与样品发生化学反应。
目的：改善生物样品的导电性；提高二次电子的产额， 改善图像的反差、亮度、分辨率，从而改善了 图像的质量；并增强了样品的机械强度。
1.离子溅射镀膜法：金、铂、金—钯、铂—钯合金
1.管道铸型的技术条件： •铸型剂应具有适当的黏度：相当20~50%的甘油黏度； •铸型剂成型后应具有耐腐蚀，干燥不变形、脆裂、耐高温； •控制灌注压力：100mmHg左右，与组织和铸型剂有关。
2.铸型操作技术： （1）铸型剂：聚氯乙烯、甲基丙烯酸、丙烯酸单体、树脂
类、工程塑料。60℃下进行半聚合，调节黏度适中。 （2）器官处理：摘取新鲜器官，生理盐水由动脉注入清洗，
浓度太大造成样品堆积；浓度小则检出困难。
取材 二清洗：
清洗 1.完整的制样程序中有三次清洗
固定 脱水 干燥
固定前清洗：洗去表面的灰尘、黏液等附着物， 确保获得清洁的观察表面。
前固定后清洗：洗净醛类固定液，以免戊二醛与锇酸 反应而削弱锇酸的固定效果。
粘样 镀膜 镜检
脱水前的清洗：洗净固定液，以免与脱水剂反应 产生沉淀影响观察效果。
取材 2.清洗液的类型与选择：蒸馏水、生理盐水、加酶清洗液等
清洗 选择原则：清洗液的pH值、渗透压、温度应该尽量接 近样品材料的生理值，以免样品因环境突变而产生形变。
固定 选择方法：
脱水 植物材料：蒸馏水洗净尘埃；
动物材料：等渗生理盐水、5%碳酸钠或缓冲液洗去黏液等；
干燥 游离细胞：用等渗的缓冲液清洗(精子、血细胞、微生物)；
CO2↑
加热器
使干燥剂气相与液相相等的温度称为该干燥剂的临界温度。 使干燥剂气相与液相相等的气压称为该干燥剂的临界压强。
取材 临界点干燥法
（2）常用干燥剂与中间剂：
清洗
干燥剂：在临界点干燥器内起临界干燥作用的液体.
固定 脱水 干燥 粘样
常用干燥剂：
液态CO2：,临界温度为31.1℃，临界压强72.8标准大气压。 F12 ： 临界温度 28.9 ℃ ，临界压强38.1标准大气压。
（5）超声波清洗：用于表面结构复杂、凹陷、皱折多的样品。 粘样
样品置清洗液中，超声波清洗器内清洗，必须控制功率
镀膜 （6）灌流清洗：观察管腔内壁结构的样品，避免血液、 组织液凝聚而影响观察效果。
镜检 通过动脉注入清洗液，直到排出液变清为止。必须控制压力
取材 三、固定方法
清洗 1.单固定：只用一种固定剂（通常戊二醛）固定的方法。
不造成电荷堆积而发生放电现象。
脱水
2.常用粘接剂：银粉导电胶、碳粉导电胶、双面胶带。
干燥 粘样 镀膜
3.粘样方法： 保护观察面，
•导电胶：用于粘贴大块样品（组织块）； •双面胶带：用于花粉类细小易分散的样品； •不粘贴：细菌、血液等单细胞直接滴在样品托上； •胶水：果壳、种子等较大颗粒的样品。
镜检
取材 七、镀膜: 在样品以及样品托表面同时喷镀一层金属膜
主要内容：第一节 SEM样品的常规制备技术 第二节 特殊要求的扫描制样技术
第一节 扫描电镜样品的常规制备技术
菌类和组培细胞
粘样或滴样
熏蒸固定
干燥
冷冻
断裂
取清 材洗
固 清洗 脱 定水
干 粘镀镜 燥 样膜检
管道铸型 花粉、种子及孢子类样品
腔形器 官
取材 清洗
一、取材 即：获取观察材料。
遵循五字原则：准、轻、小、净、浓 1.迅速准确：取材动作要快，部位要准确。
一、组织内部结构简易剖出法： 1.切断法： 适用于多孔隙组织，如肺、脾等。 方法：干燥的样品→双刀切割→粘样镀膜→观察 新切面
2.镊子掰开法 适用于肝脏等实质性器官以及密度大的组织 方法：切痕→掰开→粘样→镀膜观察
3.双面胶带拉断法： 适用于纤维组织、颗粒样品 方法：干燥→粘样→拉断→镀膜观察
二、环氧树脂割断法：
常规脱水干燥
杆菌10μm
球菌10 μm 酵母菌5 μm
曲霉20 μm
第二节 特殊要求的扫描制样技术
——组织细胞的内部结构观察法
内部结构剖出法
切断法：多孔组织 简易剖出法 掰开法：实质性组织
拉断法：纤维组织
环氧树脂割断法：
冷冻割断法： 管道铸型法：腔形器官的立体构架
离子蚀刻法：利用离子流破坏作用，使样品表面剥离， 从而暴露出样品的内部结构。
环氧树脂 固 敲 包埋样品 化 断
溶去 树脂
-80℃ 小锤敲击刀背
干燥 观 镀膜 察
三、冷冻割断法： 常用二甲基亚砜(DMSO)冷冻割断法
取材 清 保护 固 固定 洗 包埋 化
缓冲液
DMSO过渡， 12.5%，25%，50% 各20~30分钟，
断 融化 清洗 镀膜 裂 保护液 干燥 观察
液氮 冷却
敲击 50%DMSO 断裂
四、管道铸型法
为观察腔形器官内循环系统的立体构筑和分布情况， 而设计的制样方法。
铸型剂注入
官腔内，待 其固化成形 后，用腐蚀 剂去掉组织，
出 球 小 动 脉
肾小体
从而使反映 官腔真实情
插图
叶 间
况的铸型样 品保留下来，
布肾 髓
动 脉
经干燥镀膜
质 血
后观察分析.
管
球动脉
分
犬肾髓旁血管铸型
犬肾小叶间动脉
取材 五、干燥：指除去样品中的残存液体（水或脱水剂）， 使样品中不含液态物质的过程。
清洗
原因：液态物质脱离样品表面时必须克服表面张力， 其反作用力会使样品表面结构产生形变。
固定 1.自然干燥法：样品中的水分或脱水剂在大气中自然蒸发使样品干燥
脱水 干燥 粘样
适宜样品：花粉、孢子、种子、果壳、木质纤维、骨骼； 游离细胞类在脱水剂中自然干燥较好。
干燥 干燥方法：
粘样 固定
脱水
镀膜 镜检
75%叔丁醇 乙醇溶液
100% 叔丁醇
100% 叔丁醇
冷凝 固化
10~15分钟
10~15分钟 浸没样品0~4 ℃
真空 干燥
粘样 镀膜
取材 六、粘样 利用粘接剂把样品固定在样品托上
清洗 固定
1.目的要求：
•保证样品在样品托上的稳定性； •增强样品与样品托之间的导电性，观察时表面
覆盖大量黏液的样品(胃黏膜)用低浓度的蛋白水解酶溶液洗；
粘样
组织培养细胞：用相应的培养液清洗； 特殊样品：如乳腺组织富含蛋白质和脂类，分别用16%的
甘油和20%乙醇浸泡清洗； 镀膜表面附着蜡质、角质层的样品：用有机溶剂脱蜡。
镜检
取材 清洗 固定
： 3.清洗方法 不同材料采用不同方法，灵活应用
（1）镀膜原理：
抽低真空，加负高压，
残留气体分子电离，
0.5~3
撞击靶金属产生粒子，KV来自粒子受电场作用飞向阳极落在样品表面。
1×10-2Torr
应用：微生物样品的处理
细菌
液体培养基 的菌落
固体培养基 的菌落,先 滴固定液
刮下 菌落
8000离心 2~5分钟
霉菌 切割菌落
戊二醛固定
常规固定 脱水干燥 粘样镀膜
切割
断裂：界面 断开
蚀刻：表面 剥离
表面剥离使内部结构暴露
花粉破壁
（1）植物材料：根部水冲洗去泥土，地上部用水冲洗或滴洗。 观察气孔状态时应注意清洗后取材时机。
（2）较干净的样品：固定后20倍体积的清洗液轻摇，换液三次。
脱水 干燥
（3）表面附着大量黏液的样品：振荡法或喷射瓶壁加压冲洗。 （4）游离细胞、微生物：离心法清洗。
清洗液与样品混合摇匀 低速离心（反复三次）
第五章 扫描电镜生物样品制备技术
常规电镜样品要求： 必须是干燥的，不含水分或挥发性物质； 具有一定机械强度，能耐受电子束轰击； 具有导电性，被激发时能够产生足够的二次电子。