不同还原剂对大豆胰蛋白酶抑制剂的钝化研究

关 键 词 ： 大 豆 胰 蛋 白 酶 抑 制 剂 ， 还 原 剂 ， ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ， 凝 胶 排 阻 色谱
Ａｂｓｔｒ ａｃｔ：Ｔｈｅ ａ ｉｍ ｏｆ ｔｈｉｓ ｐ ａ ｐ ｅ ｒ ｗａ ｓ ｔｏ ｓ ｔｕｄ ｙ ｔｈｅ ｉｎａ ｃ ｔｉｖａ ｔｉｏｎ ｏｆ ＳＴＩ ｂ ｙ ｄ ｉｔｈｉｏｔｈｒｅ ｉｔｏｌ （ＤＴＴ）， Ｎａ ２ＳＯ３ ａ ｎｄ Ｃｙｓ ． Ａｆｔｅ ｒ ｉｎｃ ｕｂ ａ ｔｉｏｎ ａ ｔ ８０℃ ， ｐ Ｈ ７．５， ＳＴＩ ｗａ ｓ ｍｅ ａ ｓ ｕｒｅ ｄ ｂ ｙ ａ ｎ ｉｍｐ ｒｏｖｅ ｄ ＢＡＰＮＡ ｍｅ ｔｈｏｄ ． Ｔｈｅ ｃ ｈａ ｎｇ ｅ ｓ ｏｆ ＳＴＩ ｗｅ ｒｅ ｄ ｅ ｔｅ ｒｍｉｎｅ ｄ ｂ ｙ ｓ ｉｚｅ ｅ ｘｃ ｌｕｓ ｉｏｎ ｃ ｈｒｏｍａ ｔｏｇ ｒａ ｐ ｈｙ （ＳＥＣ） ａ ｎｄ ＳＤＳ － ＰＡＧＥ， ｒｅ ｓ ｐ ｅ ｃ ｔｉｖｅ ｌｙ． Ｔｈｅ ｒｅ ｓ ｕｌｔｓ ｒｅ ｖｅ ａ ｌｅ ｄ ｔｈａ ｔ ＳＴＩ ｗａ ｓ ｉｎａ ｃ ｔｉｖａ ｔｅ ｄ ｂ ｙ ｒｅ ｄ ｕｃ ｉｎｇ ａ ｇ ｅ ｎｔｓ ， ａ ｎｄ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂ ｉｔｉｏｎ ｅ ｆｆｅ ｃ ｔｉｖｅ ｎｅ ｓ ｓ ｗａ ｓ ａ ｓ ｆｏｌｌｏｗｓ ： ＤＴＴ＞Ｎａ ２ＳＯ３ ＞Ｃｙｓ ， ｗｈｉｃ ｈ ｗａ ｓ ａ ｌｓ ｏ ｐ ｒｏｖｅ ｄ ｂ ｙ ＳＤＳ － ＰＡＧＥ． Ｂｙ ＳＥＣ ｗｅ ｃ ｏｕｌｄ ｋｎｏｗ ｔｈａ ｔ ｔｈｅ ｄ ｉｓ ｕｌｆｉｄ ｅ ｂ ｏｎｄ ｓ ｏｆ ＳＴＩ ｗｅ ｒｅ ｂ ｒｏｋｅ ｎ， ａ ｎｄ ｔｈｅ ｓ ｔｒｕｃ ｔｕｒｅ ｏｆ ＳＴＩ ｗａ ｓ ｃ ｈａ ｎｇ ｅ ｄ ， ａ ｎｄ ｓ ｏｍｅ ｎｅ ｗ ｃ ｏｍｐ ｏｕｎｄ ｓ ｗｅ ｒｅ ｐ ｒｏｄ ｕｃ ｅ ｄ ． Ｔｈｅ ｒｅ ｆｏｒｅ ， ｔｈｅ ｓ ｔａ ｂ ｉｌｉｔｙ ｏｆ ＳＴＩ ｉｓ ｃ ｌｏｓ ｅ ｌｙ ｒｅ ｌａ ｔｅ ｄ ｔｏ ｄ ｉｓ ｕｌｆｉｄ ｅ ｂ ｏｎｄ ｓ ．
１．２ 主要溶液
１．２．１ Ｔｒｉｓ － ＨＣｌ 缓 冲 液 （ ５０ｍｍｏｌ／Ｌ， ｐＨ７．５） 称 取 ０．６０６ｇ Ｔｒｉｓ， 用 适 量 蒸 馏 水 溶 解 后 ， 再 用 少 量 浓 盐 酸 在酸度计上滴定 ｐＨ 至 ８．０， 然后定容至 １００ ｍＬ。 １．２．２ 大豆胰蛋白酶抑制剂 溶 液 ＳＴＩ 用 缓 冲 液 溶 解 并配制成浓度为 ５ｍｇ／ｍＬ 的溶液。
ＳＴＩ 的相对失活率（ ％） Ａ
－ － ８０．１４±１．８２ ｃ ７７．９８±１．１３ ｃ ７１．８５±４．０９ ｃ １１．２０±０．９５ｄ
注： Ａ 表示每一个数值都是多次重复（ ｎ≥５） 平均值加上标准偏差； ａ 和 ｂ 表示同列中吸光值间的显著性差异（ Ｐ≤０．０５） ； ｃ 和 ｄ 表
示同列 ＳＴＩ 的相对失活率之间的显著性差异（ Ｐ≤０．０５） 。
大豆是优质的植物蛋白源， 但其中含有的胰蛋
白酶抑制剂等多种营养限制因子会危害人体健康，
造成营养价值下降。其对人体的危害主要表现在抑
制人体胰蛋白酶活性， 因此食用未完全除去胰蛋白
收稿日期： ２００６－ ０７－ ０３ 作者简介： 万娟（ １９８３－ ） ， 女， 在读硕士研究生， 研究方向： 蛋白质化学
１．２．３ 胰蛋白酶溶液 胰蛋白酶用缓冲液配成活力为 ５０００ＢＡＥＥ／ｍＬ 的溶液。 １．２．４ ＢＡＰＮＡ 溶 液 ＢＡＰＮＡ 用 缓 冲 液 配 成 浓 度 为 ０．４ ｍｇ／ｍＬ 的溶液备用。 １．２．５ ３０％冰醋酸溶液（ ｖ／ｖ） 量取 ３０ｍＬ 冰醋酸， 用蒸 馏水定容至 １００ｍＬ。
研究与探讨
Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．０３，２００７
食品工业科技
表 １ 用改进的 ＢＡＰＮＡ 法测得的实验结果
样品
对照样 胰蛋白酶 ＤＴＴ 钝化 ＳＴＩ 的反应液 Ｎａ２ＳＯ３ ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ化 ＳＴＩ 的反应液 Ｃｙｓ 钝化 ＳＴＩ 的反应液 热处理 ＳＴＩ 的反应液
吸光值（ Ａ４１０） Ａ
０．８８１ ０．００５ ０．７１１±０．０１６ ａ ０．６９２±０．０１０ ａ ０．６３８±０．０３６ ａ ０．１０４±０．００８ ｂ
１．３ 不同生化还原剂对 Ｓ ＴＩ 的钝化作用
１．３．１ 大 豆 胰 蛋 白 酶 抑 制 剂 的 钝 化 ＳＴＩ 溶 于 ５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ ＨＣｌ（ ｐＨ７．５） 缓 冲 液 ， 分 别 加 入 下 列 巯 基 还 原 剂 ： 二 巯 基 苏 糖 醇 （ ＤＴＴ） ； 亚 硫 酸 钠 （ Ｎａ２ＳＯ３） 及 半 胱 氨 酸 （ Ｃｙｓ） 使 得 溶 液 浓 度 达 １０ｍｍｏｌ／Ｌ， 然 后 ８０℃水浴恒温 １ｈ。 １．３．２ 改 进 的 ＢＡＰＮＡ 法 测 定 ＳＴＩ 钝 化 程 度 采 用 改 进的 ＢＡＰＮＡ 法测定 ＳＴＩ 钝化结果， 实验步骤如图 １ 所示。 反应液 ０．０２ ｍＬ＋ 胰蛋白酶溶液 ０．１ ｍＬ＋ 缓冲液 ０．２８ ｍＬ
Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ：ｓ ｏｙｂ ｅ ａ ｎ ｔｒｙｐ ｓ ｉｎ ｉｎｈｉｂ ｉｔｏｒ； ｒｅ ｄ ｕｃ ｉｎｇ ａ ｇ ｅ ｎｔｓ ； ＳＤＳ － ＰＡＧＥ； ｓ ｉｚｅ ｅ ｘｃ ｌｕｓ ｉｖｅ ｃ ｈｒｏｍａ ｔｏｇ ｒａ ｐ ｈｙ
中图分类号： ＴＳ２０２．３ 文献标识码： Ａ 文 章 编 号 ： １００２－ ０３０６（ ２００７） ０３－ ００８２－ ０４
１．４ 凝胶排阻色谱 （ Ｓ ｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓ ｉｖｅ Ｃｈｒｏｍａ ｔｏｇｒａ ｐｈｉｃ， Ｓ ＥＣ）
１．４．１ ＳＥＣ 测 试 条 件 色 谱 柱 ： Ｐｒｏｔｅｉｎ－ ＰａｋＴＭ ３００ＳＷ （ ７．８ ×３００ｍｍ Ｃｏｌｕｍｎ ＷＡＴＯ８００１３） ； 流 动 相 ： ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ ＨＣｌ ｐＨ ７．５ 的缓冲溶液； 流速： ０．６ｍＬ／ｍｉｎ； 柱温： ２５℃； 进样量： ２０μＬ。 １．４．２ 样品测试 将样品溶液与流动相 １∶１ 配比成相 同 浓 度 的 溶 液 ， 在 １００００×ｇ 转 速 下 离 心 １０ｍｉｎ， 再 用 ０．４５μｍ ＨＡ 型水溶性滤膜过滤后， 每次取 ２０μＬ 注入 色谱仪中， 最后对色谱图谱进行分析。
工程。
８２ ２００７ 年第 ０３ 期
酶抑制剂的豆制品时， 不仅会抑制人体对蛋白质的 消化吸收， 还会引起胰腺肿大等中毒症状。因此， 目 前国内外研究人员对大豆中胰蛋白酶抑制剂失活进 行了大量的研究工作， 最早的即是热处理法。热处理 虽然可以降低胰蛋白酶抑制剂活性， 但并不能使抑 制剂完全失活， 同时也容易引起大豆中一些必需氨 基 酸 损 失 。华 南 理 工 大 学 的 陈 中 、杨 晓 泉 等 人 发 现 枯 草 杆 菌 蛋 白 酶 （ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ） 可 在 常 温 下 部 分 降 解 大 豆 胰蛋白酶抑制剂， 证明大豆蛋白酶抑制剂与其蛋白 酶钝化敏感性有关。但是酶处理方法也存在其局限 性， 即酶的专一性比较高， 要找到一种合适的可水解 胰蛋白酶抑制剂的酶较难。Ｂｏｉｈｏｎ 等（ １９９２ 年） 实验 证明， 大豆胰蛋白酶抑制剂能被 ＮＡＤＰ－ 氢化硫氧蛋 白体系及硫辛酸－ 氢化氧还蛋白还原而失活， 可达到 破坏抑制剂活性的目的并且使氨基酸组成不发生明 显变化。因此， 本文分别选取了三种还原剂： 二巯基 苏糖醇、亚硫酸钠和半胱氨酸来研究其对大豆胰蛋 白酶抑制剂的钝化作用。
摘 要： 研究了二巯基苏糖醇（ ＤＴＴ ） 、亚硫酸钠（ Ｎａ２ＳＯ ３） 和半胱氨 酸（ Ｃｙｓ） 对 大 豆 胰 蛋 白 酶 抑 制 剂 活 性 的 影 响 。实 验 在 温 度 ８０℃， ｐＨ ７．５ 条 件 下 反 应 ， 并 以 ＢＡＰＮＡ 为 底 物 ， 采 用 改 进 的 方 法 测 定 ＤＴＴ 对 大 豆 蛋 白 酶 抑 制 剂 的 钝 化 作 用 ， 最 后 用 ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ 方 法 和 凝 胶 排 阻 色 谱 法 研 究 其 蛋 白 酶 钝 化 敏 感 性 。 通 过 改 进 的 ＢＡＰＮＡ 法 得 出 还 原剂钝化大豆胰蛋白酶抑制剂由大到小顺序依次为： ＤＴＴ＞ Ｎａ２ＳＯ ３＞ Ｃｙｓ， 并 通 过 ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ 进 一 步 证 实 了 比 色法得出的结论。而凝胶排阻色谱法说明了还原剂对大 豆胰蛋白酶抑制剂作用使得抑制剂中二硫键被打断， 抑 制剂结构发生改变， 有新的物质生成。所以， 得出大豆胰 蛋白酶抑制剂的稳定性与二硫键的存在有关。
↓３７℃水浴反应 １０ｍｉｎ ＋ ＢＡＰＮＡ 溶液 ２ ｍＬ
↓３７℃水浴反应 １０ｍｉｎ ＋ ３０％冰醋酸溶液 ０．１ ｍＬ 终止反应
↓ ４１０ ｎｍ 比色 图 １ 采用改进的 ＢＡＰＮＡ 法测定 ＳＴＩ 钝化情况的流程图 对 照 样 为 不 加 还 原 剂 的 ＳＴＩ 溶 液 ， 其 余 操 作 相 同。 用空白样作参比， 分别取样液及对照样溶液， 通 过比较加入与不加入还原剂反应的样品在 ４１０ｎｍ 的 吸光值， 就可由残留的胰蛋白酶活性间接检测出蛋 白酶对抑制剂的钝化程度。 另外， 用 ０．１ｍＬ 胰 蛋 白 酶 溶 液 加 上 ０．３ｍＬ 缓 冲 液 ， 混 匀 后 与 ２ｍＬ ＢＡＰＮＡ 溶 液 于 ３７℃水 浴 反 应 １０ｍｉｎ， 然 后 加 入 ０．１ｍＬ ３０％ 冰 醋 酸 中 止 反 应 ， 在 ４１０ｎｍ 下比色， 测定胰蛋白酶的活力（ Ａ４１０ 值表示） 。 当还原剂能完全钝化 ＳＴＩ 时， 胰蛋白酶表现出最 高活力， 这时反应 液 的 吸 光 值 最 大 ， 而 当 ＳＴＩ 未 被 钝 化时， 胰蛋白酶表现出最低活力， 这时反应液的吸光 值最小。因此， 可用下式表示还原剂对 ＳＴＩ 钝化的相 对活力大小：
１ 材料与方法
１．１ 实验材料
大豆胰蛋白酶抑制剂（ Ｓｏｙｂｅａｎ Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ， ＳＴＩ） 活力为 １００００ＢＡＥＥ／ｍｇ； 胰蛋白酶（ Ｔｒｙｐｓｉｎ） 活 力为 ５０００ Ｕ／ｍｇ； Ｎ－ 苯甲酰－ ＤＬ－ 精氨酸－ 对硝基苯胺 （ ＢＡＰＮＡ） 购 自 Ｓｉｇｍａ 公 司 ； 二 巯 基 苏 糖 醇 、亚 硫 酸 钠、半胱氨酸 均购自上海伯奥生物技术有限公司； 各种化学试剂 均为分析纯。