有机污染物分析与生物毒性实验的水样采集与前处理

有机污染物分析与生物毒性实验的水样采集与前处理1．仪器与试剂试剂二氯甲烷(Dichloromethane)：农残级（美国Fisher Scientific公司）；甲醇（Methanol）：HPLC级（美国Fisher Scientific公司）；正己烷（n-Hexane）：农残级（美国Fisher Scientific公司）。

硅胶（60－200目）：超纯（美国ACROS ORGANICS）；中性氧化铝（50－200目）：（美国ACROS ORGANICS）；无水硫酸钠：优级纯。

药匙（硅胶柱净化所用）：以二氯甲烷超声清洗15min两次、正己烷超声清洗15min一次。

硅胶在180±2℃、氧化铝在250±2℃分别活化12 h（activate）；待冷却至室温时，称重后装入大口锥形瓶（250或500ml），加入其重量3％的蒸馏水去活性（deactivate），添加过程中应用滴管逐滴加入，边加边用力振摇以防止结块，并超声振荡30 min；放置过夜，平衡后加入正己烷浸没其表面备用（一般也需放置过夜）。

无水硫酸钠经450℃焙烧12 h后置于密封广口瓶中保存备用。

仪器与耗材APFF玻璃纤维滤膜（ф142 mm，孔径0.8~1.2 μm，Millipore）：预先在450℃烘烤3 h，称重记录（较脏水样3~5张为一组，干净水样每张皆需称量，为悬浮物收集所需），蒸馏水浸没保存；相应的滤膜支架与蠕动泵（Millipore）；固相萃取装置：Supelco Visiprep TM DL十二管防交叉污染固相萃取装置；固相萃取柱：Waters OASIS®HLB固相萃取柱（6 cc、200 mg）；旋转蒸发仪：BÜCHI Rotavapor R-200 (瑞士)；无水真空气泵：美国进口，型号：DOA—P104—BN；高纯氮气及相应氮吹仪。

所用玻璃仪器均以10％的稀硝酸浸泡过夜，再以重铬酸钾洗液润洗浸泡20 min以上，分别用自来水、蒸馏水冲洗干净，在烘箱中110℃烘干；所用塑料器皿均以10％的稀硝酸浸泡过夜，再分别用自来水、蒸馏水冲洗干净，倒置2．样品的采集与过滤水样采集采样瓶采用10 l容量的棕色带塞细口玻璃瓶，样品瓶经重铬酸钾洗液润洗浸泡20 min 以上，以自来水、蒸馏水洗净后倒置晾干，待用。

污水、地表水每个样品采集30 l，饮用水每个样品采集45 l。

样品运回实验室后如不立即处理需4℃下保存；在存放样品时，应尽量注意存放在没有有机气体干扰的区域，以免交叉污染。

所采集样品应在2日内过滤完毕，7日内富集完毕。

挥发性有机物采集采样瓶选用40mL带有聚四氟乙烯密封垫的螺口玻璃瓶，洗净烘干。

采样时先用预采集的水样荡洗两三次，再向样品瓶中充样至溢流，以水样充满，顶部不留任何空间，封瓶时水样中不能有气泡，瓶壁有气泡时应轻摇瓶壁将气泡赶出；4℃下保存。

水样过滤过滤装置：直径为142mm的Millipore微滤系统；滤膜：APFF玻璃纤维滤膜；将20 l（污水、地表水）或40 l（饮用水）滤过水样收集于已洗净的带塞棕色玻璃瓶保存，加入5‰体积的甲醇，以抑制微生物的生长，待富集；剩余5 l滤过水样用于常规水质分析（250 ml，注意pH值、温度需立即测量）、金属分析（250 ml，加入1 ml硝酸酸化）、氮磷分析（500 ml），均收集于其余备用；悬浮物的收集：将滤过水样的滤膜用铝箔包好，4℃保存。

3．样品的富集富集采用500 mg的HLB固相萃取柱用于水样的富集。

先安装好真空抽滤装置及固相萃取装置，HLB柱在使用前依次用二氯甲烷、甲醇、蒸馏水各5 ml清洗，加液后保持5 min，开真空泵抽取液体，处理完后小柱处于活化状态。

调节好真空度，使水样过柱的流速恒定在5 ml/min。

富集完毕后，将水抽干。

首先以5 ml甲醇/水（甲醇%=5%）为清洗剂，浸泡5 min后，抽干30 min以上；然后以10 ml甲醇/二氯甲烷（1:9，v/v）为淋洗剂分三次（4 ml、3 ml、3 ml）进行第一级洗脱，洗脱组分为中等极性至非极性组分；再以5 ml正己烷/二氯甲烷（2:1，v/v）为淋洗剂进行第二级洗脱，洗脱组分为非极性组分。

洗脱液均收集于K-D浓缩器中。

将同一样品的第一级洗脱液集中于一个250 ml烧瓶中，添加3药匙无水硫酸钠，放置过夜；转移出清液后旋蒸浓缩，过无水硫酸钠小柱（装柱见净化部分），用15ml二氯甲烷淋洗脱水，用柔和高纯氮气（注意氮气流量要小，表面刚好产生漩涡即可，以免组分损失）吹蒸并置换溶剂为正己烷。

第二级洗脱液集中于另一个150 ml烧瓶中，旋蒸浓缩并置换溶剂为正己烷。

将两级组分合并吹氮浓缩，转移至大容量样品管，定容至6 ml。

悬浮物提取50 ml二氯甲烷超声提取三次（30 min、30 min、30 min），合并提取液，收集于250 ml 烧瓶中，旋转蒸发浓缩至1 ml左右，留待净化。

4．样品的净化与浓缩4.1正己烷湿法装柱在干净的50cm长内径为10mm的层析管上用记号笔在12cm和18cm处做上记号，取一个干净漏斗置于层析管顶端。

先用10ml正己烷淋洗层析管，从下端排出至液面刚好浸没石英砂层，此淋洗液废弃。

关上开关后，再加入20ml正己烷，用湿法装柱，用药匙依次将12cm硅胶、6cm氧化铝从顶端漏斗加入（硅胶、氧化铝层的上界面分别在12cm、18cm的记号线位置）。

注意在装柱过程中，要不断地加入正己烷以免其黏附在管壁上，并保持正己烷以适当的流速不断地流出，且保证正己烷液面始终高于柱界面（即柱子不能断裂）；同时不断地用吸耳球轻轻敲打滴定管，使硅胶层或氧化铝层紧密。

最后以同样方法再在氧化铝层上装入1cm的无水硫酸钠，用于样品脱水。

调节正己烷液面，使其正好处于无水硫酸钠层面之上，关闭开关备用（注意此时管壁上不得粘有固体颗粒，否则需用正己烷冲洗干净再调节液面）。

整个装柱过程中，正己烷可回收循环使用。

Florisil净化柱同样方法装入19cm的Florisil和1cm的无水硫酸钠。

无水硫酸钠小柱则选用30cm层析柱，仅装入5~10cm无水硫酸钠即可。

4.2 OCPs&PAHs样品的净化与洗脱将1ml待净化的二氯甲烷富集样品用滴管从K-D浓缩器移入净化柱中，浸泡5min以上，保证样品与净化柱充分接触交换。

第一级洗脱：以15ml正己烷分三次洗涤盛有二氯甲烷样品的K-D浓缩器，均用滴管移入净化柱中，然后以60滴/min左右的流速流出，直到液面刚好处于无水硫酸钠层面之上，关闭开关。

洗脱液用K-D浓缩器收集，此为非极性的烷烃组分。

第二级洗脱：进一步以70ml正己烷/二氯甲烷（7:3，v/v）混合液淋洗净化柱，控制流速为90滴/min左右，即成滴而不连续流。

洗脱液用100mL鸡心瓶收集，此为中等极性至非极性的芳烃组分。

第三级洗脱：进一步以30ml甲醇淋洗净化柱，洗脱液用50或100ml鸡心瓶收集，此为极性组分。

净化样品的浓缩15ml正己烷洗脱液直接用柔和高纯氮气浓缩定容至1ml；70ml正己烷/二氯甲烷（7:3）混合溶剂洗脱液首先用旋转蒸发仪浓缩至1ml左右；再用10ml正己烷分三次洗涤鸡心瓶，转移至K-D浓缩器；然后再用柔和高纯氮气浓缩定容至1ml；30ml甲醇洗脱液与混合溶剂洗脱液浓缩方法相同，也定容至1ml；首先进行化学分析，剩余样品吹干置换生物实验溶剂。

4.3有机磷与取代苯（按照氯苯、硝基苯）的净化方法正己烷湿法装柱，10 g Florisil＋1-2cm无水硫酸钠。

预先用10 ml正己烷洗柱，放出舍弃，使液面恰好浸没无水硫酸钠层；再将2 ml溶于正己烷的样品加载，并用1-2 ml正己烷冲洗样品瓶，同样加入净化柱。

依次用以下四种混合洗脱剂洗脱：对有机磷的各级洗脱回收率见表1。

Fraction I. 50 ml 6% 乙醚in 正己烷；Fraction II. 50 ml 15% 乙醚in 正己烷；Fraction III. 50 ml 50% 乙醚in 正己烷；Fraction IV. 50 ml 100% 乙醚。

表1. 对有机磷的各级洗脱回收率名称各级洗脱回收率1 2 3 4内吸磷100乙拌磷100二嗪农100马拉硫磷 5 95乙基对硫磷100甲基对硫磷100谷硫磷（保棉磷）20 80 乙硫磷ND ND ND ND4.4 酚Phenols的净化方法正己烷湿法装柱，4 g硅胶＋2 g无水硫酸钠。

预先用10 ml正己烷洗柱，放出舍弃，使液面恰好浸没无水硫酸钠层；再将2 ml溶于正己烷的样品加载，然后再以10 ml正己烷洗柱，放出舍弃。

依次用以下四种混合洗脱剂洗脱：各级洗脱回收率见表1。

Fraction I. 10.0 ml 15% 甲苯in 正己烷；Fraction II. 10.0 ml 40% 甲苯in 正己烷；Fraction III. 10.0 ml 75% 甲苯in 正己烷；Fraction IV. 10.0 ml 15% 2-丙醇in 甲苯。

表1. 各级洗脱回收率名称各级洗脱回收率%1 2 3 42-氯酚90 12-硝基苯酚9 90 苯酚90 102,4-二甲基苯酚95 72,4-二氯酚95 12,4,6-三氯酚50 504-氯-3-甲基苯酚84 14五氯酚75 204-硝基苯酚 1 904.5 PCBs的净化方法正己烷湿法装柱，10 g Florisil＋1-2cm无水硫酸钠。

预先用10 ml正己烷洗柱，放出舍弃，使液面恰好浸没无水硫酸钠层；再将2 ml溶于正己烷的样品加载，并用1-2 ml正己烷冲洗样品瓶，同样加入净化柱。

用100 ml正己烷洗脱。