体外细胞实验方法
医疗器械生物学评价第五部分体外细胞毒性试验
医疗器械生物学评价第 5 局部：体外细胞毒性试验1范围GB/T 16886 的本局部阐述了评价医疗器械体外细胞毒性的试验方法。
这些方法规定了以下供试品以直接或通过集中的方式与培育细胞接触和进展孵育；a〕用器械的浸提液，和／或b〕与器械接触。
这些方法是用相应的生物参数测定哺乳动物细胞的体外生物学反响。
2标准性引用文件以下文件中的条款通过GB/T 16886 的本局部的引用而成为本局部的条款。
但凡注日期的引用文件，其随后全部的修改单〔不包括订正的内容〕或均不适用于本局部，然而，鼓舞依据本局部达成协议的各方争论是否可使用这些文件的最版本。
但凡不注日期的引用文件，其最版本适用于本局部。
GB/T 16886. 1 医疗器械生物学评价第1 局部：评价与试验〔GB/T 16886.1-2023,idt ISO 10993- 1:1997〕CB/ T 16886. 12-2023 医疗器械生物学评价第12 局部：样品制备和参照材料〔idt ISO 10993-12 :1996〕3术语与定义GB/ T 16886. 1/ ISO 1993-1 中确立的以及以下术语和定义适用于本局部。
3.13.2 阴性比照材料negative control material依据本局部试验时不产生细胞毒性反响的材料。
注：阴性比照的目的是验证背景反响，例如高密度聚乙烯1〕牙科材料的阴性比照物。
阳性比照材料 pos itive control material依据本局部试验时可重现细胞毒性反响的材料。
已作为合成聚合物的阴性比照材料，氧化陶瓷棒则用作注：阳性比照的白目的是验证相应试验系统的反响，例如用有机锡作稳定剂的聚氯乙烯的阳性比照，酚的稀释液用于浸提液的阳性比照。
2）已用作固体材料和浸提液1)高密度聚乙烯可从美国药典委员会〔Rockvillie, Maryland, USA〕和Hatano 争论所食品和药品安全中心〔Ochiai 729-5 ,Hanagawa.257-Japan〕获得。
huvec小管生成实验方法
huvec小管生成实验方法HUVEC小管生成实验方法引言：HUVEC（人脐静脉内皮细胞）是一种常用的体外模型系统，用于研究血管生成和血管内皮细胞功能。
HUVEC小管生成实验是一种常见的方法，用于评估血管形成的能力和细胞迁移的能力。
本文将介绍一种常用的HUVEC小管生成实验方法及其步骤。
材料与试剂：1. HUVEC细胞系：通过细胞培养技术获得。
2. 培养基：使用适合HUVEC细胞培养的培养基，如DMEM/F12。
3. 培养皿：使用96孔板或24孔板。
4. 载玻片：用于观察和分析小管生成。
5. Matrigel：一种基质蛋白，用于模拟细胞外基质环境。
实验步骤：1. HUVEC细胞的培养a. 将HUVEC细胞解冻并在培养基中孵育。
b. 细胞密度达到80-90%时，用PBS洗涤细胞。
c. 使用细胞消化酶（如胰酶）消化细胞。
d. 将细胞重新悬浮在培养基中，并计数细胞数目。
2. Matrigel涂层a. 在载玻片上滴加2-3滴Matrigel。
b. 使用移液器均匀涂覆整个载玻片表面。
c. 在37摄氏度下孵育30分钟至凝胶化。
3. 细胞接种a. 将预定细胞数目的HUVEC细胞悬浮在培养基中。
b. 将细胞悬浮液加入预先涂有Matrigel的孔板孔中。
c. 将培养皿放置在37摄氏度的细胞培养箱中，孵育24-48小时。
4. 观察和图像获取a. 使用显微镜观察HUVEC细胞在Matrigel上的小管生成。
b. 使用图像采集系统捕获并保存小管生成的图像。
5. 分析小管生成a. 使用图像处理软件对图像进行分析，包括测量小管长度、分支点数目等。
b. 统计和比较不同处理组的小管生成结果。
结果与讨论：通过HUVEC小管生成实验，可以评估细胞的血管生成能力。
实验结果显示，HUVEC细胞在Matrigel上能够形成分支的管状结构，模拟血管形成的过程。
小管长度和分支点数目可以作为评估血管生成能力的指标。
此外，通过比较不同处理组的结果，可以进一步研究各种因素对血管生成的影响。
细胞划痕实验操作步骤
细胞划痕实验，也称为伤口愈合实验，是一种用于研究细胞迁移和细胞间相互作用的体外实验方法。
以下是该实验的基本操作步骤：
1. 实验准备：
- 准备实验所需的仪器和试剂，包括细胞计数仪、台式离心机、CO2培养箱、倒置显微镜、移液枪、移液管、4℃和-20℃冰箱、6孔培养板等。
- 使用marker笔在6孔板背后划横线，每隔0.5~1cm一道，每孔至少穿过5条线，以便于后续观察和记录。
2. 细胞铺板：
- 选择处于对数生长期的细胞，使用胰蛋白酶消化成单细胞悬液。
- 将细胞接种于6孔培养板，接种密度应保证过夜后细胞融合率达到100%，每孔最终的培养基总量为2mL。
3. 细胞培养：
- 将接种好的细胞放入37℃、5% CO2培养箱中培养24小时。
4. 划痕操作：
- 第二天，使用PBS洗细胞2~3次，然后用移液枪（1ml枪头套200ul的枪头）垂直于6孔板划出直线，力度要均匀，不能倾斜，以保证划痕的一致性。
5. 洗涤和处理：
- 划痕完成后，再次用PBS洗细胞3次，去除漂浮的细胞。
- 根据实验设计，可以加入无血清培养基或其他处理药物。
6. 观察和记录：
- 在显微镜下拍照，记录0小时时各组细胞的照片。
- 将细胞放回培养箱继续培养，并在一定时间点（如24小时后）再次拍照记录，以观察细胞迁移情况。
需要注意的是，在进行细胞划痕实验时，保持操作的一致性和准确性非常重要，以确保实验结果的可重复性和可靠性。
此外，实验过程中应注意无菌操作，避免细胞污染。
通过比较不同时间点的细胞迁移情况，可以评估细胞的迁移能力以及药物或处理对细胞迁移的影响。
体外细胞刺激实验报告
一、实验背景随着现代生物技术的快速发展，体外细胞刺激实验在生物学研究、药物筛选、疾病诊断和治疗等领域发挥着越来越重要的作用。
本实验旨在探讨不同刺激条件下细胞生物学行为的改变，为相关研究提供实验依据。
二、实验目的1. 观察不同刺激条件下细胞形态、生长和增殖的变化；2. 分析细胞在刺激条件下的基因表达和信号转导变化；3. 为后续相关研究提供实验参考。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 细胞：人胚肾细胞系HEK293；- 刺激物：表皮生长因子（EGF）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、佛波酯（PMA）；- 药品与试剂：DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS缓冲液、抗细胞周期蛋白抗体、抗磷酸化细胞周期蛋白抗体、RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒、细胞计数试剂盒、流式细胞仪等。
2. 实验仪器：- 倒置显微镜；- 酶标仪；- 实时荧光定量PCR仪；- 流式细胞仪。
四、实验方法1. 细胞培养：将HEK293细胞接种于6孔板，置于细胞培养箱中培养至对数生长期。
2. 刺激处理：将细胞分为对照组、EGF组、TNF-α组和PMA组，分别加入相应浓度的刺激物处理细胞。
3. 观察细胞形态：使用倒置显微镜观察细胞形态变化。
4. 细胞计数：使用细胞计数试剂盒检测细胞生长和增殖情况。
5. 细胞周期分析：使用流式细胞仪检测细胞周期分布。
6. 基因表达分析：- RNA提取：使用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA；- 逆转录：使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA；- 实时荧光定量PCR：使用实时荧光定量PCR试剂盒检测目的基因的表达水平。
五、实验结果1. 细胞形态：与对照组相比，EGF组、TNF-α组和PMA组细胞形态发生明显变化，细胞变得扁平，部分细胞出现突起。
2. 细胞计数：与对照组相比，EGF组、TNF-α组和PMA组细胞数量明显增加，细胞增殖加快。
3. 细胞周期分析：与对照组相比，EGF组、TNF-α组和PMA组细胞周期分布发生改变，S期细胞比例增加。
γδT细胞 体外培养实验方案
γδT细胞体外培养实验方案一、前言γδT细胞是一群兼有固有免疫和特异性免疫双重特征T细胞，具有杀伤与调节的双重功能，在维持局部免疫稳态中发挥不可替代的作用[1]。
主要分布于黏膜（肠粘膜、蜕膜）和上皮组织（人宫颈上皮），在外周血中占CD3＋T细胞的1％～5％，在抗微生物感染、调节免疫应答和抗肿瘤免疫方面发挥着重要的作用[2]。
按T细胞受体（T cell receptor ，TCR）类型不同，可将T细胞分为αβT细胞和γδT 细胞。
γδT细胞培养时，易混杂较多αβT细胞，为分离γδT细胞带来困难。
文献报道妊娠期，γδT细胞是母一胎界面重要的T淋巴细胞。
人类妊娠早期蜕膜富含活化的完全分化的和促炎性的γδ细胞[3]。
正常妊娠的人类和小鼠的外周血与蜕膜局部γδT 细胞数量均明显增多，且蜕膜γδT细胞比例较外周血明显上升[4]。
蜕膜γδT细胞有利于维持母-胎免疫耐受状态，正常妊娠妇女的蜕膜γδT细胞数量明显高于未妊娠或妊娠失败的妇女；而且蜕膜γδT 细胞有利于蜕膜局部IL-10及TGF-β等细胞因子的合成[5]。
人的胎盘由羊膜、叶状绒毛膜（又称丛密绒毛膜）和底蜕膜（又称基蜕膜）组成[6]。
二、γδT细胞特点1.量少，与αβT细胞共存。
2.γδT细胞呈悬浮生长。
3.黏膜组织（肠粘膜、蜕膜）、上皮组织（人宫颈上皮）、支气管肺泡、外周血含量较丰富。
三、实验组织来源1.蜕膜组织取自医院流产术的正常妊娠妇女，来源多且不涉及伦理问题。
2.底蜕膜来源于胎盘组织，不涉及伦理问题。
四、培养方法1.单个核细胞加入诱导因子（IL-2、IL-7、唑来膦酸）分化14-21天。
（诱导因子浓度1µmol/L唑来膦酸，400 IU/mL IL-2）2.直接分选γδT细胞，进行增殖培养。
五、从组织提取细胞方法1.组织切碎，胶原蛋白酶消化，过筛。
缺点：步骤较多易导致细胞死亡，活性细胞数量下降，细胞表面蛋白选择性丢失。
2.机械分解优点：可避免选择性细胞死亡或表面蛋白的选择性丢失。
最新毒理学实验报告
最新毒理学实验报告实验目的：本实验旨在评估新型化合物X的潜在毒性，通过一系列体内和体外实验，确定其对哺乳动物细胞的影响，并为其安全性评估提供科学依据。
实验方法：1. 体外细胞毒性测试：- 使用人类肝癌细胞株HepG2和非洲绿猴肾细胞株Vero进行体外细胞毒性测试。
- 将细胞分为不同浓度的化合物X处理组和对照组。
- 通过MTT法测定细胞存活率，评估化合物X的半数致死浓度（LC50）。
2. 体内急性毒性测试：- 选择SPF级小鼠进行实验，分为高、中、低剂量组和对照组。
- 通过灌胃给药，观察7天内的动物生存率、体重变化和行为反应。
- 在实验结束后，对小鼠进行解剖，观察主要器官的宏观病理变化。
3. 遗传毒性测试：- 采用Ames试验评估化合物X对沙门氏菌的致突变性。
- 进行染色体畸变试验和骨髓微核试验，评估其对哺乳动物细胞染色体的影响。
实验结果：1. 体外细胞毒性测试显示，化合物X对HepG2细胞的LC50大于1000μg/mL，对Vero细胞的LC50大于800μg/mL，表明其在测试浓度范围内对这两种细胞株的毒性较低。
2. 体内急性毒性测试中，小鼠在给药后7天内未观察到明显毒性反应，生存率100%。
解剖结果显示，各剂量组小鼠的主要器官未见明显病理变化。
3. 遗传毒性测试中，Ames试验结果为阴性，表明化合物X不具备致突变性。
染色体畸变试验和骨髓微核试验也未发现显著的遗传毒性效应。
结论：根据本次实验结果，化合物X在测试的剂量范围内显示出较低的细胞毒性和遗传毒性。
然而，为了全面评估其安全性，建议进行更长期的慢性毒性和致癌性研究。
此外，应考虑进行生态毒性评估，以了解其对环境生物的潜在影响。
体外细胞培养的基本方法和技术
能够进行克隆培养的细胞一般只是一些活 力强、增殖能力强、对体外生长环境适应 性强的细胞。
八、微载体细胞培养法
微载体细胞培养法是一种是用于培养贴壁 依赖性细胞的大规模培养技术。
这种培养技术是在培养容器内加入培养液 及一种用对细胞无害的材料制成的颗粒 （微载体），使细胞在微载体表面覆着和 生长，通过不断的搅拌使微载体保持悬浮 状态的培养方法。
培养液中大量的微载体为细胞提供了极大 的生长表面，从而在培养容器体积不很大 的情况下，可培养大量的细胞。
第二节 原代培养
原代培养：从直接取自生物体细胞、组织 或器官开始的培养。 原代培养也叫初代培养，是从供体取得细 胞后在体外进行的第一次培养。 原代培养是建立各种细胞系的第一步，是 从事组织培养工作人员应熟悉和掌握的最 基增殖而产生一个子细胞群的过程。
克隆培养法也可以称作为单细胞分离培养法， 就是从细胞悬浮液中获得的单个细胞用于培 养，使之分裂增殖而产生一个细胞群的方法。
克隆培养不同于普通的原代培养或传代培 养，他强调培养产物的单一性而排除异质 性，所获得的培养产物为遗传特性几乎完 全相同的纯细胞系即细胞株。
所谓旋转管培养法，就是将所培养的组织 细胞接种在一管状培养器皿，再将旋转管 固定在一个可旋转的装置上边旋转边培养 的一种培养方法。
旋转管培养法的最大优点，随着旋转管的 转动，所培养的组织细胞浆交替接触到培 养液和气体环境。有利于培养物的生长。
五、培养板培养法
培养板培养法过去曾被称为微量培养法，是 现代体外培养技术中最为普遍应用的常规培 养方法之一。
二倍体细胞培养法并不是一种专门的培养技术
体外抗体形成细胞检查法(溶血空斑实验 PFC)(Plaque forming ce
体外抗体形成细胞检查法（溶血空斑实验 PFC）(Plaque forming cePFC测定技术又称溶血空斑试验。
是一种体外检测单个抗体形成细胞（浆细胞）的方法。
自从1963年 Jerne和Nordin首先建立PFC测定技术以来,使免疫学方法得到很大的发展。
特别是间接溶血空斑测定法的建立，更扩大了本实验的应用范围。
它不仅可以测定产生 IgM 类的抗体产生细胞，而且还可以检测产生其他各类免疫蛋白及其亚类的抗体形成细胞。
它不仅可以作为免疫基本理论研究的有力工具，而且还可以作为临床筛检抗肿瘤新药以及研究中药对机体免疫功能的影响（免疫增强剂和免疫抑制剂）的特异指标。
溶血空斑试验分直接溶血空斑试验和间接溶血空斑试验。
前者是为测定产生 IgM 型抗体的细胞。
因为活化补体的能力强，可以不必另加抗Ig 试剂（显斑剂），也就是只加细胞和补体即可出现空斑，故称直接溶血空斑测定。
至于产生其他类型抗体的（如 IgG 或 IgA 等）细胞检测，就需要在试验系统中另加显斑剂（因为这些类别的抗体活化补体的能力弱）也就是加靶细胞和抗各类 Ig 高纯度的抗血清（系指用高浓度的抗原制备的抗血清）再加补体才能出现可见的空斑，故称间接溶血空斑测定。
小鼠脾PFC测定方法，经多次改进使本法的敏感度不断提高。
目前所用的方法分为：琼脂固相法和小室液相法。
其基本原理是将经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与一定量的绵羊红细胞（靶细胞）混合，在补体参与下，使抗体形成细胞周围结合了抗体分子的羊红细胞溶解形成肉眼可见的溶血空斑。
一琼脂固相法[实验材料]（1）玻璃器皿（7X1.5 厘米）（2）1毫升注射器和青霉素小瓶（3）水浴(47-49℃ )（4）Hanks'液（5）胎牛血清(56℃30分钟灭活,并经羊红细胞吸收)（6）琼脂或琼脂糖(表层基0.7%;底层基1.4%;用Hanks'液配制 ) （7）右旋糖酐(DEAE-dxtran分子量50万,用蒸馏水配置10毫克/毫升). （8）抗-Ig血清(测定间接空斑用)（9）20%绵羊红细胞悬液(Hanks'液配制)（10）补体:新鲜豚鼠血清(用前经绵羊红细胞吸收)[试验方法]（1）将溶化的底层琼脂倾注平皿形成一薄层, 将其凝固,备用。
体外证明细胞间通讯的方法
体外证明细胞间通讯的方法
以下是 6 条关于体外证明细胞间通讯的方法：
1. 染料示踪法呀！就像我们给细胞染上特别的颜色，然后看它怎么“跑”到其他细胞那里去，这多神奇呀！比如让一个细胞染上绿色，然后哇塞，眼睁睁看着绿色慢慢扩散到周围细胞呢！
2. 电生理记录法也很不错呀！就好像给细胞装上了“窃听器”，偷听它们之间的电信号交流呢！你想想，像不像是在听细胞们悄悄“讲悄悄话”？比如记录神经元之间的电信号传递，那可真是太有意思啦！
3. 钙离子成像法哟！看着钙离子在细胞里的变化，就像是看着细胞们的“信号灯”闪烁呢！这难道不让人兴奋吗？就好比看着一群小精灵通过钙离子传递信息呢！
4. 蛋白质检测法呀！这就像是在追查细胞间的“秘密信件”呢，找那些传递信息的蛋白质，酷不酷？就像发现了细胞间传递的特殊“密码”一样呀！比如检测特定的信号蛋白在细胞间的变化。
5. 基因报告法呢！相当于给细胞装了个“小喇叭”，一旦有通讯就会“广播”出来呀！是不是超级厉害？就像看着舞台上的演员，一有动作灯光就会有反应一样！
6. 细胞共培养法嘛！把不同的细胞放在一起，看它们怎么互动，这就像是让不同性格的人聚在一起，会产生各种奇妙的反应呀！比如说观察两种细胞在共培养时的相互影响，真的太让人期待啦！
我觉得这些方法都各有各的奇妙之处，都能让我们更好地了解细胞间通讯这个神秘又有趣的世界呀！。
体外细胞因子释放实验流程
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细胞迁移实验步骤
细胞迁移实验步骤
细胞迁移实验是用来研究细胞在体外条件下迁移能力的实验。
以下是一般的细胞迁移实验步骤：
1. 细胞准备：选择适当的细胞系，通常是癌细胞，培养并扩增足够数量的细胞。
2. 细胞处理：将培养的细胞收集并洗涤，然后根据实验设计的需要，对细胞进行处理，例如加入药物或改变培养基的成分。
3. 迁移装置准备：选择适当的迁移装置，常用的装置有Transwell孔板、Boyden腔等。
按照装置说明进行处理，包括涂覆底部或孔板上的基质和适当的培养基添加。
4. 细胞种植：将处理后的细胞悬浮液加入迁移装置的上室或腔室中，适量加入培养基，然后安放在培养箱中，将细胞孵育一段时间，让细胞附着。
5. 孵育及迁移：将孵育的细胞装置放置在恒温培养箱中，培养所需的时间，等待细胞在上室中迁移至下室。
迁移时间会根据细胞系的不同而有所变化。
6. 细胞固定：迁移结束后，取出迁移装置，将上室液中的细胞去除，固定细胞样本。
常用的固定方法包括用甲醛或甲醋酸乙酯等进行固定。
7. 细胞染色：固定好的细胞样本可以进行染色，例如使用吉姆
萨或其他染色剂对细胞进行标记，以便于观察和计数。
8. 细胞观察与分析：使用显微镜观察细胞迁移的结果。
可以计数迁移至下室的细胞数量，或者通过图像分析软件对细胞迁移的面积或距离进行定量分析。
9. 数据处理与统计分析：根据实验结果，进行统计分析，比较不同处理组之间的差异。
可以使用统计学方法进行数据分析，例如t检验或方差分析。
10. 结果解读与报告：根据实验结果进行结果解读，并将实验内容、方法和结果撰写成科学论文或实验报告。
体外b细胞激活实验原理
体外b细胞激活实验原理体外B细胞激活实验是一种常用的实验技术，用于研究B细胞的活化和免疫应答过程。
在这个实验中，研究人员通常会使用刺激物质来刺激B细胞，观察其活化程度和产生的免疫反应。
本文将介绍体外B细胞激活实验的原理及其应用。
体外B细胞激活实验的原理基于B细胞的特性和免疫激活机制。
B细胞是免疫系统中的一种关键细胞类型，负责产生和分泌抗体，参与体液免疫应答。
在免疫激活过程中，B细胞通过受体的识别和刺激，进而活化并产生抗体。
在体外B细胞激活实验中，研究人员通常会使用多种刺激物质，如抗体、细胞因子、细菌产物等，来模拟体内的免疫激活环境。
这些刺激物质可以与B细胞表面的受体结合，触发一系列信号传导通路，最终导致B细胞的活化和免疫反应的发生。
具体而言，体外B细胞激活实验的过程通常包括以下几个步骤：1. 准备B细胞：从动物或人体中分离出B细胞，可以通过细胞分离方法，如密度梯度离心或磁珠分离等。
2. 刺激B细胞：将分离得到的B细胞与刺激物质一起培养，以模拟体内的免疫激活过程。
常用的刺激物质包括抗体、细胞因子等，可以直接添加到培养基中，或者通过刺激细胞表面受体来触发信号通路。
3. 观察细胞活化：通过多种方法来判断B细胞的活化程度，如细胞增殖检测、细胞表面标记物的表达检测等。
细胞增殖检测可以使用MTT法、BrdU法等，而细胞表面标记物的表达检测可以使用流式细胞术等。
4. 检测免疫反应：观察B细胞是否产生抗体等免疫反应。
可以通过ELISA法、免疫荧光法等来检测分泌的抗体的浓度和特异性。
体外B细胞激活实验的应用非常广泛，可以用于研究B细胞活化和免疫应答的机制，评估某些疾病的免疫功能，筛选和评价新型药物的免疫调节活性等。
例如，研究人员可以利用体外B细胞激活实验来研究自身免疫疾病的发病机制，如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等。
同时，这种实验技术也可以用于评估免疫疫苗的效果，研究疫苗接种后产生的免疫应答。
总之，体外B细胞激活实验是一种重要的实验技术，通过模拟体内的免疫激活过程，研究B细胞的活化和免疫应答。
体外细胞试验的原理
体外细胞试验的原理
体外细胞试验是在离体状态下模拟生物体生长环境，检测医疗器械及生物材料接触机体组织后所发生的细胞溶解、抑制细胞生长和其他毒性作用的体外试验。
这些试验包括细胞增殖实验、流式细胞术检测细胞的周期和凋亡、细胞划痕实验以及克隆形成实验等。
细胞增殖实验是通过检测细胞增殖能力，评估材料或药物对细胞生长的影响。
流式细胞术可以检测细胞的周期和凋亡，反映细胞增殖速度以及细胞受到生长阻滞时的变化。
细胞划痕实验可以研究细胞在体外迁移的情况。
克隆形成实验则是测定细胞增殖能力的有效方法。
混合淋巴细胞反应原理
混合淋巴细胞反应(Mixed Lymphocyte Reaction，MLR)是一种体外实验方法，用于评估T细胞对抗原呈递细胞(如B细胞、树突状细胞等)的反应。
MLR的原理是将来自两个个体的淋巴细胞(称为刺激细胞和反应细胞)混合在一起，并添加到含有抗原的培养基中。
在这种情况下，刺激细胞会识别并结合到抗原上，然后激活反应细胞中的T细胞。
激活后的T细胞会分泌多种细胞因子，如干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等，这些细胞因子可以进一步激活其他免疫细胞，如巨噬细胞和自然杀伤细胞等，从而增强免疫应答。
通过测量反应细胞中IFN-γ的产生量，可以评估T细胞对抗原的反应强度。
在MLR中，如果两个个体之间的HLA匹配程度较高，则反应细胞中的IFN-γ产生量通常会更高。
这是因为HLA分子是T细胞识别抗原的主要分子，如果两个个体之间的HLA匹配程度较高，则T细胞更容易识别并结合到抗原上，从而产生更强的免疫应答。
体外细胞实验方法
细胞株在适当的培养基中保持10% FBS。
从Addgene(质粒)购买HA-FLAG-UCHL3。
#22564，然后再克隆到pGEX-4T-2载体(Clontech)中。
UCHL3C94A和S75A突变体由位点定向突变层积产生)。
抗uchl3抗体购自ProteinTech公司(12384 - 1 - ap)。
抗ub (P4D1)、抗rpa32 (9H8)、抗brca1 (D9)抗体购自Santa Cruz Biotechnology。
抗rad51 (N1C2)是从GeneTex购买的。
反γH2AX(05 - 636),anti-BRCA2(OP95)和anti-MDC1(05 - 1572)从微孔被购买。
Anti-BRCA2(推上a303国道- 435 a)和anti-γH2AX架a300型(- 081 a)从Bethyl购买实验室。
抗53bp1 (NB100-304)购自Novus Biologicals。
Anti-Flag(m2)、anti-HA anti-β-actin抗体购买的σ。
反磷（血清/thr）atm/atr衬底抗体（2851）是从细胞信号技术中购买的。
CRISPR / Cas9敲除(sgRNAs)使用:sgUCHL3-1(5′-GCCGCTGGAGGCCAATCCCGAGG-3′)和sgUCHL3-2(5′-GCCCCGAAGCGCGCCCACCTCGG-3′)。
gRNA序列被克隆到载体中。
LentiCRISPR-V2-puro。
细胞被慢病毒感染sgRNA-puro随后与2μg /毫升嘌呤霉素广泛的选择,和单一的克隆是通过连续稀释和放大。
通过免疫印迹鉴定克隆抗uchl3抗体，并通过DNA测序验证。
重组蛋白表达和下拉试验。
构建表达His-RAD51和GSTUCHL3蛋白的质粒，构建RAD51和UCHL3的编码序列被亚克隆为pET-32a和pGEX-4T-2。
为了产生重组蛋白，每个表达结构都转化为大肠杆菌BL21 (DE3)。
体外细胞实验注意事项
体外细胞实验注意事项体外细胞实验是生物学研究中常用的一种手段，它可以帮助科研人员更好地了解细胞的功能和特性。
然而，进行体外细胞实验时需要注意一些事项，以确保实验结果的准确性和可靠性。
本文将介绍体外细胞实验中需要注意的几个关键点。
一、细胞培养基的选择在进行体外细胞实验之前，首先需要选择适合的细胞培养基。
不同类型的细胞需要不同的培养基，因此在选择培养基时需要根据实验所涉及的细胞类型进行选择。
此外，还需要注意培养基的配方和保存条件，以确保培养基的质量和稳定性。
二、细胞的处理和传代在进行体外细胞实验时，细胞的处理和传代是非常重要的环节。
在处理细胞时，需要注意操作的无菌性，以防止细菌和真菌的污染。
同时，传代时需要注意细胞的状态和密度，避免细胞过度生长或过度稀释。
三、细胞的处理和保存在进行体外细胞实验时，细胞的处理和保存也是需要注意的方面。
在处理细胞时，需要注意温度、pH值和氧气浓度等因素，以保持细胞的正常功能。
同时，在保存细胞时，需要选择适当的冷冻液和保存温度，以确保细胞的长期保存和恢复。
四、实验条件的控制在进行体外细胞实验时，实验条件的控制是非常重要的。
例如，温度、湿度和光照条件等因素都可能对细胞的生长和功能产生影响。
因此，在进行实验前需要对这些条件进行调整和控制，以确保实验结果的准确性和可重复性。
五、实验仪器的选择和使用在进行体外细胞实验时，合适的实验仪器的选择和使用也是十分重要的。
例如，培养箱、显微镜和离心机等仪器都需要根据实验的需要进行选择。
同时，在使用这些仪器时，需要按照操作手册进行正确的操作和维护，以确保实验的顺利进行。
六、实验数据的分析和解读在进行体外细胞实验时，实验数据的分析和解读是至关重要的。
科研人员需要使用恰当的统计方法对数据进行分析，以得出准确的结论。
同时，在解读实验结果时，需要考虑其他可能的因素，并进行合理的解释和讨论。
七、实验的伦理和安全问题在进行体外细胞实验时，科研人员还需要关注实验的伦理和安全问题。
细胞迁移实验步骤
细胞迁移实验步骤细胞迁移实验是一种用于研究细胞在体外条件下从一个区域迁移到另一个区域的实验方法。
这种迁移过程在生物学中具有重要的生理和病理意义，比如在胚胎发育、组织修复和癌症转移中都扮演着重要角色。
下面是一个通用的细胞迁移实验步骤，供参考。
1.细胞培养和预处理：-将需要研究的细胞株接入培养皿中，培养基的选择应根据细胞类型的需要确定。
一般常用维护培养基（如DMEM或MEM）。
-培养细胞至合适的密度，通常为80-90%的汇合度。
-预处理细胞：需根据实验的目的和所使用的细胞类型来确定预处理方法，比如处理细胞群体的化学物质、激素、蛋白酶等。
2.细胞迁移实验装置准备：- 选择合适的细胞迁移室装置，可根据具体实验目的选择合适的Transwell或Boyden室等。
-根据实验的需要，可以将迁移室上部的滤膜预先涂层，如使用胶原、纤维连接蛋白等。
预涂层可增加细胞迁移的效果或改变细胞的迁移行为。
-准备含有诱导或抑制细胞迁移的化学物质的培养基。
这种培养基可以放入迁移室的下部。
3.细胞迁移实验设置：-将含有预处理细胞的培养基将入培养皿中，用预处理细胞替换迁移室中培养基的下部，通常为迁移室的底部。
可以使用特殊的器械，如细胞刮板将细胞膜上的细胞刮入迁移室。
-将装有滤膜的迁移室放入含有化学物质的预涂层培养基中，确保滤膜完全被培养基润湿，避免空气泡。
-将培养皿放入培养箱中，设置适当的环境条件，如温度、湿度和气体浓度。
4.细胞迁移实验进行：-培养细胞在迁移室中的一定时间，时间通常根据实验目的而定。
大多数实验一般持续24至72小时。
-实验结束后，可以根据需要将迁移室取出，去除迁移室上的其他细胞，使迁移到滤膜的细胞易于检测。
-用适当的方法，如绉纸，小刷子等来清除迁移室顶部的细胞。
可用酒精或其他消毒剂杀灭残余的细胞。
5.细胞迁移结果观察和分析：-检测迁移到滤膜上的细胞数量和性质。
可以使用荧光显微镜观察染色的细胞或使用色素（如水蓝）来计数细胞。
格里菲斯体外转化实验过程
格里菲斯体外转化实验是一种常用的分子生物学技术，用于将外源DNA导入到细菌细胞中。
这种方法是由赫伯特·W·格里菲斯于1928年首次描述的，后来被称为“格里菲斯实验”。
以下是格里菲斯体外转化实验的基本步骤：1.准备接受细胞：首先，需要选择合适的宿主细胞，通常使用大肠杆菌（Escherichia coli）等细菌。
这些细菌通常是在培养基中生长并具有较高的转化效率。
2.制备DNA样品：接下来，需要准备含有外源DNA的样品。
这些DNA样品可以是纯化的质粒DNA、线性化的DNA片段或基因组DNA。
DNA样品通常在实验室中通过DNA提取、PCR扩增等方法获得。
3.制备质粒DNA：如果使用质粒DNA作为外源DNA，需要将质粒DNA经过适当的处理（如线性化）以提高转化效率。
4.转化实验：将目标细菌细胞与外源DNA混合，并将其暴露于特定的条件下，使DNA能够进入细胞内。
通常，这个过程需要通过热激冲（heat shock）、电穿孔（electroporation）或化学法（如钙离子诱导法）等方法来实现。
5.恢复生长：转化后的细菌需要在适当的培养条件下进行恢复生长，以使转化的DNA在细菌中复制和表达。
这通常涉及将细菌转移到富含培养基的琼脂平板上进行培养。
6.筛选与鉴定：为了确定转化是否成功，通常会使用选择性培养基或基因标记来筛选转化细胞。
成功的转化通常会导致表达外源基因或表型改变，可以通过PCR检测、酶切分析、蓝白斑筛选等方法来鉴定。
总的来说，格里菲斯体外转化实验是一种常用的方法，用于将外源DNA导入到细菌细胞中，并使其在细菌中复制和表达。
通过这种方法，研究人员可以研究基因功能、基因调控、蛋白表达等多个方面的生物学问题。
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细胞株在适当的培养基中保持10% FBS。
从Addgene(质粒)购买HA-FLAG-UCHL3。
#22564，然后再克隆到pGEX-4T-2载体(Clontech)中。
UCHL3C94A和S75A突变体由位点定向突变层积产生)。
抗uchl3抗体购自ProteinTech公司
(12384 - 1 - ap)。
抗ub (P4D1)、抗rpa32 (9H8)、抗brca1 (D9)抗体购自Santa Cruz Biotechnology。
抗rad51 (N1C2)是从GeneTex购买的。
反
γH2AX(05 - 636),anti-BRCA2(OP95)和anti-MDC1(05 - 1572)
从微孔被购买。
Anti-BRCA2(推上a303国道- 435 a)和
anti-γH2AX架a300型(- 081 a)从Bethyl购买实验室。
抗53bp1 (NB100-304)购自Novus Biologicals。
Anti-Flag(m2)、anti-HA anti-β-actin抗体
购买的σ。
反磷（血清/thr）atm/atr衬底抗体（2851）是从细胞信号技术中购买的。
CRISPR / Cas9敲除
(sgRNAs)使用:sgUCHL3-1(5′-GCCGCTGGAGGCCAAT
CCCGAGG-3′)和sgUCHL3-2(5′-GCCCCGAAGCGCGCCC
ACCTCGG-3′)。
gRNA序列被克隆到载体中。
LentiCRISPR-V2-puro。
细胞被慢病毒感染
sgRNA-puro随后与2μg /毫升嘌呤霉素广泛的选择,和单一的克隆是通过连续稀释和放大。
通过免疫印迹鉴定克隆
抗uchl3抗体，并通过DNA测序验证。
重组蛋白表达和下拉试验。
构建表达His-RAD51和GSTUCHL3蛋白的质粒，构建RAD51和UCHL3的编码序列
被亚克隆为pET-32a和pGEX-4T-2。
为了产生重组蛋白，每个表达结构都转化为大肠杆菌BL21 (DE3)。
总之,在LB培养基培养细菌在37°C到1.2(OD600)和冷却30分钟在冰上。
然后细胞连续培养15 h在18°C添加0.8毫米isopropyl-b-D-hiogalactopyranoside之后(IPTG)。
细胞
然后用超声波提取和裂解。
细胞溶解产物
用16000g离心30min，得到的上清液与他的Mag Sepharose Ni (GE Healthcare)孵育，纯化His- rad51蛋白和GSH珠(Promega)，纯化
分别是GST和GST- uchl3蛋白。
体外GST-UCHL3拉试验,50µg重组GST和GST-UCHL3蛋白质绑定到谷胱甘肽珠子被5% BSA 在4°C 2 h其次是孵化与50µg His-UCHL3额外2 h在4°C。
然后用不同盐浓度的NETN缓冲液冲洗5次。
结合蛋白被筛选了1×SDSPAGE缓冲与加热10分钟在95°C。
用单克隆抗his 抗体检测His-RAD51，用Coomassie blue染色GST-UCHL3
体内变性去泛素化实验和体外脱泛素化实验
对于体内去泛素化实验，控制U2OS细胞，UCHL3敲除U2OS细胞，或UCHL3敲除
U2OS细胞稳定表达HA-UCHL3野生型和突变Cys95阿拉巴马州(CA突变)在120年被细胞溶解μL 62.5毫米Tris-HCl(pH值6.8),2% SDS、10%甘油,20毫米NEM,1
毫米碘乙酰胺;煮15分钟;用含有蛋白酶抑制剂的NETN缓冲液、20mm NEM和1mm 碘乙酰胺进行测定10次;然后离心分离细胞碎片。
细胞提取物的免疫沉淀与指示抗体和涂抹抗ub抗体。
为了制备大量泛素化蛋白作为体外脱泛素实验的底物，HEK293T细胞与Myc-RAD51和His-Ubexpression载体一起转染。
在变性条件下，用他的珠子从细胞提取物中纯化泛素蛋白。
接下来，用Ub-RAD51蛋白从细胞提取物中纯化抗myc -琼脂糖颗粒在裂解缓冲液(50mm Tris-HCl pH)中7.8, 137毫米NaCl, 10毫米NaF, 1毫米EDTA, 1% Triton X-1000.2%萨科齐，1mm DTT, 10%甘油，新鲜蛋白酶
抑制剂)。
重组GST-UCHL3和UCHL3 CA在BL21细胞中表达，按照标准方案纯化。
deubiquitination测定体外,ubiquitinated蛋白质是孵化与重组UCHL3 eubiquitination缓冲区(50毫米Tris-HCl pH值8.0,50 mM氯化钠,EDTA 1毫米,10毫米德勤,5%甘油)4 h 30°C。
芯片
通过转染I-SceI表达质粒，在U2OS DR-GFP细胞中诱导单个DSB。
转染后24小时，细胞在室温下用1%甲醛固定10分钟，将蛋白质与DNA交联。
加入甘氨酸(0.125 M) 5分钟，停止交联。
细胞被收获,颗粒在细胞裂解缓冲resuspended(5毫米管道(KOH)在pH 值8.0,85毫米氯化钾,0.5% NP-40)亮抑酶肽1μg /毫升,1μg /毫升抑肽酶,1
毫米PMSF。
核在2000克的离心作用下，5分钟内被离心分离，然后在核溶解缓冲中重新悬浮（50 mM Tris在pH.1，10毫米EDTA，1%SDS，1 g/mL，1 g/mL aprotinin，1毫米PMSF），并将染色质切成平均大小为0.6 kb的染色质。
用三文鱼精子DNA/蛋白-琼脂糖浆液预先清除裂解物。
每个上清液的10%作为输入控制，并通过交联反转步骤进行处理。
其余的上层清液与5μg孵化表示抗体在一夜之间在4°C。
珠被洗了四次:一次在高盐缓冲(50毫米Tris-HCl pH值8.0,500毫米氯化钠,0.1% SDS、脱氧胆酸盐
0.5%,1% NP-40,1毫米EDTA),在氯化锂缓冲区(50毫米Tris-HCl pH值8.0,250毫米氯化锂,NP-40 1%,0.5%脱氧胆酸盐,1毫米EDTA),和两次TE缓冲(10毫米Tris-HCl pH值8.0,1毫米EDTA,pH值8.0)。
然后在洗脱缓冲液(1% SDS, 0.1 M NaHCO3)中重新悬浮，在室温下旋转20分钟。
洗脱样品孵育0.2 M
氯化钠一夜之间在65°C到反向交联。
样本
孵化与核糖核酸酶为30分钟37°C其次是蛋白酶K 1 h在37°C。
然后使用PCR清理试剂盒对DNA进行纯化，并用于定量PCR分析。
芯片的PCR引物,∼220个碱基对远离I-SceI削减网站如下:向前,5′-GAGCAAGGGCGAGGAGCTGT 3′;和反向
5′-CCGTAGGTCAGGGTGGTCAC-3′。
HR分析
我们使用来自Maria Jasin博士(纪念斯隆凯特琳癌症中心)的U2OS DR-GFP细胞，通过CRISPR系统产生控制或UCHL3敲除U2OS DR-GFP细胞系。
将ISceI表达载体(pCBA-I-SceI)转染到细胞中。
在I-SceI转染后2 d采集细胞，并使用流式细胞术检测I-SceI消化诱导的重组。
采用pEGFP-C1平行转染法对转染效率进行归一化处理。
统计数据
对于细胞存活试验和HR试验，数据提出了均值±SEM的三个独立的实验。
对于焦点形成分析，提出了数据作为三个独立的均值±SEM。
每项实验计数超过200个细胞。
统计分析采用t检验、方差分析或log-rank检验。
图中有1个星号表示P < 0.05, 2个星号表示P < 0.01。