蟾蜍的坐骨神经—腓肠肌标本的制备

蟾蜍的坐骨神经—腓肠肌标本的制备
及神经干的性质实验报告
实验名称蛙的坐骨神经—腓肠肌标本的制备及神经干的性质实验
目的要求
学习并掌握坐骨神经—腓肠肌标本以及腓肠肌标本制备的方法；
学习生理学实验基本的组织分离技术；
观察刺激强度，刺激频率与肌肉收缩反应的关系；
掌握引导神经干复合动作电位和测定其传导速度的基本原理和方法。

实验材料，仪器，试剂
蟾蜍、常用手术器械（手术剪、手术镊、手术刀、金冠剪、眼科剪、眼科镊、玻璃分针等）、烧杯、培养皿、纱布、棉线、粗剪刀、蛙板、污物缸、滴管、生理信号采集系统、张力传感器、铁架台、计算机、任氏液等。

实验原理
两栖类动物的一些基本生命活动和生理功能与温血动物相似，而其离体组织所需要的生活条件比较简单，易于控制和掌握。

因此在生理实验中常用蟾蜍的神经肌肉标本来观察兴奋性、兴奋过程、刺激的规律以及骨骼肌收缩的特点等。

任氏液是—种比较接近两栖动物内环境的液体，可以用来延长青蛙心脏在体外跳动时间、保持两栖类其他离体组织器官生理活性等。

腓肠肌由许多的纤维组成，刺激腓肠肌时，不同的刺激强度会引起肌肉的不同反应。

当刺激强度过小时，不应期肌肉发生收缩反应，此时的刺激为阈下刺激。

而能引起肌肉发生收缩的最小刺激强度，为阈刺激，但全部肌纤维同时收缩时，则出
现最大的收缩反应。

这时，即使再加大刺激强度，肌肉的收缩强度也不会随之而增大。

可以引起肌肉发生最大收缩反应的最小刺激强度为最适刺激。

肌肉组织对于一个阈上强度的刺激，发生一次迅速地收缩反应，即单收缩。

单收缩的过程分为三个时期，潜伏期、收缩期、舒张期。

刺激坐骨神经能引起腓肠肌产生收缩。

在其他条件不变情况下，不断增大刺激频率可引起肌肉收缩形式发生改变。

若刺激频率较小，两次刺激间隔时间大于一次肌肉收缩和舒张所持续的时间（即单收缩）时，肌肉收缩表现为一连串的单收缩；若增大刺激频率，使两次刺激间隔时间大于一次肌肉收缩的收缩期时间，而小于单收缩时，肌肉呈现不完全强直收缩；若继续增加刺激频率，使两次刺激间隔时间小于一次肌肉收缩的收缩期时间，肌肉则表现出完全强直收缩。

如果两个引导电极置于兴奋性正常的神经干表面，兴奋波先后通过两个电极处，便引导出两个方向相反的电位波形，称为双相动作电位。

如果两个引导电极之间的神经纤维完全损伤，兴奋波只通过第一个引导电极，不能传至第二个引导电极，则只能引导出一个方向的电位偏转波形，称为单相动作电位。

神经干由许多神经纤维组成，故神经干动作电位与单根神经纤维的动作电位不同，神经干动作电位是由许多不同直径和类型的神经纤维动作电位叠加而成的综合性电位变化，称复合动作电位，神经干动作电位幅度在一定范围内可随刺激强度的变化而变化。

动作电位在神经干上传导有一定的速度。

不同类型的神经纤维传导速度不同，神经纤维越粗则传导速度越快。

测定神经冲动在神经干上传导的距离（s）与通过这段距离所需时间（t），可根据n＝s/t求出神经冲动的传导速度
实验方法
1.破坏脑和脊髓左手持蟾蜍，用食指压其头部前端，使头前俯。

右手持探针
由头端沿正中线向后划，触到凹陷即为枕骨大孔，将探针由此垂直刺入。

再将探针折向前方，插入颅腔内并左右搅动捣毁脑组织。

再将探针退回至进针处，针尖转向后方，刺入椎管捣毁脊髓。

此时蟾蜍四肢瘫软，表明脑脊髓已完全破坏。

2.剪除躯干上部及内脏用粗剪刀在骶髂关节水平以上1cm处剪断脊柱。

左手握住后肢，右手持剪刀沿脊柱的断口向下剪开两侧的皮肤及肌肉，再剪除已下垂的躯干上部及内脏。

3.剥皮剪掉肛门周围的皮肤，左手捏脊柱断端（勿触碰神经），右手捏住断端边缘的皮肤，向下剥掉两后肢皮肤。

将标本背位放于表面有少许任氏液的蛙板上，洗净双手及用过的器械。

4.游离坐骨神经沿脊柱两侧用玻璃分针分离坐骨神经，沿中线将脊柱剪成两半。

捏住两侧下肢带骨用力向两侧掰，使耻骨联合处脱臼，再从耻骨联合中央剪开两后肢，一后肢放入盛有任氏液的平皿中备用，一后肢用玻璃分针划开梨状肌及其附近的结缔组织，循坐骨神经沟（股二头肌与半膜肌之间的裂隙处）找出坐骨神经的大腿部分，用玻璃分针将腹部的坐骨神经小心勾出来，手执结扎神经的线，剪断坐骨神经的所有分支，一直游离至膝关节。

5.完成坐骨神经腓肠肌标本的制备将分离干净的坐骨神经搭于腓肠肌上，在膝关节周围剪掉全部大腿肌肉，并用普通剪刀将股骨刮干净，在股骨中部剪去上段股骨。

再在跟腱处以线结扎，剪断并游离腓肠肌至膝关节处，在膝关节以下将小腿其余部分剪掉。

这样即制得附着于股骨上、具有坐骨神经支配的腓肠肌标本。

6.用标本进行刺激实验把标本通过张力传感器与生理信号采集系统相连，观察刺激强度，刺激频率与肌肉收缩反应的关系以及神经干的相关性质。

实验结果
1.蟾蜍腓肠肌刺激强度与肌肉收缩反应实验
图1 蟾蜍腓肠肌刺激强度与肌肉收缩反应的关系
如图1所示，在一定范围内随着刺激强度的增加，肌肉收缩反应强度逐渐增大，但在增大到一定值时肌肉收缩反应的强度不再受刺激强度的影响而发生变化。

从图中我们可以看出该标本的阈值是0.050V，阈上刺激范围为0.050V-0.110V。

当刺激为0.110V时，肌肉收缩反应强度也达到最大，也即该实验标本的最适刺激强度为0.110V。

2. 蟾蜍腓肠肌刺激频率与肌肉收缩反应实验
图2 蟾蜍腓肠肌刺激频率与肌肉收缩反应的关系
如图2所示，在刺激电压固定在0.50V时，分别以不同频率的刺激去刺激标本，肌肉收缩反应有很大不同。

在刺激频率为1.0Hz时,肌肉标本的收缩形式为单收缩；当刺激频率在8.0Hz-20Hz时，收缩形式为不完全强直收缩；当刺激频率大于20Hz 时，肌肉收缩为完全强直收缩。

3.神经干复合动作电位的测定实验
图3 蟾蜍坐骨神经神经干的复合动作电位
如图3所示，复合动作电位的波形图呈现出一个先升后降的波形图，复合动作电位的最大值为4.83mV,最小值为-1mV。

当神经纤维未受刺激时，膜外与电极所接触的两点之间没有电位差，所以两电极之间也无电位差存在，扫描线为一水平基线。

在神经干左端给予电刺激后，则产生一个向右传导的冲动（负电位），当冲动传到1电极（负电极）下方时，此处电位较2处为低，产生了电位差，扫描线向上偏转，记录出一个向上的波形（在电生理实验中，为了便于观察，习惯上规定负波向上）。

随后，冲动继续向右侧传导，离开1电极传向2电极处。

当它到达2电极（正电极）
下方时，因1电极处神经差不多已恢复到原来的状态，于是2电极处又较1电极处为负，引起扫描线向下偏转，记录出一个向下的波形。

这样，在神经冲动向右传导的过程中，就记录出了一个先升后降的双相动作电位。

4.神经干兴奋传导速度的测定实验
图4 蟾蜍坐骨神经神经冲动传导速度的测定如图4所示，红色代表第一电极，绿色代表第二电极。

每刺激一次，第二个刺激即按照“间隔”所设定的时间向第一个刺激靠近一次，从而使第二个动作电位向图形向第一个动作电位相应靠近。

当在刺激6.5ms时，第二个动作电位的图形幅值开始比第一个减小时，说明第二个刺激落入到第一次兴奋后的相对不应期。

第二个刺激越是靠近第一个刺激，其动作电位的幅值就越小。

测得神经干兴奋传导速度约为24.0m/s。

分析讨论
由实验结果可知，实验中蟾蜍腓肠肌受刺激的阈值是0.050V，阈上刺激范围为0.050V-0.110V。

神经细胞的兴奋传递是由于膜内外的Na+和K+离子浓度变化儿引起的，膜上存在着许多的Na+和K+离子通道，它们都受一定电压门控系统控制着通道的开与闭。

在刺激的强度低于阈值时，不足以使门控通道开放，相对离子浓度不会发生变化。

故无法引起神经细胞兴奋，只有在强度足够大的时候，神经细胞才会兴奋并传导至肌肉。

细胞膜上的Na+和K+离子通道是有限的，给予一个最适刺激强度，Na+和K+离子通道将全部开放，神经达到最大兴奋。

若给予神经细胞更大的刺激强度，因为离子通道的限制，神经细胞也不可能出现更大的兴奋性。

单收缩可分为3个阶段：①潜伏期是指从发生刺激打刚开始发生张力变化之间的时期；②收缩期是指从收缩开始到收缩效应达到最高点的时期；③舒张期
是指从收缩效应最高点回复到原来静息水平的时期。

当刺激频率低时，肌肉发生一连串互不相连的单收缩，这是因为每个新刺激到来时，前一次刺激引起的单收缩已经结束。

于是，每个刺激都引起一次独立的收缩。

发生不完全强直收缩时，每次新的收缩都发生在前次收缩的舒张期中，肌肉则在自身尚处于一定程度的缩短或张力存在的情况下进行新的收缩，即发生了收缩总和。

我们便观察到了锯齿形肌肉收缩曲线图。

当刺激频率增大到一定的较高程度时，出现完全强直收缩，这是因为连续刺激时，后来的每个刺激都可能总是落在前一次收缩的缩短期结束之前，造成相继发生的肌肉收缩有可能在前一次收缩的缩短期结束之前或其顶点开始，于是各次收缩的张力或长度变化发生融合而叠加起来。

正常体内骨骼肌的收缩都是强直收缩。

神经干复合电位的传导速度受到多种因素的影响，首先是神经纤维的粗细，其次是纤维本身的性质，还有就是实验中标本的制备过程是否规范，神经是否受到严重损伤。

分离坐骨神经时，为避免过度牵拉神经，绝对不允许用手或金属镊子钳夹神经。

神经纤维尽可能分得长一些。

为防止神经干燥，失去生物活性，一段时间后，应该用滴管滴加任氏液使其保持湿润状态。