免疫亲和层析原理
免疫亲和层析 洗脱
免疫亲和层析洗脱免疫亲和层析洗脱（Immunoprecipitation Wash）免疫亲和层析洗脱是一种广泛应用于生物化学和分子生物学研究的技术，用于从复杂的混合物中富集和纯化感兴趣的蛋白质。
该方法基于抗体与特定抗原之间的高亲和力，能够高效地富集目标蛋白质，并去除其他非特异性结合的蛋白质。
一、原理免疫亲和层析洗脱的原理是通过结合目标蛋白质的抗体与具有亲和结合能力的固定基质相互作用，实现目标蛋白质的选择性富集。
免疫亲和层析的固定基质通常是具有高亲和力的抗体。
当样品中的目标蛋白质与固定在固定基质上的抗体结合时，非特异性蛋白质将被洗脱剂迅速冲洗掉，从而使目标蛋白质得到纯化。
二、实验步骤1. 制备固定基质：选择特异性的抗体，将抗体偶联在亲和基质上。
亲和基质可以是蛋白A/G，蛋白A/G结合的琼脂糖或其他具有高亲和力的基质。
2. 准备样品：样品可以是细胞裂解液、组织提取液、血清等含有目标蛋白质的混合物。
3. 加入固定基质：将制备好的固定基质与样品混合，使抗体与目标蛋白质结合。
4. 洗涤：用洗脱缓冲液反复洗涤固定基质，以去除非特异性结合的蛋白质和其他杂质。
5. 洗脱：用洗脱缓冲液洗脱目标蛋白质与抗体的结合，使目标蛋白质从固定基质上解离。
6. 分析：将洗脱得到的样品用于下游分析，如免疫印迹、质谱分析等。
三、优点和应用免疫亲和层析洗脱具有以下优点：1. 高亲和性：基于抗体与抗原之间的高亲和力，使得目标蛋白质能够高效结合和富集。
2. 特异性：通过选择性的抗体结合，能够将目标蛋白质从复杂的混合物中纯化，去除非特异性的蛋白质。
3. 灵活性：可以根据实验需求选择不同的抗体和固定基质，适应各种不同类型的目标蛋白质。
免疫亲和层析洗脱在生物化学和分子生物学研究中得到了广泛的应用，如：1. 蛋白质纯化：可用于从复杂的样品中富集纯化目标蛋白质，用于后续的研究和分析。
2. 蛋白质-蛋白质相互作用研究：通过免疫亲和层析洗脱的技术，可以富集与目标蛋白质相互作用的蛋白质，进一步研究蛋白质间的相互作用机制。
第7章 亲和层析
二、配体的选择
理想的配体应具有以下一些性质： 1) 配体与待分离的物质有适当的亲和力。亲和力太弱，待分 离物质不易与配体结合，造成亲和层析吸附效率很低。而且 吸附洗脱过程中易受非特异性吸附的影响，引起分辨率下降。 但如果亲和力太强，待分离物质很难与配体分离，这又会造 成洗脱的困难。总之，配体和待分离物质的亲和力过弱或过 强都不利于亲和层析的分离。应根据实验要求尽量选择与待 分离物质具有适当的亲和力的配体。
4) 配体自身应具有较好的稳定性，在实验中能够 耐受偶联以及洗脱时可能的的较剧烈的条件，可以 多次重复使用。
根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为 两类：特异性配体（specific ligand）和通用性配体 （general ligand）。 特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质等生 物大分子结合的配体。如生物素和亲和素、抗原和抗体、酶 和它的抑制剂、激素－受体等，它们结合都具有很高的特异 性，用这些物质作为配体都属于特异性配体。配体的特异性 是保证亲和层析高分辨率的重要因素，但寻找特异性配体一 般是比较困难的，尤其对于一些性质不很了解的生物大分子， 要找到合适的特异性配体通常需要大量的实验。
例如胰蛋白酶的天然蛋白质类抑制剂有胰脏蛋白酶 抑制剂（pancreatic trypsin inhibitor，PTI），卵粘蛋白 （ovomucoid）和大豆胰蛋白酶抑制剂（soybean trypsin inhibitor，STI）等，小分子抑制剂有苄脒 （benzamidine）、精氨酸和赖氨酸。这些抑制剂均可作 为亲和纯化胰蛋白酶的配基，但与酶的结合常数各不相同。 例如，STI与胰蛋白酶的结合常数达109L/mol以上，而对 氨基苄脒（p-aminobenzamidine）与胰蛋白酶的结合数约 为4×104L/mol（25℃）。
抗体纯化方法
抗体纯化方法1. 引言抗体是一类免疫蛋白，具有识别和结合特定抗原的能力。
在生物医学研究和临床应用中，纯化高质量的抗体是非常重要的。
抗体纯化方法可以去除杂质，提高抗体的纯度和活性，从而提高其应用效果。
本文将介绍几种常见的抗体纯化方法。
2. 凝胶过滤层析法凝胶过滤层析法是一种基于分子大小的纯化方法。
该方法利用不同孔径的凝胶过滤介质，将目标分子（如抗体）与较大分子（如蛋白质杂质）分离开来。
具体操作步骤如下：1.将含有目标抗体的混合物加入到预先平衡好的凝胶柱中。
2.使用缓冲液进行洗脱，使较大分子无法通过凝胶柱而流出。
3.目标抗体由于分子大小适中，能够通过凝胶柱被保留下来。
4.最后使用洗脱缓冲液将目标抗体从凝胶柱中洗脱出来，得到纯化的抗体。
凝胶过滤层析法的优点是简单易行，不需要特殊设备，且适用于各种规模的实验室。
但其缺点是分离效率较低，只能实现较为粗略的纯化。
3. 亲和层析法亲和层析法是一种基于生物分子之间特异性相互作用的纯化方法。
该方法利用抗体与抗原之间的特异性结合来实现目标抗体的纯化。
具体操作步骤如下：1.将含有目标抗体的混合物加入到预先包含特异性结合配体（如蛋白A、蛋白G等）的亲和层析柱中。
2.目标抗体与配体之间发生特异性结合。
3.使用洗脱缓冲液将非特异结合的组分洗脱掉。
4.最后使用洗脱缓冲液将目标抗体从亲和层析柱中洗脱出来，得到纯化的抗体。
亲和层析法具有高选择性和高效率的优点，能够得到高纯度的抗体。
但其缺点是需要特定的亲和剂和配体，成本较高。
4. 离子交换层析法离子交换层析法是一种基于生物分子表面电荷的纯化方法。
该方法利用目标抗体与离子交换柱中固定的离子之间的相互作用来实现纯化。
具体操作步骤如下：1.将含有目标抗体的混合物加入到预先平衡好的离子交换柱中。
2.使用缓冲液进行洗脱，使与固定离子相同电荷的分子无法通过离子交换柱而流出。
3.目标抗体由于表面电荷不同，能够通过离子交换柱被保留下来。
4.最后使用洗脱缓冲液改变pH或盐浓度等条件，将目标抗体从离子交换柱中洗脱出来，得到纯化的抗体。
生物医学亲和层析相互作用
生物医学亲和层析相互作用1概述亲和层析属于液相色谱,它是以共价偶联了亲和配体的介质为固定相来吸附或研究与其发生相互作用的分子。
亲和配体可以是蛋白分子、酶、抗体、抗原,也可以是一段DNA或RNA序列、仿生染料、酶的底物或抑制剂、小分子化合物(如药物或激素)等。
很多亲和配体具有很高的选择性,将偶联了配体的介质装在柱子中,可以很好的用于分离、检测或研究复杂样品中的目标分子。
亲和层析介质主要由三部分组成:配体、间隔壁、基质。
配体是决定亲和层析成功与否的一个重要因素。
根据配体的类型,可以将亲和层析进行分类,如凝集素亲和层析、硼酸盐亲和层析、免疫亲和层析、金属螯合亲和层析等。
在设计和使用亲和层析柱时,偶联配体所使用的基质的类型也很重要。
以琼脂糖或纤维素等多糖类物质为基质的亲和层析介质常用于样品预处理或者靶分子的分离纯化。
这种基质易于修饰和活化,有利于基质和配体的偶联,并且具有较好的物理化学稳定性,非特异性吸附少。
但是这种基质的机械性能较差,在使用时柱压不能太高,分辨率和效率相对于高压系统也较低。
对于高压液相亲和层析,可以使用二氧化硅颗粒或者整体柱材料为基质。
采用这种基质的亲和层析柱可以用于HPLC或与其他分析方法(如质谱)联合运用。
2亲和层析应用的常见方式首先,要选择合适的样品处理缓冲液以利于目标分子与配体的结合。
将处理好的样品上到亲和层析柱上,与配体无相互作用或作用弱的分子从柱子上穿出;然后通过更改流动相的pH或添加竞争剂,使目标分子与配体解离从而被洗脱下来。
根据目标分子的性质,可以通过紫外吸收、荧光、质谱等方法对其进行检测。
亲和层析的分离过程简单、快速,具有较高的选择性,广泛用于生物医学和药物分析中样品的分离和预处理。
另外,除了可以利用亲和层析的吸附作用来富集目标分子外,同样也可以利用亲和层析来去除样品中影响分析的分子。
如在蛋白组学的研究中,可以用亲和层析柱先去除白蛋白、IgG等高丰度蛋白,再研究低丰度蛋白。
亲和层析的原理
亲和层析的原理
生物分子与亲和层析介质上的配体通过共价键、范德华力、疏水力、静电力等作用发生生物学专一性结合形成复合物，共价链接在载体表面的功能团配体上。
蛋白质亲和层析技术通过目标蛋白质与配体间通过特异性亲和力吸附而达到分离纯化的目的，具有生物专一性的特点，纯化效率高。
亲和层析是一种根据生物分子之间的特异相互作用来分离蛋白的层析方法，如酶和底物、受体和配体、抗体和抗原。
这种作用是特异性的也是可逆的，通过这种可逆的结合和分离来达到蛋白纯化的目的。
亲和层析介质的特点
➤基于配体和分离物间的特异性亲和作用，分离选择性强，效果好，纯化倍数高。
➤能完成一步方法很难完成的分离，如变性和非变性的，功能不同的蛋白。
➤通常一步纯化就可达到>90%的纯度
➤速度快，操作简单。
抗体的提纯实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握抗体提纯的基本原理和方法。
2. 学习并掌握利用亲和层析法、盐析法等方法对抗体进行提纯。
3. 评估提纯效果，确保抗体纯度。
二、实验原理抗体是一种具有特异性的蛋白质，主要存在于血清、组织液等体液中。
抗体提纯的目的是去除抗体中的杂质，提高其纯度和活性。
常用的抗体提纯方法有亲和层析法、盐析法、离子交换层析法等。
亲和层析法：利用抗体与抗原之间的高亲和力，将抗体吸附在特异性抗原上，通过洗脱剂洗脱抗原，实现抗体与抗原的分离。
盐析法：利用盐离子对蛋白质溶解度的影响，通过调节溶液中的盐浓度，使抗体沉淀出来。
三、实验材料1. 实验试剂：抗体溶液、抗原溶液、亲和层析柱、盐析剂、离子交换层析柱、缓冲液等。
2. 实验仪器：离心机、分光光度计、移液器、培养箱、冰箱等。
四、实验步骤1. 亲和层析法（1）将抗体溶液过柱，用缓冲液平衡亲和层析柱。
（2）将抗原溶液加入亲和层析柱，使抗体与抗原结合。
（3）用洗脱剂洗脱未结合的抗原，收集抗体洗脱液。
（4）将抗体洗脱液离心，收集上清液。
2. 盐析法（1）将抗体溶液加入适量的盐析剂，调节盐浓度至抗体沉淀的适宜范围。
（2）静置一段时间，使抗体沉淀。
（3）离心收集抗体沉淀，用缓冲液溶解沉淀。
（4）检测抗体溶液的浓度和活性。
3. 离子交换层析法（1）将抗体溶液过柱，用缓冲液平衡离子交换层析柱。
（2）根据抗体带电荷性质，选择合适的离子交换层析柱。
（3）通过改变缓冲液的离子强度，使抗体吸附在层析柱上。
（4）用梯度洗脱剂洗脱抗体，收集抗体洗脱液。
（5）离心收集抗体洗脱液。
五、实验结果与分析1. 亲和层析法通过亲和层析法提纯抗体，得到纯度较高的抗体溶液。
通过SDS-PAGE电泳检测，抗体分子量与预期相符。
2. 盐析法通过盐析法提纯抗体，得到纯度较高的抗体溶液。
通过SDS-PAGE电泳检测，抗体分子量与预期相符。
3. 离子交换层析法通过离子交换层析法提纯抗体，得到纯度较高的抗体溶液。
免疫亲和层析及其在真菌毒素检测中应用
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免疫亲和层析原理
免疫亲和层析原理
免疫亲和层析是一种常用的分离纯化生物大分子的方法，主要用于分离和纯化蛋白质、抗体、病毒等生物大分子。
其原理基于抗原与特异性抗体之间的高亲和力结合，利用这种结合来实现目标分子的选择性捕获和纯化。
在免疫亲和层析中，通常将具有特异性结合能力的抗体固定在某种固相材料上，如琼脂糖、硅胶等。
待样品加入后，目标分子与抗体发生特异性结合，并被牢固地捕获在固相材料上。
随后通过洗涤、洗脱等步骤去除非特异性结合的污染物，最终得到高纯度的目标分子。
免疫亲和层析具有以下几个优点：
1. 高选择性：利用抗原与特异性抗体之间的高亲和力结合来实现目标分子的选择性捕获和纯化，能够有效地去除其他非目标成分。
2. 高灵敏度：由于免疫亲和层析使用高亲和力的特异性抗体，因此可以在非常低的浓度下检测目标分子。
3. 可重复性好：由于免疫亲和层析是一种高度标准化的技术，因此可以实现高度可重复的结果。
4. 操作简便：与其他分离纯化方法相比，免疫亲和层析操作简便，无需特殊设备和复杂步骤。
总之，免疫亲和层析是一种非常有效的生物大分子分离纯化方法，其原理基于抗原与特异性抗体之间的高亲和力结合。
通过固定特异性抗体在固相材料上，并利用特异性结合来实现目标分子的选择性捕获和纯化。
其具有高选择性、高灵敏度、可重复性好、操作简便等优点，在生物医学研究中得到了广泛的应用。
胶体金免疫层析技术原理
胶体金免疫层析技术原理胶体金免疫层析技术是一种常用的生物分析方法，其原理基于抗原与抗体之间的特异性结合。
在这种技术中，胶体金颗粒被用作标记物，以便在样品中检测特定的抗原或抗体。
胶体金颗粒是一种具有特殊化学和物理性质的纳米材料。
它们具有高度可控的形状和大小，并且表面易于修饰。
这使得它们成为生物学研究和诊断中广泛使用的标记物。
在胶体金免疫层析技术中，首先需要制备具有特异性结合能力的抗体。
这通常涉及到将目标分子（即要检测的抗原）注射到动物中，以刺激其产生相应的抗体。
然后从动物血清中提取这些抗体，并进行纯化和检验。
接下来，需要将这些抗体固定在固定相上。
通常使用聚合物或硅胶微球作为固定相。
这些固定相表面通常都含有活性基团，可以与抗体上的氨基酸或半胱氨酸等官能团发生化学反应，从而将抗体固定在固定相上。
然后，将这些固定相与样品混合，并加入胶体金颗粒。
这些胶体金颗粒表面通常都含有某种亲和剂，例如羧基、胺基或硫醇基等。
这些亲和剂可以与固定相表面上的活性基团发生化学反应，从而将胶体金颗粒与固定相结合。
当样品中存在目标分子（即要检测的抗原）时，它们会与固定相上的抗体结合。
这会导致在胶体金颗粒表面形成一层薄薄的抗原-抗体复合物。
由于胶体金颗粒具有特殊的光学性质，在紫外线或可见光照射下会呈现出明显的色泽变化。
因此，通过观察样品中是否存在红色或紫色条带，就可以判断样品中是否存在目标分子。
需要注意的是，在进行胶体金免疫层析技术时需要控制多个因素以确保准确性和稳定性。
其中一个重要因素是选择适当的抗原和抗体对。
必须确保它们之间具有高度特异性的结合能力，以避免误报和假阳性结果。
此外，还需要控制反应时间、温度和pH值等因素，以确保反应的可重复性和稳定性。
总之，胶体金免疫层析技术是一种简单、快速、灵敏和特异性高的生物分析方法。
它在生物学研究、医学诊断和环境监测等领域中得到了广泛应用。
亲和层析法原理
亲和层析法原理
亲和层析法的原理是基于生物分子之间的特异性亲和力进行分离的。
亲和层析的基本原理是利用生物分子间的亲和力，将一个分子固定在不溶性基质上，然后利用分子间的亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。
被固定在基质上的分子称为配体，配体和基质是共价结合的，构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。
在亲和层析时，首先选择与待分离的生物大分子有亲和力物质作为配体，例如分离酶可以选择其底物类似物或竞争性抑制剂为配体，分离抗体可以选择抗原作为配体等等。
然后将配体共价结合在适当的不溶性基质上，如常用的Sepharose-4B等。
通过适当的洗脱液将其从配体上洗脱下来，就得到了纯化的待分离物质。
由于很多生物大分子之间的这种差异较小，所以这些方法的分辨率往往不高。
亲和层析法的应用范围非常广泛，可以用于分离纯化各种生物大分子，如蛋白质、酶、抗体、激素等等。
由于亲和层析法的分离效果非常好，因此可以获得高纯度、高活性的生物大分子，在生物工程、生物制药等领域具有重要的应用价值。
如需更多信息，建议查阅相关文献或咨询生物学家。
第七章 亲和层析技术
第2章亲和层析1 亲和分离技术概论利用生物分子之间的专一性识别性或特定的相互作用的分离技术称为亲和分离技术。
在该技术中，亲和分离过程是通过引入亲和配基得以实现的（如图2-1）。
所谓亲和配基，是指具有对生物分子专一识别性或特异相互作用的物质。
将亲和配基固定在不同的介质上，可得到不同的亲合分离技术，如固定在层析介质上，达到专一性层析分离的技术称为亲和层析技术。
将亲和配基接在分离膜上，得到亲和膜分离技术。
图2-1：亲和分离过程的示意图生物分子之间的亲和识别包括抗体和抗原、酶和底物、激素和受体等之间的亲合作用，这些亲和作用属于生物专一性识别；此外，某些物质和生物大分子之间还有一些特异性作用，如染料和某些酶（特别是脱氢酶和激酶等），植物凝集素和糖蛋白，金属离子和蛋白质表面的组氨酸等之间的作用，都可以应用于亲和分离过程。
根据以上两种亲和作用的不同，可将亲和配基按其来源分为二类：生物特异性配基，如抗体、NAD、AMP等和拟生物亲和配基，如染料、金属离子等。
表2-1常见亲和层析的命名作用原理以及它们的相关应用的专一性识别或特异性作用，必须是可逆的。
(2)配基与被分离的生物大分子之间要有足够高的结合常数，能形成稳定的复合物；但同时结合又不能太强，当外界条件适当的改变，且不使待分离的目的大分子变性时，就可将复合分子解离，使目标分子和配基分离，同时亲和配基得以再生。
(3)能够进行一定的化学改性，易于固定在层析介质或其他分离介质上。
且固定到分离介质上之后，配基的专一性识别或特异性作用不发生明显的变化。
目前，亲和分离技术众多，命名方法也很多。
一般而言，常根据配基的名称和所使用技术的名称组合来命名，如固定化金属离子亲和膜技术、染料亲和层析等。
现将常用的亲和层析技术名称、原理和应用简单的列如表2-1：1.1 亲和配基在亲和分离技术中，亲和配基起着举足轻重的作用。
亲和配基的专一性和特异性，决定着分离纯化时所得产品的纯度，亲和配基与目标分子之间作用的强弱决定着吸附和解吸的难易程度，影响它们的使用范围。
抗体的纯化原理
抗体的纯化原理抗体的纯化是指从混合溶液中将目标抗体分离出来，并获得高纯度和高活性的过程。
纯化抗体的目的是为了获得足够纯度的抗体以进行进一步的研究和应用。
抗体的纯化过程通常包括以下几个步骤：1. 前处理：在样品中去除杂质物质，例如细胞碎片、核酸、亲和素等。
常用的方法包括离心、过滤和沉淀等。
2. 离子交换层析：采用离子交换树脂分离抗体。
离子交换树脂上带有正电荷或负电荷，可以与抗体的电荷相互作用，使抗体与其他组分分离。
常见的离子交换树脂有DEAE（二乙氨基乙基）和CM（羧甲基）等。
3. 亲和层析：利用特定配体与抗体之间的高亲和力进行分离。
常见的亲和层析方法包括免疫亲和层析和亲和素层析。
免疫亲和层析是将抗体与特定配对抗原或抗原类似物结合，再通过洗脱实现抗体的分离纯化。
亲和素层析则是通过特异性结合分离靶抗体，例如蛋白A层析可以专一地结合某些抗体的Fc区。
4. 凝胶层析：根据抗体的分子量和电荷进行分离。
常用的凝胶层析方法包括凝胶过滤层析、凝胶电泳等。
凝胶层析可通过分子筛效应实现抗体的分离纯化。
5. 毒物素标记抗体净化：通过毒物素结合蛋白（例如A链）与抗体上Fc区的亲和作用，实现抗体的纯化。
6. 逆流层析：通过逆向液流使混合物在固相材料中逆流，根据成分的亲和力进行分离。
逆流层析可与其他纯化方法结合使用，提高纯化效果。
7. 高效液相色谱（HPLC）：利用高速流动液相通过固定相分离抗体。
常见的HPLC 方法包括离子交换HPLC、亲和HPLC、尺寸排除（分子筛）HPLC和亲和逆相（含酸）HPLC等。
8. 超滤和浓缩：通过膜过滤器来去除小分子物质，实现抗体的纯化。
在进行抗体纯化过程中，可以根据特定的抗体特性和目标纯化效果的要求选择合适的方法，也可以结合多种方法进行联合纯化，提高纯化效果和纯化收率。
总而言之，抗体的纯化过程是通过利用抗体与其他成分之间的相互作用进行分离，包括物理性质（如电荷、分子量）、结构特异性（如亲和力）和化学亲和力（如特定配体结合）等。
亲和层析技术
2 载体的选择 将亲和配基共价偶联在固体粒子的表面(或孔内)即可制 备亲和吸附介质，该固体粒子通常称为配基的载体。因 此，亲和吸附介质又称亲和载体。 作为载体的固体粒子应满足下列要求：(1)具有亲水性多 孔结构，无非特异性吸附，比表面积大；(2)物理和化学 稳定性高，有较高的机械强度，使用寿命长；(3)含有可 活化的反应基团，用于亲和配基的固定化；(4)粒径均一 的球形粒子。 常用的亲和层析载体有：琼脂糖凝胶和交联琼脂糖凝胶、 聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺—琼脂糖凝 胶、纤维素、多孔玻璃等。其它用于载体的物质还有： 聚苯乙烯、淀粉珠、壳聚糖、硅胶等。
1． 配基的选择 将一对能可逆结合和解离生物分子的一方与水不溶载体 相偶联制成亲和吸附剂，这样一对生物分子中，被偶联 的一方就叫作配基。 在实际工作中，究竞选择哪一种物质作配基，要根据 分离对象和实验的具体情况而定。纯化酶选择酶的竞争 性抑制剂、底物、辅酶和效应剂作配基。纯化酶的抑制 剂选择相应的酶做配基。纯化能结合维生素的蛋白质， 选择与其专一结合的维生素做配基。纯化激素受体蛋白， 选择相应的激素做配基，纯化核酸可以根据核酸与蛋白 质的相互作用、脱氧核糖核酸分子中不同互补链之间、 DNA和R14A之间杂合作用的关系选择合适的配基。
亲和层析技术的最大优点在于.利用它可以从粗 提物中经过一些简单的处理便可得到所需的高纯 度活性物质。利用亲和层析技术成功地分离了单 克隆抗体、人生长因子、细胞分裂素、激素、血 液凝固因子、纤维蛋白溶酶、促红细胞生长素等 产品，亲和层析技术是目前分离纯化药物蛋白等 生物大分子最重要的方法之一。
近几十年来，亲和层析技术发展十分迅速。对于 那些分离流程长、浓度低、杂质多、采用常规方 法难以进行分离的生物分子来说，亲相层析技术 就显示出其独特的优越性。亲和层析在分离、纯 化的效率工程[M] ,化学工业出版社,2001:108-125 [2]师治贤，王俊德.生物大分子的液相色谱分离和制备[川.北京，科 学出版社，1999 熊宗贵主编.生物技术制药[M].北京:高等教育出版社，1999：135139 [3]Wilchek, Meir; Miron, Talia ,Thirty years of affinity chromatography[J]. Reactive and Functional Polymers ，1999， V41: 263-268 [4] Burnouf, Thierry; Radosevich, Mirjana，Affinity chromatography in the industrial purification of plasma proteins for therapeutic use[J]. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 2001 ，V49：575-586 [5] 陈勇，应汉杰等.亲和层析研究进展[M].离子交换与吸附， 2001:276-280 [6]刘国诊主编.生物工程下游技术[M].化学工业出版社，北京，1993 [7] Christopher R. L, Steven J. B, Nicolas P. B, Wendy K. A, Jennifer M. P and Janette A. T., Trends Biotechno[J], 1992, 10(12): 442
免疫亲和柱技术及其在黄曲霉毒素等检测中的应用
部分黄曲霉毒素的检测方法
AFB1检测常采用酶联免疫法（ELISA），HPLC法和荧光光
度法等。ELISA方法检测成本较低，但存在较大的假阳性率,一
般作为准确定量检测前的预筛选方法。
AFM1的测定方法有薄层色谱法和高效液相色谱法，免疫亲
和柱—荧光法等。样品前处理过程繁琐、净化效果差、所需时
2.2 制备基体
理想基体应具有下列条件：
(1)不溶于水，但高度亲水； (2)惰性物质，非特异性吸附少； (3)具有相当量化学基团可供活化； (4)理化性质稳定； (5)机械性能好，具有一定颗粒形式以保持一定流速； (6)通透性好，最好为多孔网状结构，使大分子能自由通过； (7)能抵抗微生物和醇的作用。
2.3 抗体与基体偶联
基体在与抗体偶联之前，需要进行活化。一般是在基体骨架 上引入亲电基团，然后与间隔分子或抗体上的亲核基团共价结 合，需要说明的是在小配体的亲合色谱中，常在基体和配体之 间插入一个间隔臂，以减小空间位阻的影响。
常用的活化试剂包括溴化氰、环氧氯丙烷和维生素H酰肼等 抗体与活化基体的偶联方式有随机偶联与定向偶联两种。
间长等。免疫亲和柱—HPLC，选择性高、净化效果好、检测限
AFM1的检测国家新标准GB5413.37—2010中对乳和乳制品中AFM1的检测方法有
“低免疫、亲操和作层析简净单化、液相快色速谱等—串特联点质．谱法可”用、于“免牛疫乳亲中和层AF析M净1的化测高效定液。相谱”、
“免疫亲和层析净化荧光分光法”、“双流向酶联免疫法”等4种。
进样分析
• 黄曲霉毒素的测定： 将显色液加入到上步 的淋洗液中，混匀； 将测试管放入荧光计 中，一分钟后读数
免疫亲和柱使用中的注意事项
免疫学检验-自考重点
抗原抗体反应IgG为单体分子，是血清和细胞外液中含量最高的Ig血清中的IgM为五聚体，因此血清IgM水平升高提示有近期感染，有助于感染性疾病的早期诊断。
抗原抗体反应的原理：①抗原与抗体能够特异性结合是基于抗原表位与抗体超变区分子间的结构互补性与亲和性，这两种特性是由抗原与抗体分子的一级结构决定的；②抗原和抗体的结合完全依靠非共价键的相互作用，并且抗原复合物和游离成分之间保持动态平衡；③抗原抗体的结合使电荷减少或消失，电子云也消失，蛋白质由亲水胶体转化为疏水胶体。
范德华引力提供的作用力最小，疏水作用力提供的作用力最大。
亲和力：是指抗体分子上一个抗原结合位点与对应的抗原表位之间相适应而存在着的引力，它是抗原抗体间固有的结合力。
抗体超变区与抗原表位之间分子空间构型的吻合程度影响着抗体亲和力。
吻合程度越高，亲和力越高。
亲和力可用亲和常数K A来表示：K A=K1/K2=【Ab-Ag】/【Ab】×【Ag】（K A表示抗原抗体结合的稳定性和亲和力；K1表示结合常数；K2为解离常数；【Ab-Ag】表示抗原抗体复合物的摩尔浓度；【Ab】或【Ag】分别表示游离的抗体或抗原结合位点的摩尔浓度）K A值越大，【Ab-Ag】浓度越大，亲和力越高，抗体与抗原结合越牢固，反之抗原抗体复合物就容易解离。
带现象：在等价带前后分别为抗体过剩或抗原过剩，形成的沉淀物少或无，这种现象在免疫测定中称为带现象。
出现在抗体过量时，称为前带；出现在抗原过量时，称为后带（概念）改变pH和增加离子强度是最常有的促解离方法抗原抗体的纯化差速离心的分离效果是粗分离，适用于分子量相差大、不稳定、易变形的物质。
常用于分离细胞器和病毒。
常用的中性盐是硫酸铵，其优点是：①溶解度大；②温度系数小；③密度小；④价廉易得高浓度盐析法是由于盐分子与蛋白质分子极化部位相互作用，降低了蛋白质分子的亲水性而将其分级分离，是粗纯样品的重要方法盐析法是纯化蛋白质常用的粗提方法凝胶层析是利用物质的相对分子量不同而达到分离的一种层析技术。
四种蛋白纯化的有效方法
四种蛋白纯化的有效方法四种蛋白纯化的有效方法在进行蛋白质研究和酶工程等领域的实验过程中，常常需要将目标蛋白从复杂的混合物中纯化出来。
蛋白纯化的目的是获取高纯度的目标蛋白样品，以便进一步进行结构和功能研究。
然而，由于蛋白质的复杂性以及其在混合物中的低浓度，蛋白纯化常常面临一系列的挑战。
为了克服这些挑战，科学家们开发了多种蛋白纯化的方法。
在本文中，我们将介绍四种常见而高效的蛋白纯化方法，并探讨其原理和适用性。
1. 亲和层析法：亲和层析法是一种利用目标蛋白与配体之间的特异性结合进行纯化的方法。
这种方法基于目标蛋白与配体之间的亲和力，通过设计具有高亲和性的配体来选择性地结合目标蛋白。
在实验中，我们可以将配体固定于固相材料上，例如琼脂糖或石蜡烃树脂，并将载有目标蛋白的混合物与这些固定化的亲和基质进行接触。
随后，非特异性蛋白质被洗脱，而目标蛋白则被保留下来。
目标蛋白可以通过改变条件（例如改变pH值或添加竞争性配体）来洗脱。
亲和层析法的优点在于具有高选择性和高纯度的优势。
然而，由于亲和剂的设计和合成需要具有相关专业知识，并且选择适当的配体是关键。
亲和层析法在不同的纯化过程中的适用性会有所不同。
2. 凝胶过滤层析法（Gel Filtration Chromatography）：凝胶过滤层析法是通过分子量的差异将混合物中的蛋白质分离的一种方法。
凝胶过滤层析法是利用凝胶材料，例如琼脂糖或琼脂糖-聚丙烯酰胺凝胶，通过分子在凝胶孔隙中的渗透性而将蛋白分离开来。
较大的蛋白分子无法进入凝胶孔隙，因此会在凝胶的表面留下。
较小的蛋白分子则能够渗透进入凝胶孔隙中，因此会相对于较大的蛋白分子更早地溢出。
凝胶过滤层析法的优点在于操作简单、速度快，且可以对蛋白进行某种程度的分离。
然而，该方法的分离效果受到蛋白质在凝胶中的体积效应的限制，因此对于体积较大的蛋白分子，凝胶过滤层析可能无法实现理想的分离效果。
3. 离子交换层析法：离子交换层析法是一种基于蛋白与离子交换材料之间的电荷相互作用进行纯化的方法。
免疫复合物的纯化方法
免疫复合物的纯化方法
一、沉淀法
沉淀法是一种常用的免疫复合物纯化方法，主要利用了免疫复合物在溶液中的不溶性。
通过调节溶液的pH值、离子强度、温度等条件，使免疫复合物从溶液中沉淀出来，然后进行离心和洗涤，得到较为纯净的免疫复合物。
沉淀法简单易行，但纯度相对较低。
二、亲和层析法
亲和层析法是一种利用特异性结合的纯化方法，通过将免疫复合物与特定的配体结合，再将其从溶液中分离出来。
亲和层析法的优点是特异性高，能够去除大部分杂质，但需要制备特异性的配体，操作较为繁琐。
三、凝胶过滤法
凝胶过滤法是一种基于分子排阻的分离方法，通过将免疫复合物通过凝胶介质，根据免疫复合物的大小和形状进行分离。
凝胶过滤法的优点是操作简便，能够去除小分子杂质，但对大分子杂质的去除效果有限。
四、反相高效液相色谱法
反相高效液相色谱法是一种利用反相键合相分离混合物的方法。
在反相高效液相色谱法中，免疫复合物与反相键合相特异性结合，再通过改变流动相的组成或洗脱液的pH值，将免疫复合物从键合相上分离出来。
反相高效液相色谱法的优点是分离效果好、纯度高，但需要特殊的仪器和操作技术。
五、离子交换色谱法
离子交换色谱法是一种利用离子交换剂分离混合物的方法。
在离子交换色谱法中，免疫复合物与离子交换剂结合，再通过改变流动相的离子强度或pH值，将免疫复合物从离子交换剂上分离出来。
离子交换色谱法的优点是操作简便、分离效果好，但对某些免疫复合物的分离效果有限。
亲和层析法
第二节 操 作
一、基质的选择 理想的基质应满足下面的要求: 1．极低的非特异吸附性； 2．高度的亲水性。
亲和吸附剂要易与水溶液中的生命大分子物 质接近。 3．较好的理化稳定性。
当配体固化和各种因素(如pH、离子强度、 温度和变性剂等)变化时，基质很少甚至不受 影响；
4．大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配 体结合；
无亲和力或非特异吸附的物质则被起始缓冲液洗涤 出来，并形成了第一个层析峰；
然后，恰当地改变起始缓冲液的
pH值、
或增加离子强度、
或加入抑制剂等因子，
即可把物质S从固相载体上解离下来，并形成了第 二个层析峰(见图7-2B)。
如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲 和力(其大小有差异)时,
抑制剂、 效应物、 酶的辅助因子、 类似底物、 抗体[包括半抗原(碱基、核苷、核苷酸、寡核苷酸)蛋白质复合物抗体]、 其他物质(如外源凝集素、polyA.polyU、染料和金属 离子)等。
优良的配体须具备两个条件:
1）与纯化的物质有较强亲和力
一般来说，
配体对大分子物质的亲和力越高(即Ki（抑制常数） 或Ka（解离常数）较小)，在亲和层析中应用的价值 就越大。
•
B. 剧烈的洗脱条件(蛋白质变性剂)
• 如用盐酸胍、尿素等变性试剂配制的溶液洗脱下的 蛋白质等生命大分子物质；需要经过适当的处理方可 恢复活性。
六、亲和层析柱的再生
当洗脱结束后, 应连续用大量的洗脱液或 高浓度的盐溶液彻底洗涤柱子, 接着再 用平衡缓冲液使层析柱重新平衡。
经过这样处理的柱子可再次上样, 进行第 二次亲和层析。
样品的浓度、pH值、离子强度以及上样的速度等因 子对其影响也不可轻视。 若选择得当, 则可提高固相载体对欲分离物的亲和力。
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免疫亲和层析原理
免疫亲和层析原理是一种利用抗原与抗体之间的特异性结合作用来分离和纯化生物大分子的技术。
在此过程中，使用具有高亲和力的抗体作为纯化目标分子的亲和基质，将待分离的生物大分子与亲和层析柱中的抗体结合，再用适当的缓冲液洗脱非特异性结合的杂质，最终得到纯化的目标分子。
在免疫亲和层析中，亲和基质是关键的一步。
它应该具有高亲和力，可以特异性地与目标分子结合，而且又能够稳定地与固定在柱子上的支持基质结合。
同时，亲和基质也需要具有耐受性，能够承受高浓度样品的负载和高盐浓度的洗脱缓冲液。
亲和基质的选取与设计是免疫亲和层析技术中的重要环节。
常用的亲和基质包括：蛋白A、蛋白G、蛋白L、亲和素、铜离子等。
例如，蛋白A可以特异性结合于大部分哺乳动物IgG的Fc区域上，因此常用于IgG的纯化；蛋白G可以结合多种种类的IgG，适用于不同种类IgG的纯化过程。
在免疫亲和层析中，样品的选择也是十分重要的。
通常，需要选择合适的抗体来作为亲和基质。
另外，样品的组成也需要考虑，以避免样品中的其他成分对目标分子的结合和纯化产生干扰。
此外，需要控制样品的pH和离子强度，使其适应亲和基质的结合条件。
免疫亲和层析技术具有以下优点：可以高效地分离和纯化目标分子，
具有高度的特异性和选择性；分离过程可以在温和条件下进行，避免目标分子的变性和失活；可以应用于复杂的生物体系中，如血清、细胞酶制剂等；可以重复使用亲和基质，具有经济性和环保性。
但是，免疫亲和层析也存在一些缺点。
例如，亲和基质的成本较高，需要大量的抗体来制备；亲和基质对于目标分子的结合并非绝对特异性，可能会与非目标分子结合，导致分离纯化效果不佳；亲和基质的稳定性和重复使用次数有限，需要定期更换。
免疫亲和层析是一种有效的生物大分子分离和纯化技术，其原理基于抗原与抗体之间的特异性结合。
通过选取合适的亲和基质和样品，可以高效地纯化目标分子。
虽然该技术存在一些缺点，但其优点仍然使其成为生物分离纯化领域的重要技术之一。