免疫亲和色谱
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2014-7-21
免疫亲和柱能重复使用的程度主要取决于所分 析的样品的性质和抗体与载体的稳定性。最重要的 一步是除去物理吸着在抗体上的物质，以便使柱子 能重现性地重复使用。在动物性食品样品正常脱脂 和不含固体颗粒时，大多数柱子至少可使用 100 次 。有报道，分析玉米、花生中黄曲霉毒素B1、B2、 G1、G2时，用水洗柱使之再生，可重复使用50次以 上；而用于啤酒中黄曲霉毒素 B1 、 B2 、 G1 、 G2 测 定时，用磷酸缓冲液洗柱再生，只能用1-2次。
2014-7-21
多 免 疫 亲 和 净 化 （ multi-immunoaffinity cleanup, MIAC ）是将不同的多克隆抗体合装在 一个柱中。 用 GC-MS 测定牛肉中的去甲睾酮和甲基睾酮 ，是将两个不同的多克隆抗体混合偶联到一个载 体上。为了分析 7 个同化激素，用 7 个单独的 IAC 基体合在一个柱中。
免疫亲和色谱
一 二
发
三
四
五 六
Company Logo
免疫亲和色谱 (immunoaffinity chromatography, IAC) 是极为有效的样品制备方法。 IAC 根据分析物和其 所引起的抗体之间有选择的和可逆的相互作用，从复杂 样品基质中分离出分析物。通常，将载体上固定化的抗 体移到小柱中，样品液通过重力或泵流过小柱。使用泵 是更好的方法，因为它保证恒定的流速并可同时进行多 柱操作。免疫化学相互作用的结果使分析物分子为固定 化抗体所保留，但基质组分不与抗体作用而流出柱子。 用磷酸缓冲液洗涤柱子将其余未保留的成分全部除去。 洗涤之后，用比吸附缓冲剂离子强度大的和pH值低的缓 冲液将被吸附的分析物脱附；分析物的分配平衡从配体 移至缓冲液，因此将分析物洗脱。
2014-7-21
2014-7-21
制备IAC基体首先需要抗血清，单独地看免疫原的 合成和抗体的免疫与纯化方法和 IAC 本身不太有什么关 联，但这些是所有免疫化学方法的主要部分。制成IAC 基体，必须将抗体结合到载体上，且不能丢失太多活 性。大多数情况下，抗体与载体以共价键结合，如聚 丙烯酰胺 (polyacrylamide) 、三丙烯酰胺 (trisacryl) 、 琼 脂 糖 （ agarose ） 、 葡 聚 糖 (dextran) 和 纤 维 素 (cellulose)。 偶联之前，载体必须用试剂致活，如澳化氰( cyanogen bromide) 、 高 碘 酸 盐 (periodate) 、 三 嗪 (triazine) 、 羰 基二 咪唑 ( carbonyldiimidazole) 或 N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide)。
2014-7-21
IAC 具有特异性高、耗时少、操作简便、节省 溶剂等优点，然而要成为真正普及的技术，对 IAC 还有更多要求。 IAC 基体的可供性是主要因素。除极少数外， 大多数试验室没有生产抗体的设备。另外，订制抗 体不一定能保证最后产品的质量，而且一般要等624个月才能得到血清。迄今，市场上能得到的免疫 亲和柱和吸着剂仅限于激素、 ß- 激动剂、皮质激 素以及几种真菌毒素。当为了分析目的的抗体生产 商业化成为现实时，IAC将会显示出它的潜力。
2014-7-21
ຫໍສະໝຸດ Baidu
IAC 的选择性取决于固定化的抗体的特异性， 因此，最好使用单克隆抗体。这样大量的样品可用 免疫亲和净化而没有任何基质成分保留，从而使在 动物性食品中很低浓度的药物残留测定成为可能。 例如，当1L脱脂奶用免疫亲和净化后，能测定1L奶 中的20ng氯霉素，回收率达99％。 能识别一类药物中所有组分的基本分子结构的 多克隆抗体也可用于需要分析同类中的一些组分的 分析。
2014-7-21
为了从IAC基体中洗脱分析物，柱中需要有 特定条件。洗脱步骤取决于抗体-分析物键的性质 ，一般是弱的物理性质的键。 由于免疫化学相互作用的物理键的类型在不 同抗体-分析物体系之间变化极大，因而每个抗体 的净化步骤有其自身的适宜洗脱条件。
2014-7-21
通常，以特定的或非特定的脱附方式进行洗脱 。特定的脱附如配体竞争和共底物洗脱；非特定的脱 附可用各种不同的步骤，全都瞄准在抗体 - 分析物复 合物的解离。据估计，在抗体 - 分析物键没有断开前 ，从1mL柱上洗脱l0ng需要大约25L洗脱体积。为了将 洗脱体积减少到 5mL ，必须改变柱内的条件，使其亲 和常数由5x1011 L/mol减小到108 L/mol。然而必须选 择洗脱条件，使亲和常数的减小是个可逆的过程。否 则，抗体会受到损坏致使免疫亲和柱的重复使用受到 极大的限制。这从经济观点来说是很重要的，因为仅 制备一个免疫亲和柱就需要几毫克抗体。
2014-7-21
在偶联操作时，免疫球蛋白与载体形成共价 键的过程通常通过其氨基间的相互作用完成。 免疫亲和吸着剂显示的分析物容量通常比理论 上计算的低，主要由于在固化中抗体部分失活，免 疫球蛋白分子在载体上的随意固定化屏蔽了分析物 的结合点。 分析物能键合免疫亲和柱上的最大量取决于 在吸着剂上抗体分子的数目和取向。然而，一个免 疫亲和柱的结合效率随流速、分析物浓度和样品溶 液性质而变化。分析物实际上的保留量通常小于理 论计算值。仅当低流速结合低浓度分析物通过柱子 时，才可近乎理论计算值。
免疫亲和柱能重复使用的程度主要取决于所分 析的样品的性质和抗体与载体的稳定性。最重要的 一步是除去物理吸着在抗体上的物质，以便使柱子 能重现性地重复使用。在动物性食品样品正常脱脂 和不含固体颗粒时，大多数柱子至少可使用 100 次 。有报道，分析玉米、花生中黄曲霉毒素B1、B2、 G1、G2时，用水洗柱使之再生，可重复使用50次以 上；而用于啤酒中黄曲霉毒素 B1 、 B2 、 G1 、 G2 测 定时，用磷酸缓冲液洗柱再生，只能用1-2次。
2014-7-21
多 免 疫 亲 和 净 化 （ multi-immunoaffinity cleanup, MIAC ）是将不同的多克隆抗体合装在 一个柱中。 用 GC-MS 测定牛肉中的去甲睾酮和甲基睾酮 ，是将两个不同的多克隆抗体混合偶联到一个载 体上。为了分析 7 个同化激素，用 7 个单独的 IAC 基体合在一个柱中。
免疫亲和色谱
一 二
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免疫亲和色谱 (immunoaffinity chromatography, IAC) 是极为有效的样品制备方法。 IAC 根据分析物和其 所引起的抗体之间有选择的和可逆的相互作用，从复杂 样品基质中分离出分析物。通常，将载体上固定化的抗 体移到小柱中，样品液通过重力或泵流过小柱。使用泵 是更好的方法，因为它保证恒定的流速并可同时进行多 柱操作。免疫化学相互作用的结果使分析物分子为固定 化抗体所保留，但基质组分不与抗体作用而流出柱子。 用磷酸缓冲液洗涤柱子将其余未保留的成分全部除去。 洗涤之后，用比吸附缓冲剂离子强度大的和pH值低的缓 冲液将被吸附的分析物脱附；分析物的分配平衡从配体 移至缓冲液，因此将分析物洗脱。
2014-7-21
2014-7-21
制备IAC基体首先需要抗血清，单独地看免疫原的 合成和抗体的免疫与纯化方法和 IAC 本身不太有什么关 联，但这些是所有免疫化学方法的主要部分。制成IAC 基体，必须将抗体结合到载体上，且不能丢失太多活 性。大多数情况下，抗体与载体以共价键结合，如聚 丙烯酰胺 (polyacrylamide) 、三丙烯酰胺 (trisacryl) 、 琼 脂 糖 （ agarose ） 、 葡 聚 糖 (dextran) 和 纤 维 素 (cellulose)。 偶联之前，载体必须用试剂致活，如澳化氰( cyanogen bromide) 、 高 碘 酸 盐 (periodate) 、 三 嗪 (triazine) 、 羰 基二 咪唑 ( carbonyldiimidazole) 或 N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide)。
2014-7-21
IAC 具有特异性高、耗时少、操作简便、节省 溶剂等优点，然而要成为真正普及的技术，对 IAC 还有更多要求。 IAC 基体的可供性是主要因素。除极少数外， 大多数试验室没有生产抗体的设备。另外，订制抗 体不一定能保证最后产品的质量，而且一般要等624个月才能得到血清。迄今，市场上能得到的免疫 亲和柱和吸着剂仅限于激素、 ß- 激动剂、皮质激 素以及几种真菌毒素。当为了分析目的的抗体生产 商业化成为现实时，IAC将会显示出它的潜力。
2014-7-21
ຫໍສະໝຸດ Baidu
IAC 的选择性取决于固定化的抗体的特异性， 因此，最好使用单克隆抗体。这样大量的样品可用 免疫亲和净化而没有任何基质成分保留，从而使在 动物性食品中很低浓度的药物残留测定成为可能。 例如，当1L脱脂奶用免疫亲和净化后，能测定1L奶 中的20ng氯霉素，回收率达99％。 能识别一类药物中所有组分的基本分子结构的 多克隆抗体也可用于需要分析同类中的一些组分的 分析。
2014-7-21
为了从IAC基体中洗脱分析物，柱中需要有 特定条件。洗脱步骤取决于抗体-分析物键的性质 ，一般是弱的物理性质的键。 由于免疫化学相互作用的物理键的类型在不 同抗体-分析物体系之间变化极大，因而每个抗体 的净化步骤有其自身的适宜洗脱条件。
2014-7-21
通常，以特定的或非特定的脱附方式进行洗脱 。特定的脱附如配体竞争和共底物洗脱；非特定的脱 附可用各种不同的步骤，全都瞄准在抗体 - 分析物复 合物的解离。据估计，在抗体 - 分析物键没有断开前 ，从1mL柱上洗脱l0ng需要大约25L洗脱体积。为了将 洗脱体积减少到 5mL ，必须改变柱内的条件，使其亲 和常数由5x1011 L/mol减小到108 L/mol。然而必须选 择洗脱条件，使亲和常数的减小是个可逆的过程。否 则，抗体会受到损坏致使免疫亲和柱的重复使用受到 极大的限制。这从经济观点来说是很重要的，因为仅 制备一个免疫亲和柱就需要几毫克抗体。
2014-7-21
在偶联操作时，免疫球蛋白与载体形成共价 键的过程通常通过其氨基间的相互作用完成。 免疫亲和吸着剂显示的分析物容量通常比理论 上计算的低，主要由于在固化中抗体部分失活，免 疫球蛋白分子在载体上的随意固定化屏蔽了分析物 的结合点。 分析物能键合免疫亲和柱上的最大量取决于 在吸着剂上抗体分子的数目和取向。然而，一个免 疫亲和柱的结合效率随流速、分析物浓度和样品溶 液性质而变化。分析物实际上的保留量通常小于理 论计算值。仅当低流速结合低浓度分析物通过柱子 时，才可近乎理论计算值。