4.3 亲和色谱
亲和色谱洗脱步骤-概述说明以及解释
亲和色谱洗脱步骤-概述说明以及解释1.引言1.1 概述亲和色谱是一种分离和纯化生物大分子的常用技术，它通过利用生物大分子与其配体之间的特异性相互作用来实现分离。
配体可以是一种蛋白质、抗体、寡核苷酸或其他具有亲和性的分子。
亲和色谱的洗脱步骤是整个分离过程中非常重要的一环。
洗脱步骤通常是在样品与亲和色谱介质之间相互作用的基础上进行的，旨在以一种控制的方式解离目标分子与亲和介质之间的相互作用，从而实现目标分子的高效纯化。
在洗脱步骤中，通常会使用适当的洗脱缓冲液来改变样品与亲和介质之间的物理、化学条件，从而打破它们之间的亲和作用。
这样一来，目标分子会从亲和介质上解离出来，进而被洗脱出来。
洗脱缓冲液的选择具有很大的灵活性，可以根据目标分子与亲和介质之间的相互作用类型进行优化。
常用的洗脱策略包括改变pH值、离子强度或离子种类、添加竞争性配体等。
通过这些手段调控洗脱缓冲液的条件，可以实现对目标分子的高效洗脱。
同时，洗脱步骤的优化也需要考虑目标分子的稳定性和纯化效率等因素。
总之，亲和色谱的洗脱步骤是亲和色谱技术中至关重要的一环。
它通过改变样品与亲和介质之间的相互作用条件，实现了目标分子的高效纯化。
洗脱策略的选择和优化对于获取高纯度的目标分子至关重要，因此需要充分考虑各种因素的影响并进行实验验证。
文章结构部分的内容可以包括以下几个方面：1.2 文章结构本文共分为三个部分：引言、正文和结论。
引言部分介绍了亲和色谱洗脱步骤的背景和意义，包括亲和色谱的定义和作用。
接着介绍了本文的目的，即详细讨论亲和色谱的洗脱步骤。
正文部分分为两个小节。
第一个小节是亲和色谱的原理，详细介绍了亲和色谱的基本原理和工作机制，包括亲和剂与目标分子的特异性结合、固定相和流动相的选择等内容。
第二个小节是亲和色谱的洗脱步骤，将详细讨论亲和色谱洗脱的各个步骤，包括样品的加载、洗脱剂的选择和优化、梯度洗脱的条件等。
结论部分对亲和色谱洗脱步骤进行总结，归纳了各个步骤的重要性和影响因素。
亲和色谱法
亲和色谱法亲和色谱法是一种用于分离、纯化生物大分子的技术，它利用生物分子之间的亲和作用来进行分离、纯化。
它的基本原理是：在柱子的表面放置一种可以与目标生物分子发生亲和作用的固定化剂，然后将待测样品通过柱子进行流动。
当目标生物分子与固定化剂发生亲和作用时，就会被吸附在柱子的表面；而其他的杂质分子则不会被吸附，经过柱子流出。
最后，再通过适当的方法将目标生物分子从柱子上解离出来，即可得到高纯度的目标生物分子。
亲和色谱法的优点是分离效率高，可以得到高纯度的生物分子；缺点是分离的速度较慢，而且对于某些生物分子可能难以得到较好的分离效果。
亲和色谱法主要应用在生物学、药学、食品工业、环境监测等领域，并在这些领域取得了巨大的成功。
在生物学领域，亲和色谱法常用于抗体分离、酶的纯化、抗原的分离等；在药学领域，亲和色谱法常用于药物的纯化、抗体药物的生产等；在食品工业中，亲和色谱法常用于食品添加剂的分离、蛋白质的纯化等；在环境监测领域，亲和色谱法常用于水质监测、空气监测等。
亲和色谱法的原理是基于生物分子之间的亲和作用，因此选择固定化剂时需要考虑到固定化剂与目标生物分子之间的亲和作用。
常用的固定化剂有抗体、酶、抗原、细胞表面蛋白等。
选择固定化剂时，需要考虑到固定化剂的稳定性、选择性、可交换性、可再生性等因素。
亲和色谱法的实验过程大致分为固定化、流动、洗脱、解离四个步骤。
在固定化步骤中，需要将固定化剂放在柱子中，然后将柱子浸泡在预处理溶液中，使固定化剂与柱子结合起来。
在流动步骤中，需要将待测样品通过柱子进行流动。
在洗脱步骤中，需要通过适当的洗脱溶液将非目标生物分子从柱子上洗脱出来。
在解离步骤中，需要通过适当的方法将目标生物分子从柱子上解离出来。
亲和色谱法的优点是分离效率高，可以得到高纯度的生物分子。
缺点是分离的速度较慢，而且对于某些生物分子可能难以得到较好的分离效果。
因此，在使用亲和色谱法时，需要根据实际情况来选择适当的固定化剂和洗脱溶液，并适当调整流速，以提高分离效率。
亲和色谱PPT
免疫亲和色谱 固定化金属离子亲和色谱 其他亲和色谱
免疫亲和色谱
免疫亲和色谱(Immunoaffinity Chromatography, IAC)是 利用生物体内存在的抗原、抗体之间高度特异性的亲和 力进行分离的方法。
IAC的特点
1. 2. 3.
专一 高效 灵敏 ……
IAC的应用
1. 2.
抗体的分离纯化——Protein A亲和色谱 快速诊断测试 ……
固定化金属离子亲和色谱
固定化金属离子亲和色谱(Immobilized Metal ion Affinity Chromatography, IMAC) 主要根据蛋白质中组氨酸、色氨酸或半胱氨酸等氨基酸 残基与色谱柱上的金属离子螯合作用形成络合物，从而 实现分离 产物变性 • 渗漏
谢谢
亲和色谱 Affinity Chromatography
黄岳
生研1502
亲和色谱概述
概念：利用生物分子间专一的亲和力而进行分离的一种色谱技术
原理和基本过程
原理：将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质 上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子 进行分离纯化。
亲和色谱的类型
1. 2. 3.
配基稳定性高 ，不易脱落 金属离子配基价格低廉 ，再生成本低 省去了脱盐的预处理步骤 容易洗脱目标蛋白
IMAC的应用——Ni-Agarose His标签蛋白纯化技术
其他亲和色谱技术
生物亲和色谱 拟生物亲和色谱 分子对亲和色谱 共价亲和色谱 凝集素亲和色谱 ……
亲和色谱需要考虑的问题
亲和色谱
Chitin
Trypsin
A
B
C&D
以凝胶电泳检验亲和色谱 操作过程各步骤样品→
Ate 吸附剂：
羟基磷灰石
(Ca5(PO4)3OH)2
可选择 NaCl 或 磷酸 等不同洗脱条件
Bio-Rad CHT
●疏水性层析法：
●●●●● ●●●
-NH2
●● ● ●
硫醇基 -SH
X
■ 可与各种配体基团反应的载体：
配体基团 親 和 性 载体
CNBr-activated Sepharose 4B
Pharmacia
反应方式
直接反应 加 EDC*
反应基团
-C≡N -COOH N-OH-succinimide Oxirane环氧己烷
■ Hydrophobic interaction 色析法：
Ammonium sulfate (% sat.) 25
0 10
Protein concentration
20
15
20
10
5
30
40
50
100
200
300
400
Elution volume (mL)
Pharmacia HIC
Ethylene glycol (%)
亲和色谱(AC)
（Affinity chromatograph）
原理：利用生物大分子和固定相表面存在的 某种特异性亲和力，进行选择性分离。 先在载体表面键合上一种具有一般反应 性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接 上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将 只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作 用而被保留。改变淋洗液后洗脱。 亲和洗提 酶与其它化合物一起吸附到一种离子交换剂 上，然后用适当的底物特异地洗提。
亲和色谱分离
中等盐浓度的缓冲液能稳定溶液中蛋白质并
防止由于离子交换所引起的非特异性相互作 用。
5 操作方法
3. 柱操作
柱的大小取决于吸附剂的容量和所需纯
化的蛋白质的量。一般地说，高的容量
② 流速控制
不能太快
延长时间可促进吸附
③ 吸附时间的控制
④ 进样量的大小
减少进样量，可提高吸附效果。
4 亲和色谱操作条件的选择
2. 清洗条件的选择
洗涤缓冲液的强度应介于目的分子吸附
条件与目的分子洗脱条件之间
4 亲和色谱操作条件的选择
3. 洗脱条件的选择
在实际操作过程中，应该在洗脱强度和 耐受程度之间做好平衡。
1. 载体的选择
常用的亲和色谱载体主要有多孔玻璃载
体、聚丙稀酰胺载体、纤维素载体、葡
聚糖凝胶载体、琼脂糖凝胶和交联琼脂
糖凝胶载体等。
2. 配基的选择
根据配基应用和性质，可将其分为两
类：特殊配基和通用配基。亲和层析
中常用的特殊配基有某一抗原的抗体、
某一酶的专用抑制剂、某一激素的受
体等。通用配基可适用于一类物质的
分离提纯，如用NADH作脱氢酶类亲和
层析的通用配基。
2. 配基的选择
首先，应当仅仅识别被纯化的目的物(配 体)。其次，配体与配基应该有足够大的亲 和力。再次，配基与相应目的物之间的结
合应具有可逆性。第四，配体具有足够的
稳定性，能够耐受反应条件以及清洗合再 生等条件。最后，配基的分子大小必须合 适。
3. 载体的活化与偶联
载体由于其相对的惰性，往往不能直接与配基
亲和色谱
亲和作用
亲和作用：生物分 特异性
亲和体系
子能够区分结构和 性质非常接近的其
高特异性
抗原-单克隆抗体 荷尔蒙－受体蛋白 核酸－互补碱基链段、核酸结合蛋白
他分子，选择性地
酶－底物、产物、抑制剂
与其中某一种分子
相结合，生物分子
群特异性
免疫球蛋白－A蛋白、G蛋白 酶－辅酶
间的这种特异性相
凝集素－糖、糖蛋白、细胞、细胞表面
分类
名称
作用原理
应用
免疫亲和色谱
抗原与抗体专一性识别
抗原或抗体
固定化金属亲和色谱 锌、镍离子与蛋白表面组氨酸特异性识别 含有组氨酸的蛋白
染料亲和色谱
染料与蛋白之间的特异性识别
激酶、脱氢酶
核苷酸亲和色谱
核苷酸与蛋白之间的特异性识别
激酶、脱氢酶
凝集素亲和色谱
凝集素与糖之间转移性可逆结合
糖蛋白
蛋白亲和色谱
对 类似的抗体的转移性
免疫蛋白等
操作流程
❖ 找与底物专一可逆结合 的配基；
❖ 将配基通过共价键偶联 到基质；
❖ 配基与底物吸附； ❖ 洗脱目标物。
例子
免疫亲和色谱
❖ 抗原和抗体的作用具有高度的专一性, 并且它 们的结合亲和力极强。因此用适当的方法将 抗原或抗体结合到吸附剂上, 便可有效地分离 和纯化免疫物质。
条件； 3、在洗脱中，交联在层析介质上的配基可能脱落并进入产品
中，从而造成不良影响，如抗体、染料等配基。
影响因素
❖ 上样体积---若目标产物与配基的结合作用较强，上 样体积对亲和色谱效果影响较小。若二者间结合力 较弱，样品浓度要高一些，上样量不要超过色谱柱 载量的5%~10%。
亲和色谱精讲PPT课件
一、要求
㈠. L与基质结合，对L-S结合无干扰； ㈡. L为小分子有的需“手臂”，使LS结
合更有效； ㈢. 非专一吸附不大，以免吸附杂质； L与基质结合稳定（吸附、洗脱、再生）。
.
24
二、
偶联用Gel的选择 需考虑： ㈠. L上可供偶联的基团 ㈡. “手臂” ㈢. L的稳定pH
三、 由CNBr活化型Sep.4B制备
3. 需了解L-S的作用机制
如……
.
12
例：酶 有单底物反应、双底物反应
单A E
EA
P E
EP
底物A、产物P或它们的类似物都可以
.
13
双底物依次
AB E
EA EAB
PQ E
EPQ EQ
须选择A、若选B则吸附时须加A
.
14
双底物随机
A（B） B（A） P（Q） Q（P）
E
E
EA EA（B） EPQ
.
37
其他方法
羰基二咪唑（CDI）法 高碘酸盐法 磺化氟甲基吡啶鎓法 N-羟基琥珀酰亚胺法
.
38
其他亲和吸附剂
聚丙烯酰胺载体的亲和吸附剂可用戊二醛 法和肼解法活化,然后再将含氨基的配体固 定到其活化基团上;
硅胶和多孔玻璃载体的亲和吸附剂最常用 的修饰方法就是进行硅烷化处理,从而给载 体引入氨基或环氧基团.
连接臂的连接
连接臂先接配体后偶联至载体 连接臂先偶联至载体后接配体
.
30
四、由氨基-Sep或羧基- Sep制备
Sep-(CH2)6-NH2 Sep
L-COOH AH-
Sep-(CH2)6-COOH L-NH2
CH-Sep
碳二亚胺法（配基偶联的一种方法）：
亲和色谱法的原理及应用
亲和色谱法的原理及应用一、亲和色谱法的原理亲和色谱法是一种利用生物大分子间的特异性相互作用进行分离和纯化的方法。
其原理是通过靶分子与固相上的配体之间产生亲和结合来实现分离。
亲和色谱法利用了配体与靶分子之间的特异性相互作用，如抗原与抗体的结合、酶与底物的结合等，从而实现对目标分子的选择性捕获。
其分离和纯化效果优于传统的分离方法，成为现代生物科学研究中不可或缺的技术手段。
二、亲和色谱法的应用亲和色谱法在生物学和药物研发等领域中有着广泛的应用。
下面列举了一些常见的应用案例：1.抗体纯化：亲和色谱法广泛应用于抗体的纯化工艺中。
通过将抗体的抗原特异性与配体结合，可以实现对抗体的高效选择性纯化。
2.蛋白质纯化：亲和色谱法在蛋白质纯化中起到了重要的作用。
通过将某一特定结合配体固定在色谱柱上，可以实现对目标蛋白质的选择性捕获。
3.酶底物亲和纯化：亲和色谱法可利用酶与底物之间的亲和结合进行酶的纯化。
通过将底物或类似物固定到色谱柱上，可实现对酶的选择性捕获。
4.核酸纯化：亲和色谱法可应用于核酸的纯化过程。
通过将亲和配体固定在色谱柱上，可以实现对目标核酸的高效分离。
5.生物药物开发：亲和色谱法在生物药物的开发过程中起到关键作用。
通过分离和纯化目标蛋白质，可以获得高纯度的生物药物。
三、亲和色谱法的优势和局限性使用亲和色谱法进行分离和纯化具有以下优势：•高选择性：亲和色谱法可以实现对目标分子的高度选择性捕获，减少了其他杂质的干扰。
•高纯度：亲和色谱法可以获得高纯度的目标分子，满足进一步研究和应用的需要。
•原位纯化：亲和色谱法能够在原位进行纯化操作，避免了传统离心、沉淀等分离步骤。
然而，亲和色谱法也存在一些局限性：•配体选择性：亲和色谱法的成功与否，取决于配体与靶分子之间的相互作用是否特异、强烈，因此选择合适的配体是亲和色谱法的关键。
•杂质的干扰：亲和色谱法在分离和纯化过程中，有时可能会受到杂质的干扰，导致目标分子的选择性捕获不够理想。
亲和色谱法
2 间隔臂 在亲和色谱固定相中，需通过间隔臂将配位体连 接在基体上，由于间隔臂占据一定的机动空间。当配 位体与被测定的生物分子（尤其是生物大分子）产生 亲和作用时，有利于克服空间阻碍作用。 通式：
NH2 (CH2 )n R
R可为羧基、胺基或配位体自身
3 配位体 （1）染料配位体 大多是三嗪染料，主要用于蛋白质的分离与纯 化。 （2）定位金属离子配位体 它是将具有鳌合作用的有机官能团键合在间隔 壁的机体上，然后与Cu2+ ， Ni2+ ， Fe2+ ， Fe3+ 等金属离子生成稳定鳌合物，利用螯合物中的定 位金属离子与生物分子的特效亲和作用实现生物 分子的分离与纯化。
（6）共价配位体 主要用于含硫蛋白质分离。
三、亲和色谱的流动相 需使用pH值接近中性稀缓冲溶液，以保持其 生物活性。
亲和色谱使用的流动相：由磷酸盐、硼酸盐、乙酸 盐、柠檬酸盐具有不同pH值的缓冲溶液体系，有机碱三 羟甲基甲烷与盐酸顺丁烯二酸构成的缓冲溶液体系也有 较多应用。 此外，在生物大分子亲和色谱中，还广泛使用生物 研究中常用的非离子缓冲物。 如：N-(2-) 乙基-N-（2-磺化乙基）-哌嗪 （HEPES）、N,N,N',N'-四乙基乙二胺（TEEN）。
• 在载体（无机填料）上键合间隔臂（如环 氧，联氨等），再连接上配基（酶，抗原 等）。与和配基之间有亲和力的生物大分 子作用，对其进行分离。
一 、分离原理（生成锁匙结构络合物） 亲和色谱固定相上键合的配体与被分离的生物活 性分子间的相互作用，可用锁匙结构合物的生成来 表示：
二、 亲和色谱法的分类
（3）包合配合物配位体 包合配合物配位体是由主体分子与客体分子 间的特殊亲和作用而形成的。常用的主体分子为 β-环糊精、冠醚等。
亲和色谱纯化真核mrna的原理
【文章】亲和色谱纯化真核mRNA的原理在生物学研究领域，特别是在分子生物学中，亲和色谱是一种常用的纯化技术。
亲和色谱的原理是利用分子间特异性结合的原理，通过特定的亲和配体来实现目标分子的分离和纯化。
而在真核细胞中，mRNA作为DNA转录的产物，具有重要的生物学意义，利用亲和色谱技术来纯化真核mRNA，对于研究mRNA的结构、功能和调控机制非常重要。
本文将对亲和色谱纯化真核mRNA的原理进行全面评估，帮助读者深入理解这一关键技术的原理和应用。
一、亲和色谱的基本原理亲和色谱的基本原理是利用生物分子之间的特异性结合。
在纯化过程中，首先需要选择并合成具有高特异性的亲和配体，例如抗体、亲和标签、寡核苷酸等。
将这些亲和配体固定在固定相上，构成亲和柱。
当混合物通过亲和柱时，目标分子能够与亲和配体结合，而其他非特异性结合的物质则能够被洗脱。
通过改变环境条件或者使用竞争性洗脱剂，可以将目标分子从亲和柱上洗脱下来，实现分离和纯化。
二、真核mRNA的纯化原理纯化真核mRNA是分子生物学研究中的常见操作，它可以帮助研究者了解mRNA的结构、功能和调控机制。
在真核细胞中，mRNA具有帽结构（cap）和多聚腺苷酸尾巴（polyA tail），这些结构成为亲和色谱mRNA纯化的关键。
通常，利用亲和色谱技术来纯化真核mRNA，研究者会选择具有高特异性结合帽结构或polyA尾巴的亲和配体。
这些亲和配体可以与mRNA特异性结合，将其他RNA、DNA和蛋白质等杂质洗脱，最终实现真核mRNA的纯化。
三、亲和色谱纯化真核mRNA的应用亲和色谱纯化真核mRNA在分子生物学研究中有着广泛的应用。
纯化的mRNA可以用于mRNA的测序和定量分析。
纯化的mRNA可以用于构建基因文库，用于获得特定基因的cDNA。
纯化的mRNA还可以用于研究mRNA的转录调控和后转录修饰等重要生物学过程。
亲和色谱纯化真核mRNA技术对于研究mRNA的结构、功能和调控机制具有重要意义。
亲和色谱过程及在新冠疫苗研制过程中的作用 -回复
亲和色谱过程及在新冠疫苗研制过程中的作用-回复亲和色谱（Affinity Chromatography）是一种分离和纯化生物分子的有效技术方法。
它基于生物分子之间的亲和性，利用化学特性或生物活性之间的特异性相互作用，将目标分子与其他非特异性的分子分离开来。
亲和色谱在新冠疫苗研制过程中起着重要作用，下面我们将一步一步回答。
第一步：了解亲和色谱的原理和基本步骤亲和色谱的原理基于生物分子之间的亲和性相互作用。
常用的亲和色谱基质有固定金属离子、亲和剂、抗体等。
基本步骤包括亲和基质的固定、样品的加载、非特异性结合物的洗脱以及目标分子的洗脱。
第二步：了解新冠疫苗的研制过程新冠疫苗的研制过程包括病原体鉴定、蛋白表达和纯化、动物实验、临床试验等。
其中，蛋白表达和纯化是关键步骤之一，而亲和色谱在蛋白纯化过程中发挥着重要作用。
第三步：亲和色谱在新冠疫苗纯化中的应用在新冠疫苗研制过程中，亲和色谱可以用于纯化病毒蛋白或疫苗候选分子。
以新冠病毒(SARS-CoV-2)的刺突蛋白为例，亲和色谱可以通过与特异性抗体结合，将目标蛋白从复杂的混合物中纯化出来。
这样可以提高目标蛋白的纯度，为后续的研究和生产提供高质量的材料基础。
第四步：确定亲和色谱方法的条件在亲和色谱中，参数的优化对于纯化效果至关重要。
选择适当的亲和基质和结合条件，如pH、温度等，可以提高目标蛋白的结合和纯化效率。
这需要经过一系列的实验和优化，确保获得高纯度的蛋白。
第五步：亲和色谱在新冠疫苗研究中的挑战和解决方案亲和色谱在新冠疫苗研究中也面临一些挑战，如选择合适的亲和基质、处理大规模样品等。
针对这些问题，科研人员可以根据具体情况选择最适合的亲和基质，如用于大规模纯化的亲和膜；同时，进行工艺优化，如缩短纯化时间、提高产量等，以应对规模化研制的需求。
第六步：亲和色谱在新冠疫苗研制中的其他应用除了蛋白纯化，亲和色谱在新冠疫苗研究中还有其他应用。
例如，可以利用亲和色谱技术筛选出与病毒结合的中和抗体，用于研发新冠疫苗；亲和色谱也可以用于检测新冠病毒的存在和浓度，以监测疫苗疗效。
色谱分离技术—亲和色谱分离技术
亲和层析介质
亲和配基
常用的亲和配基： 辅酶和磷酸腺苷
某些酶需要在辅酶存在的情况下才能表现出催化活性，即辅酶能与脱氢酶 和激酶之间通过亲和作用相互结合，因此这些辅酶可用作脱氢酶和激酶的亲和 配基。
主要的辅酶有NAD、NADP、ATP。
亲和层析介质
亲和配基
常用的亲和配基： 过度金属离子
铜、镍、锌等可与氮、硫、氧等供电原子产生配位键，因此可与蛋白质表 面的组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸吲哚基发生亲和结合作用。
的亲和能力有决定性影响。
亲和色谱法的操作方法
1.配基固相化（样品制备、装柱、平衡） 2.亲和吸附 3.解吸附 4.色谱柱再生
亲和色谱法的操作方法
1.配基固相化 将与纯化对象有专一结合作用的物质，连接在水不溶性载体上，制成亲和
吸附剂后装柱（称亲和柱），用一定pH和离子强度的缓冲液对柱子进行平衡。 2.亲和吸附
即进料和杂质清洗。将含有目标产物的料液连续通入亲和柱，目标产物吸 附在柱上，之后用缓冲液淋洗色谱柱除去未被吸附的杂蛋白。
亲和色谱法的操作方法
3.解吸附 解吸附即目标产物洗脱。用某种缓冲液或溶液通过亲和柱，把吸附在亲和
柱上的目的产物洗脱出来。
亲和色谱法的操作方法
4.色谱柱再生 用几倍体积的起始缓冲液进行再平衡，一般足以使亲和柱再生，但一些未
亲和层析介质
亲和层析介质由载体和配基组成
亲和载体
载体应具备的条件： 1.载体必须具有较好的理化稳定性和生物惰性，非专业吸附小。 2.具有大量可供活化和配基结合的化学基团，以供与配基共价连接之用。 3.载体必须具有高度的水不溶性和亲水性。 4.载体必须有稀松的网状结构使大分子能自由进入。 5.载体要有良好的机械性能，颗粒均匀。
亲和色谱知识简介
亲和色谱原理及其应用陕西科技大学职业技术学院生物化工工艺092班郝少杰20090305247摘要：亲和色谱也称为亲和层析，是液相色谱的一个分支，主要用于生物分子的分离、纯化和分析。
是利用生物分子，特别是生物大分子与亲和色谱固定相表面配位体之间，存在的生物学和生物化学过程的特效性亲和吸附作用，来进行选择性分离生物分子的分离方法。
至今，亲和色谱已在生物化学、分子生物学、基因组学、蛋白质组学、生物工程、临床医学、新型高效药物研究中，成为常规的分离、分析和制备的有效工具，并且在生物大分子的结构、功能研究中，成为一种普遍采用的方法。
关键词：亲和色谱，分离方法，纯化，普遍采用的方法。
一、亲和色谱的原理生物大分子（肽、蛋白质、核酸等）的一个共同特性，是它们具有以特有的高效方式去识别或键合到其他分子上的能力，这就使得所有的生物大分子，可借助亲和作用过程来进行分离和纯化。
将一对能可逆结合和解离生物分子的一方作为配基（也称为配体），与具有大孔径、亲水性的固相载体相偶联、制成专一的亲和吸附剂，再用此亲和吸附剂填充色谱柱，当含有被分离物质的混合物随着流动相流经色谱柱时，亲和吸附剂上的配基就有选择地吸附能与其结合的物质，而其他的蛋白质及杂质不被吸附，从色谱柱中流出，使用适当的缓冲液使被分离物质与配基解吸附，即可获得纯化的目的产物。
二、一般流程亲和色谱分离的通常是混合在溶液中的物质，比如细胞内容物、培养基或血浆等。
待分离的分子在通过色谱柱时被固定相或介质上的基团捕获，而溶液中其他的物质可以顺利通过色谱柱。
然后把固态的基质取出后洗脱，目标分子即刻被洗脱下来。
如果分离的目的是去除溶液中某种分子，那么只要分子能与介质结合即可，可以不必进行洗脱。
三、影响亲和色谱的因素1、上样体积若目标产物与配基的结合作用较强，上样体积对亲和色谱效果影响较小。
若二者间结合力较弱，样品浓度要高一些，上样量不要超过色谱柱载量的5%~10%。
2、柱长亲和柱的长度需要根据亲和介质的性质确定。
亲和色谱
亲ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ层析原理图
影响亲和色谱的因素
• 1、上样体积 若目标产物与配基的结合作用较强，上样体积 对亲和色谱效果影响较小。若二者间结合力较弱，样品浓度 要高一些，上样量不要超过色谱柱载量的5%~10%。 • 2、柱长 亲和柱的长度需要根据亲和介质的性质确定。如果 亲和介质的载量(同上 求解释T ^T)高，与目标产物(目标物)的 作用力强，可以选择较短的珠子(柱子);相反，则应该增加柱 子的长度，保证目标产物与亲和介质有充分的作用时间。 • 3、流速 亲和吸附时目标产物与配基之间达到结合反应平衡 需要一个缓慢的过程。因此，样品上柱的流速应尽量的慢， 保证目标产物与配基之间有充分的时间结合，尤其是二者间 结合力弱和样品浓度过高时。 • 4、温度 温度效应在亲和色谱中比较重要，亲和介质的吸附 能力受温度影响，可以利用不同的温度进行吸附和洗脱。一 般情况下亲和介质的吸附能力随温度的升高而下降，因此在 上样时可选择较低的温度，使待分离物质与配基有较大的亲 和力，充分地结合;而在洗脱时刻采用较高的温度，使待分离 物质与配基的亲和力下降，便于待分离物质从配基上脱落。 例如，一般选择在4℃进行吸附，25℃下进行解
亲和色谱法
生物工程领域 2016-6-13
生物亲和作用
• 定义：生物物质，特别是酶和抗体等蛋白 质，具有识别特定物质并与之相结合的能 力。这种识别并结合的能力具有排他性， 即生物分子能够区分结构和性质非常相近 的其他分子，选择性地与其中一种分子相 结合。这种特异性的相互作用称为生物亲 和作用（bioaffinity）或简称亲和作用 (affinity)。
例：抗原抗体的特异性结合
电镜图片
抗原抗体结合示意图
相关仪器介绍
•
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亲和色谱原理和方法
亲和色谱原理和方法
亲和色谱法
相互间具有高度特异亲和性的二种物质之一作为固定相，利用与固定相不同程度的亲和性，使成分与杂质分离的色谱法。
例如利用酶与基质（或抑制剂）、抗原与抗体，激素与受体、外源凝集素与多糖类及核酸的碱基对等之间的专一的相互作用，使相互作用物质之一方与不溶性担体形成共价结合化合物，用来作为层析用固定相，将另一方从复杂的混合物中选择可逆地截获，达到纯化的目的。
可用于分离活体高分子物质、过滤性病毒及细胞。
或用于对特异的相互作用进行研究。
亲和色谱
过渡金属可形成螯合金属盐固定在固定相离子的 表面，用作亲和吸附的配基，这种利用金属离子 为配基的亲和色谱成为金属螯合亲和色谱或固定 化金属离子色谱
• 组氨酸：弱疏水性、咪唑环为弱电性
在盐浓度较低和pH约等于目标蛋白质等电点的溶 液中，固定化组氨酸的亲和吸附作用最强，随着 盐浓度的增大，吸附作用降低。 利用组氨酸为配基可亲和分离等电点相差较大的 蛋白质，洗脱则可采用增大盐浓度的梯度洗脱法
亲和色谱
• 利用生物亲和作用的原理纯化蛋白质的报道最早 见于1910年 • 有意识的利用生物亲和作用纯化蛋白质的研究始 于20世纪50年代初 • 1967年，亲和纯化技术从研究走向实用，出现了 亲和色谱这个名称 • 20世纪80年代以后，利用生物亲和作用的特异性 与其他分离技术相结合
定义
• 生物亲和作用：生物物质，特别是酶和抗 体等活性物质，具有识别特定物质并与该 物质的分子结合的能力。这种能力具有排 他性。生物分子间的这种 特异性相互作用 称为生物亲和作用。 • 亲和分离：利用生物分子间的特异性结合 作用的原理进行生物物质分离纯化的技术
• 肝素 与脂蛋白、脂肪酶、甾体受体等具有亲和作用。 其亲和作用在中性pH值和低浓度盐溶液中较强
亲和吸附剂及其制备 将亲和配基共价偶联在固体粒子的表面
（孔内）即可制备亲和吸附剂。
制备方法：书 323--325
配基固定化密度：吸附容量、空间位阻 作用 最佳密度值范围
亲和色谱
-间隔臂的作用
生物亲和作用
亲和作用的本质
亲和作用是自然界普遍存在的现象，生物分子间 的亲和作用具有更高的选择性。 蛋白质参与亲和作用的机理还不完全清楚，一般 认为蛋白质的立体结构中含有某些参与亲和结合 的部位，这些结合部位呈凹陷或凸起的结构。
亲和色谱名词解释
亲和色谱名词解释
亲和色谱（Affinity chromatography）是一种基于生物分子之间特异性相互作用的层析技术，用于分离和纯化特定的生物大分子，如蛋白质、核酸、糖等。
亲和色谱依赖于亲和剂（affinity ligand）与目标分子之间的特异性相互作用。
亲和剂通常是一种高度特异性结合到目标分子的物质，可以是抗体、酶、亲和标靶蛋白等。
这种特异性相互作用可以是通过离子交换、亲水性、金属离子的配位、疏水性等作用机制实现的。
亲和色谱的原理是将亲和剂固定在固定相上，并将混合物溶液通过柱床进行层析分离。
由于亲和剂与目标分子之间的特异性相互作用，目标分子可以选择性地结合到亲和剂上，而其他非目标分子则通过柱床被洗脱。
最后，目标分子可以通过改变缓冲条件、温度或添加特定的竞争性配体等方式进行洗脱。
亲和色谱具有选择性高、纯度好、操作简单等优点。
它广泛应用于生物医学研究、药物开发、生物制药等领域，特别适用于从复杂的混合物中高效分离纯化目标分子。
亲和色谱法affinity chromatography.doc
亲和色谱法affinity chromatography离子交换色谱法ion exchange chromatography，IEC离子色谱法ion chromatography离子抑制色谱法ion suppression chromatography离子对色谱法ion pair chromatography疏水作用色谱法hydrophobic interaction chromatography制备液相色谱法preparative liquid chromatography平面色谱法planar chromatography纸色谱法paper chromatography薄层色谱法thin layer chromatography，TLC高效薄层色谱法high performance thin layer chromatography，HPTLC 浸渍薄层色谱法impregnated thin layer chromatography凝胶薄层色谱法gel thin layer chromatography离子交换薄层色谱法ion exchange thin layer chromatography制备薄层色谱法preparative thin layer chromatography薄层棒色谱法thin layer rod chromatography液相色谱仪liquid chromatograph制备液相色谱仪preparative liquid chromatograph凝胶渗透色谱仪gel permeation chromatograph涂布器spreader点样器sample applicator色谱柱chromatographic column棒状色谱柱monolith column monolith column微粒柱microparticle column填充毛细管柱packed capillary column空心柱open tubular column微径柱microbore column混合柱mixed column组合柱coupled column预柱precolumn保护柱guard column预饱和柱presaturation column浓缩柱concentrating column抑制柱suppression column薄层板thin layer plate色谱图chromatogram色谱峰chromatographic peak峰底peak base峰高h，peak height峰宽W，peak width半高峰宽Wh/2，peak width at half height峰面积A，peak area拖尾峰tailing area前伸峰leading area假峰ghost peak畸峰distorted peak反峰negative peak拐点inflection point原点origin斑点spot区带zone复班multiple spot区带脱尾zone tailing基线base line基线漂移baseline drift基线噪声N，baseline noise统计矩moment一阶原点矩γ1，first origin moment二阶中心矩μ2，second central moment三阶中心矩μ3，third central moment液相色谱法liquid chromatography，LC液液色谱法liquid liquid chromatography，LLC液固色谱法liquid solid chromatography，LSC正相液相色谱法normal phase liquid chromatography反相液相色谱法reversed phase liquid chromatography，RPLC柱液相色谱法liquid column chromatography高效液相色谱法high performance liquid chromatography，HPLC 尺寸排除色谱法size exclusion chromatography，SEC凝胶过滤色谱法gel filtration chromatography凝胶渗透色谱法gel permeation chromatography，GPC浓缩区薄层板concentrating thin layer plate荧光薄层板fluorescence thin layer plate反相薄层板reversed phase thin layer plate梯度薄层板gradient thin layer plate烧结板sintered plate展开室development chamber往复泵reciprocating pump注射泵syringe pump气动泵pneumatic pump蠕动泵peristaltic pump检测器detector微分检测器differential detector积分检测器integral detector总体性能检测器bulk property detector溶质性能检测器solute property detector(示差)折光率检测器[differential] refractive index detector荧光检测器fluorescence detector紫外可见光检测器ultraviolet visible detector电化学检测器electrochemical detector蒸发(激光)光散射检测器[laser] light scattering detector光密度计densitometer薄层扫描仪thin layer scanner柱后反应器post-column reactor体积标记器volume marker记录器recorder积分仪integrator馏分收集器fraction collector工作站work station固定相stationary phase固定液stationary liquid载体support柱填充剂column packing化学键合相填充剂chemically bonded phase packing薄壳型填充剂pellicular packing多孔型填充剂porous packing吸附剂adsorbent离子交换剂ion exchanger基体matrix载板support plate粘合剂binder流动相mobile phase洗脱(淋洗)剂eluant，eluent展开剂developer等水容剂isohydric solvent改性剂modifier显色剂color [developing] agent死时间t0，dead time保留时间tR，retention time调整保留时间t'R，adjusted retention time死体积V0，dead volume保留体积vR，retention volume调整保留体积v'R，adjusted retention volume柱外体积Vext，extra-column volune粒间体积V0，interstitial volume(多孔填充剂的)孔体积VP，pore volume of porous packing 液相总体积Vtol，total liquid volume洗脱体积ve，elution volume流体力学体积vh，hydrodynamic volume相对保留值ri.s，relative retention value分离因子α，separation factor流动相迁移距离dm，mobile phase migration distance流动相前沿mobile phase front溶质迁移距离ds，solute migration distance比移值Rf，Rf value高比移值hRf，high Rf value相对比移值Ri.s，relative Rf value保留常数值Rm，Rm value板效能plate efficiency折合板高hr，reduced plate height分离度R，resolution液相载荷量liquid phase loading离子交换容量ion exchange capacity负载容量loading capacity渗透极限permeability limit排除极限Vh，max，exclusion limit拖尾因子T，tailing factor柱外效应extra-column effect管壁效应wall effect间隔臂效应spacer arm effect边缘效应edge effect斑点定位法localization of spot放射自显影法autoradiography原位定量in situ quantitation生物自显影法bioautography归一法normalization method内标法internal standard method外标法external standard method叠加法addition method普适校准(曲线、函数) calibration function or curve [function]谱带扩展(加宽) band broadening(分离作用的)校准函数或校准曲线universal calibration function or curve [of separation] 加宽校正broadening correction加宽校正因子broadening correction factor溶剂强度参数ε0，solvent strength parameter洗脱序列eluotropic series洗脱(淋洗) elution等度洗脱gradient elution梯度洗脱gradient elution(再)循环洗脱recycling elution线性溶剂强度洗脱linear solvent strength gradient程序溶剂programmed solvent程序压力programmed pressure程序流速programmed flow展开development上行展开ascending development下行展开descending development双向展开two dimensional development 环形展开circular development离心展开centrifugal development向心展开centripetal development径向展开radial development多次展开multiple development分步展开stepwise development连续展开continuous development梯度展开gradient development匀浆填充slurry packing停流进样stop-flow injection阀进样valve injection柱上富集on-column enrichment流出液eluate柱上检测on-column detection柱寿命column life柱流失column bleeding显谱visualization活化activation反冲back flushing脱气degassing沟流channeling过载overloading。
亲和色谱法的特点
亲和色谱法的特点
亲和色谱法: 亲和色谱法是利用生物分子间具有专一性亲和力的生物分子对而设计的色谱技术。
如酶的活性中心能与专一的底物、抑制剂、辅助因子以及效应剂通过次级键可逆地结合。
其他如抗体与抗原、RNA与DNA、激素与其受体、外源凝集素与细胞膜等体系均有类似特性。
因此选择好亲和物就可将某一生物分子有选择性地与其他物质分离,所以又称生物选择性吸附法。
操作时一般先将亲和物(配基)以共价键结合于一种不溶性的聚合物(载体)上,填充在色谱柱内,常用载体有葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶等。
为减小空间障碍、提高吸附效率,有时需在配基与载体之间连入有一定长度的烃基,称为“手臂”,使配基可伸出,以有较大的活动余地。
制备好的这种固定相填充在色谱柱内,使被分离的蛋白质通过色谱柱,由于蛋白质分子上的活性中心与亲和物相结合而被滞留,其他蛋白质分子无阻滞地流出得到分离。
然后改变洗脱剂的pH值、离子强度等,即可使被分离的蛋白质分子释出,达到分离纯化的目的。
此法在制备高纯度生化制剂中得到较多应用。
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加样吸附
目标分子与配体形成复合物而吸附在层析柱上 起始缓冲液的选择：配体-目标分子作用类型 疏水键，提高离子强度，不要采用低温操作； 离子键，降低离子强度 流速：低压亲和层析，流速50cm/h；高效液相 亲和层析，流速50～125cm/h。若结合力弱， 应降低流速 加样量：不超过亲和吸附剂的吸附容量
使用洗涤剂 极端疏水性蛋白质，如：膜蛋白 最好使用在280nm附近无吸收的非离子型 洗涤剂，如NP-40, Lubrol
使用促溶盐（chaotropic salt） 促溶盐能破坏水的结构，降低配体-蛋白质间疏 水作用的强度
← 蛋白质沉淀（盐析）效应增加 阴离子：PO43－, SO42－, CH3COO－, Cl－, Br－, NO3－, ClO4－, I－, SCN－ 阳离子：NH4+, Rb+, K+, Na+, Cs+, Li+, Mg2+, Ca2+, Ba2+ 蛋白质促溶（盐溶）效应增加 →
NADP
NADP依赖性脱氢酶
苯基硼酸盐 糖蛋白 Cibacron Blue F3G-A NAD(P)依赖性脱氢酶、激 酶、磷酸酶、白蛋白、干 扰素
Procion Red NAD(P)依赖性脱氢酶、干 HE-3B 扰素、抑制蛋白、纤溶酶 原
赖氨酸 纤溶酶、纤溶酶原、纤溶 酶原激活剂
单克隆抗体
特定抗原
过渡金属离 子
连接臂先偶联至载体后接配体
四、由氨基-Sep或羧基- Sep制备 Sep-(CH2)6-NH2 L-COOH AH-Sep Sep-(CH2)6-COOH L-NH2 CH-Sep 碳二亚胺法（配基偶联的一种方法）：
琼脂糖等多糖类载体
溴化氰法
最常使用，简单温和，活化效率高，速度快；反 应可逆，剧毒，可能带上电荷
接有连接臂的亲和层析用载体
载体
连接臂 3-氨基丙基和琥珀酰氨基丙基 3,3’-二氨基丙基和琥珀酰二氨基丙基
供应商 Bio-Rad Bio-Rad ICN Pharmacia Serva Miles IBF Merck
琼脂糖
1,2-二氨基乙烷, 1-二氨基己烷, 3,3’-二氨基二丙胺 1,6-己二胺, 6-氨基己酸 3,3’-二氨基丙基胺, 对苯甲酰基-3,3’-二氨基丙基 胺 氨基烷基(2,4,6,8,10)
配体 目标分子 配体 目标分子
5’-AMP
ATP NAD
NAD依赖性脱氢酶、ATP 依赖性激酶
ATP依赖性激酶 NAD依赖性脱氢酶
Poly(U)
凝集素 蛋白质A /蛋白质G 钙调蛋白 肝素
真核mRNA、Poly(U)结 合蛋白
糖蛋白 IgG或IgG对应抗原 钙依赖性酶 某些凝固蛋白、血浆蛋 白、脂蛋白、核酸相关 酶、受体等
含组氨酸的多肽或蛋白 质
㈢ 配体的浓度
一般使用较高的固定化配体浓度 配体亲和力高，且本身带电则浓度须降低 配体浓度过高引起色谱畸变。 (与很多物质发生非特异性结合)
㈣ 配体的选择
1. 考虑亲和势 L+S LS Kl= [L][S]/[LS] 要求Kl在10-4～10-8mol/L之间 2. 与L的偶联不破坏L与S的结合 3. 需了解L-S的作用机制 如……
㈠. ㈡. ㈢.
二、 加样吸附 样品平衡（透析或SephadexG-25） 样品体积Vs（一般＜5%） 若结合紧密，Vs可较大；不紧，Vs要小 洗去非吸附物（10Vt始缓洗）
三、洗脱（以S不变性为前提） 类专一：选择性洗脱、有分级分离要求、 梯度或阶式洗脱。
样品准备
加样前样品应当澄清，不含颗粒状物质，有适当的pH值、 离子强度以利于目标分子的结合
亲和吸附剂的制备过程
封闭未反应的活化基团
载体上活化基团浓度
5~25mol/ml 偶联上的配体浓度 1~10mol/ml 封闭试剂 pH8.0，1mol/L乙醇胺 甘氨酸 巯基乙醇 室温反应1h
配体浓度评估 差示分析法
直接测定法 放射分析法 水解法
连接臂的连接 连接臂先接配体后偶联至载体
亲和层析过程演示
亲和吸附剂的构成 载体（基质）、配体、连接臂
说明： 1.偶联用Gel（须是活化偶联介质） 2.亲和吸附剂 高度专一亲和吸附剂 类专一亲和吸附剂
3.按相互作用力划分： 次级键——亲和色谱 配位键——螯合色谱 共价键——共价色谱 疏水键——疏水色谱
亲和层析的必要条件: 合适的配体（配基、ligand) 合适的载体（Matrix) 合适的吸附和洗脱条件
第二节 亲和色谱配基 (ligand L) ㈠ 作为配体的条件
亲和力大;具有解离平衡;与载体偶联不失活
㈡常用系统
酶: 底物或类似物、辅助因子、可逆抑制剂、效应物 核酸: 互补顺序、组蛋白、结合蛋白、核酸多聚物 激素: 受体、运载蛋白 抗体: 抗原、病毒、细胞 外源凝集素: 多糖、糖蛋白、细胞
亲和层析常用配体
三、 由CNBr活化型Sep.4B制备 商品名：CNBr-Sepharose
一般步骤：
冻干粉
溶胀洗涤 溶解L ①
混合反应 ②
掩蔽 ③
洗去L（未结合）
成品
㈠.
溶胀和洗涤 用1mol/L HCl 溶胀洗涤除细碎粒子 ㈡. 偶联条件 注意： 前处理、偶联密度、缓冲液种类及pH ㈢. 掩蔽 偶联后有部分氰酸酯未偶联上 L，常利用 含-NH2的缓冲液或含-NH2的分子处理，将其 掩蔽。 ㈣. 洗去未结合L 用高-低交叉pH来洗（4～5次）
4.3
亲和色谱(层析)
Affinity Chromatography, AC 第一节 概述
原理 利用生物体中许多高分子化合物具有和 某些相对应的分子可逆结合的特性建立的 色谱法。 一、特点 高效、高收率、有浓缩效应，使用局限性
二、应用 高效从复杂混合物中得某一种物质； 基于生物功能可把有活性与无活性分开 三、基本过程 须找配基（它与底物专一可逆结合如下图）
羰基二咪唑（CDI）法 高碘酸盐法 磺化氟甲基吡啶鎓法 N-羟基琥珀酰亚胺法
其他亲和吸附剂
聚丙烯酰胺载体的亲和吸附剂可用戊二醛 法和肼解法活化,然后再将含氨基的配体固 定到其活化基团上;
硅胶和多孔玻璃载体的亲和吸附剂最常用 的修饰方法就是进行硅烷化处理,从而给载 体引入氨基或环氧基团.
三、手臂（Spacer arm） 在载体和配基间引入适当长度的“手 臂”，减少载体的空间阻碍，增加配基的 活动度。 示意图如下：
连接臂往往为由烃链组成的疏水性手臂（其长短 对吸附的影响大）或具氨基、羧基的亲水性手臂 （其长短对吸附的影响不大）； 疏水性手臂具体选择应考虑： ⑴ 分离物质分子量大小 ⑵ 亲和势大小 ⑶ 过长手臂易弯曲、折叠等； 最常用的连接臂有6-氨基己酸、1,6-己二胺和 3,3’-二氨基二丙胺。
亲和层析洗脱时常用的促溶剂有1～3mol/L硫氰 化钾、1～3mol/L碘化钾、4mol/L MgCl2 使用蛋白质变性剂 8mol/L尿素，6mol/L盐酸胍
Step elution
Gradient elution
专一洗脱(亲和洗脱)
使用配体，如：用不同的核苷酸将脱氨酶 从染料柱上洗脱 使用能与配体结合的分子，如：用游离糖 将糖蛋白从凝集素柱上洗脱 优点：洗脱条件温和，目标分子不会变性 缺点：价格昂贵，配体与目标分子结合后 需要进一步分离
第五节 一般实验方法
是否有类专一吸附剂 有 溶胀Gel 无 选L
选偶联Gel 偶联L
装柱
安装仪器
平衡（2～3Vt） 加样吸附 洗去非吸附物
亲和柱
再生
洗脱液
脱盐
一、亲和吸附柱的预备
㈠. 亲和吸附剂选择或制备 效能小试： 据资料等先选择始缓冲液种类、I、pH、t ①. 用10Vt始缓洗，若目的物未流出，说明吸 附性能好，α＞0.9 ②. 不断加样到目的物流出，确定吸附容量 ㈡. 柱 H/D 高度专一 短 类专一 长 平衡 一般2～3Vt始缓
第三节 亲和层析载体
一、作为载体的条件 1.亲水 2.惰性 3.具有活化基团 4.大网孔 5.机械性能好
二、载体的选择
1.琼脂糖凝胶： 亲水性强，理化性质稳定 （商品名：Sepharose） 2.聚丙烯酰胺凝胶： 理化性质稳定，耐有机溶剂及去污 剂， 抗微生物能力强， 特别适应用配基与提取物亲和力 比较弱的物质。 3.葡聚糖凝胶： 有良好的化学及物理性质，孔径小。 4.纤维素： 非特异吸附严重，廉价，易得。 5.多孔玻璃 ：物理性能好，有非特异性吸附。
例：酶 有单底物反应、双底物反应
单 E
A EA
P
E
EP
底物A、产物P或它们的类似物都可以
双底物依次
E
A
B
P Q
E EPQ EQ
EA EAB
须选择A、若选B则吸附时须加A
双底物随机
A（B） B（A） P（Q） Q（P） E E EA EA（B） EPQ
A、B都可选择 对A、B的选择仅取决于它们亲和势的 大小和固定化的难易程度。
洗脱方式总结:
pH变化（破坏静电引力） I变化 （减弱静电引力、范德华力） 亲和洗脱 L的类似物L′，S的类似物S′ *采用酶促反应的多元专一性洗脱 ㈣. 表面活性剂 减少疏水作用、范德华力 种类常有：曲通X100 1%（V/V）、乙二醇等 ㈠. ㈡. ㈢.
㈤. 解离试剂 主要破坏氢键，如尿素、盐酸胍等 ㈥. 降低温度t 较高t吸附、较低t洗脱、减少疏水力 ㈦. 电泳解吸 + 在柱两端连上电极进行电泳