连消

连消

1．连续灭菌（连消）(Continuous sterilization): 是采用专一灭菌设备—-连消塔，在高温下对液体培养基进行短时间加热灭菌。

优点：（1）培养基受热时间短（135~ 140℃，可在20～30s达到预定灭菌温度），营养成分破坏少；从而提高了原料的利用率，比“实罐灭菌”（120℃，30分钟）提高产量5～10％；（2）质量均匀；（3）生产中蒸汽负荷均衡；（4）适用于自动控制。（5）提高了发酵罐利用率。

适用条件：大规模生产，培养基中不含有固体颗粒或泡沫较少。

实消

分批灭菌，又叫实消(Batch sterilization)

指培养基在发酵罐中分批灭菌。

优点：无需专一灭菌设备，但易发生局部过热而破坏营养成分的现象。

适用条件：当培养基中含有固体颗粒或培养基有较多泡沫时，以采用分批灭菌为好。对于容积小的发酵罐，连续灭菌的优点不明显，而采用分批灭菌比较方便。

影响培养基灭菌的因素

1.微生物的热阻

2.微生物的热死规律——对数残留定律

3.反应速度常数k在相同温度下，k值愈小，则此微生物愈耐热。同一种微生物在不同温

度下，k值也不相同，灭菌温度愈低，k值愈小，温度愈高，k值愈大。

4.培养基灭菌温度的选择

灭菌过程中微生物的死亡属于化学反应中一级反应动力学类型，培养基成分破坏也属于一级动力学反应，当其他条件不变时，反应速度常数与温度的关系也可用阿累尼乌斯方程式k=Ae-E/RT表示。温度升高，菌死亡速率大于培养基成分破坏的速率。

5.培养基pH ：培养基中氢离子浓度直接影响灭菌的效果。培养基的酸碱度越大，所需

杀灭微生物的温度越低。pH6.0-8.0时最难灭菌。

6.培养基成分：油脂，糖类及一定浓度的蛋白质可增加微生物的耐热性，另一些物质，如

高浓度的盐类，色素等可削弱其耐热性。

7.培养基中的颗粒

8.泡沫

9.抗菌药物的影响：抗菌药物加湿热灭菌，是较好的方法。因为药物能改变细菌细胞的生

理反应，从而改变其耐热性。

10.原材料含菌量。天然材料比化学试剂多。

空气除菌的方法、流程及提高效率的措施（小测）方法：加热灭菌、静电除尘、过滤除菌

空气除菌总流程如下：

高空采风→粗滤器→空压机→贮罐→冷却器→油水分离器→丝网分离器→加热器→总过滤器→分过滤器→发酵罐

提高除菌效率的主要措施有以下几方面：

A．减少进口空气的含菌数

B．设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌效率高的过滤介质。

C．设计合理的空气预处理设备，以达到除油、水和杂质的目的。

D．降低进入空气过滤器的空气相对湿度，保证过滤介质在干燥状态下工作。

营养缺陷型的筛选（青霉素法）

营养缺陷型的检出（影印法）

染菌与防治

纯种培养要求必须防止杂菌污染。为防止染菌，采取了一系列措施：密闭式发酵罐、无菌空气、无菌室、培养基和设备灭菌、无菌操作。但是染菌无法彻底避免，据报道国外抗生素发酵染菌率为2％~5%。染菌影响产率、质量、三废治理都有很大的影响。

1．染菌的影响

1）分解产物

2）污染产品

3）抑制生产菌的生长

4）阻止目的产物的产生

5）影响产物的提取及质量

6）造成经济损失

2、染菌的检查、分析和防治

一、种子培养和发酵的异常现象

1、种子培养异常

（1）菌体生长缓慢：原料质量、菌体老化、供氧不足、温度、酸碱度，种子冷藏时间长或接种量过低。

（2）菌丝结团：菌丝团中央结实，内部菌丝的营养吸收和呼吸受到影响，不能正常生长。原因多而且复杂。

（3）代谢不正常：接种物质量和培养基质量、培养环境查，接种量小、杂菌污染等有关2、发酵异常

（1）菌体生长差：种子质量的影响；导致代谢缓慢。

（2）pH不正常：培养基质量、灭菌效果、补糖等影响；是所有代谢反应的综合反映。（3）溶解氧异常

染菌：染好氧菌，染厌氧菌

（4）泡沫过多。的消长不符合规律；培养基灭菌时温度过高或时间过长，葡萄糖变成氨基糖会引起泡沫。

（5）菌体浓度过高或过低

罐温长时间偏高；溶氧不足；营养条件差；种子质量差；菌体自溶。

染菌的检查与判断

从三方面进行：

1）无菌试验。断发酵是否染菌应以无菌试验结果为根据。

无菌试验的目的：

1，监测培养基、发酵罐及附属设备灭菌是否彻底

2，监测发酵过程中是否有杂菌从外界侵入

3，了解整个生产过程中是否存在染菌的隐患和死角

2）显微镜检查。目前生产上常用的杂菌检查方法有：

①微镜检查：染色镜检（最简单、最直接、最经常）

多在染菌程度较深时，用于判断杂菌的种类，靠显微镜无法发现染菌初期的杂菌。

②平板划线检查或斜面培养检查：平板制好后，应先保温24小时，确定无菌

倒平板空培养待测样品划线培养观察

③酚红肉汤培养检查：（酚红变色pH6.8-8.4）

无菌肉汤培养基空培养接入样品培养观察

3）生理生化指标的变化

除了以上的方法外，在实际生产中还可以根据以下参数的异常变化来判断是否染菌。结合计算机，建模后，可以及早发现与预测染菌。

降糖速度、生长速度、pH值、溶解氧、光密度、排气中CO2含量、产物含量、O2的消耗。如CO2的含量变化是有规律的；染菌引起糖的消耗变化，染好氧性杂菌，糖耗加快，CO2含量增加；染噬菌体，糖耗减慢，CO2含量减少

检测方法比较：显微镜检查简便、快速，能及时发现杂菌，但由于镜捡取样少，视野的观察面也小，因此不易检出早期杂菌。平板划线法和肉汤培养方法的缺点是需经较长时间培养(一般要过夜)才能判断结果，且操作较繁琐，但它要比显微镜能检出更少的杂菌，而且结果也更为准确。

染菌原因分析

主要染菌原因：种子带菌，无菌空气带菌，设备渗漏，灭菌不彻底，操作管理不当。

染菌途径及预防

1、种子带菌的防止

（1）培养基及用具灭菌要彻底，应防止假压；

（2）菌种在转接过程中受污染：操作不当，管理不严；（缓冲间）

（3）菌种在培养或保存过程中受污染（试管塞，查看的时候要注意）

2、无菌空气带菌及其防止：流程设计，介质灭菌

在生产实践中，空气管道大多与其它物料管道相接，要装上止逆阀防止其它物料窜入空气管道污染过滤器，导致过滤介质失效。

3、培养基和设备灭菌不彻底导致染菌及防治

（1）原料性状：淀粉质原料，升温过快或混合不均匀，易结块，团块中包埋的活菌不易杀灭；可升温前搅拌和加淀粉酶。

（2）实罐灭菌时未充分排除罐内空气：造成假压，升温时，应打开排气等阀门放气。（3）连续灭菌时，蒸汽压力波动大，培养基未达到灭菌温度，导致灭菌不彻底。

（4）设备和管道存在“死角”

死角：由于操作、设备结构、安装或人为造成的屏障等原因，引起蒸汽不能有效到达或不能充分到达预定应该到达的局部灭菌部位，从而不能达到彻底灭菌的要求。

常见的设备、管道“死角”：发酵罐的“死角”：不锈钢衬里破裂造成死角，发酵罐罐底脓疱状积垢。管道安装不当形成的死角

染菌后的培养基必须灭菌后才可放下水道。灭菌方法：可通蒸汽灭菌，也可加入过氧乙酸等化学灭菌剂搅拌半小时，才放下水道。否则由于各罐的管道相通，会造成其它罐的染菌，而且直接放下水道也会造成空气的污染而导致其它罐批染菌。

凡染菌的罐要找染菌的原因，对症下药，该罐也要彻底清洗，进行空罐消毒，才可进罐。染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒，空气用甲醛熏蒸。特别，若染噬菌体，空气必须用甲醛蒸汽消毒。

4、设备渗漏引起的染菌及其防止

（1）发酵设备、管道、阀门长期使用，由于腐蚀、摩擦和振动等原因，造成渗漏。（2）微小渗漏的检查：加入碱性水，用浸湿酚酞指示剂的白布擦，有渗漏则白布显红色。

5、操作失误导致染菌及其防治

（1）灭菌过程中严防泡沫升顶，尽可能添加消泡剂防止泡沫大量产生；

（2）传感器探头用化学试剂浸泡法灭菌可能导致灭菌不彻底。