干货 I 细胞复苏、冻存、传代之实验操作及注意事项

细胞培养之实验操作及注意事项｜细胞复苏/冻存/传代

一、细胞培养前期准备工作

细胞培养仪器设备：

●细胞培养通风橱（即生物安全柜）

●培养箱（通用推荐：湿式二氧化碳培养箱）

●离心机

●医用冰箱（4℃）和冰柜（-20℃）、生物超低温冰箱（-80℃）、液氮冷冻罐●倒置显微镜

其他用品：细胞培养容器（培养瓶、培养皿、多孔板等），吸管和移液器，培养基、血清和试剂

注意事项:

●无菌工作区域：细胞培养实验室的主要要求是需要维持细胞培养操作工作区

域处于无菌状态，最简单经济的方式就是使用细胞培养通风橱。

●无菌试剂和培养基：商品化试剂和培养基经过严格的质量控制以确保无菌，

注意操作过程中不要被污染，其他试剂和溶液需要选择适当的灭菌方法（例如：高压蒸汽、无菌过滤等）进行灭菌。

●无菌操作：要求操作人员在实验开始前对工作区域和双手操作部分进行75%

酒精消毒；尽量使用一次性塑料吸管进行单次操作，避免交叉污染；试剂瓶和培养用具使用时方可开盖，用后要第一时间盖上，暴露于环境中的时间尽可能要短。

●整体的细胞实验环境也弥足重要，需要定期对实验室环境进行较为彻底的清

扫消毒和杀菌，包括实验用仪器和室内地面、桌面等。

二、细胞的复苏与冻存

细胞复苏：

在细胞状态不足以满足实验需求或者出现细胞污染的情况下，需要进行细胞复苏：a)从超低温冰箱或者液氮中取出自保存或商品化购买的冻存细胞后，快速转移

至37℃水浴条件下轻轻转动融化（一分钟内）。

b)75%酒精擦拭冻存管外部后，转移至通风橱中。

c)加入适量新鲜的完全培养基混合，约800-1000rpm下离心5-10分钟，实

际离心速度时间取决于细胞种类和细胞状态。

d)新鲜培养基重悬后接种于相应的培养器皿中，做好标记，37℃，5%CO2条

件下培养。

细胞冻存：

为现有细胞系做细胞储备，需要对代数相对靠前的细胞进行扩增培养和细胞冻存：

a)准备细胞冻存液，置于2℃-8℃下备用。

b)观察待冻存的细胞，密度达到80%-90%左右，将贴壁/悬浮细胞分别按照传

代方法收集。

c)使用血球计数板对细胞密度进行大致估算后，计算出冻存溶液的体积，从而

保证单支冻存细胞有足够的细胞量用于复苏。

d)约800-1000rpm下离心5-10分钟，无菌条件下小心弃去培养基，不要搅

动细胞沉淀。

e)用合适体积的预冷后冻存液重新混悬细胞沉淀，分装至冻存管中，做好标记

后进行梯度降温至液氮环境中保存，入库。

*对于传统的细胞冻存，需要进行程序降温（4℃→-20℃→-80℃→液氮）冻存，为避免操作流程的繁琐不可控，可选用无血清非程序降温细胞冻存液，包括Cellregen无血清细胞冻存液和无血清低DMSO细胞冻存液。两种细胞冻存液均有无血清、无动物源蛋白、非程序降温的特点，可直接放置-80℃冰箱冻存。附：冻存液对比

注意事项：

细胞的复苏中，如细胞对温度比较敏感，可将生长培养基预热至37℃后再加入融化后的细胞冻存液中混匀。

●将复苏的细胞高密度接种，如两支冻存细胞接种到一个孔板中，可有效提高

复苏效率。

●细胞冻存，在加入冻存液进行分装的过程中，要不时轻轻混合细胞，使其保

持均匀的细胞悬液状态，更有利于保证细胞的冻存效果。

三、细胞传代

贴壁细胞传代流程：

1.当培养贴壁细胞密度达到80%左右即可细胞的传代操作，从培养器皿中吸弃

原有的细胞生长培养基。

2.使用不含钙镁离子的平衡盐溶液轻轻润洗细胞（缓冲液用量根据培养器皿的

表面积调整），避免搅动细胞，前后轻晃动器皿数次。

3.吸弃缓冲液，重复润洗一次。

4.向培养器皿中加入适量的预热解离剂（如胰蛋白酶等），充分覆盖细胞层，轻

轻晃动容器数次。

5.将培养器皿在室温下孵育2-5分钟。实际孵育时间实际根据细胞系的种类不

同而定。

6.移至倒置显微镜下观察细胞解离情况，可轻轻拍打器皿壁沿以加快细胞解离。

7.当细胞解离程度大于90%，加入三倍于解离液体积的生长培养基中止解离过

程，轻轻晃动后吹打细胞，收集至无菌离心管中。

8.约800-1000rpm下离心5-10min，实际离心速度时间取决于细胞种类和细

胞状态。

9.弃去含解离剂的上清溶液，用最少体积的生长培养基重悬细胞沉淀，混匀后

取出少量使用血球计数板计算细胞数量。

10.将细胞悬液稀释到该细胞系推荐的接种密度，并将适量体积的细胞悬液转移

至新的细胞培养器皿中放回培养箱。

悬浮细胞传代流程：

1.当细胞生长至适合传代（即处于对数生长期而未达到聚合的状态）时，从培

养瓶中吸取出少量的细胞样品，如有细胞已部分沉淀，要先轻轻晃动培养瓶使细胞处于均匀的悬浮状态后再取样。

2.使用血球计数板对细胞进行计数。

3.计算将细胞稀释到推荐接种密度所需要的加入的培养基体积，如有必要，可

先对培养瓶中细胞进行离心收集（800-1000rpm、5-10min）后再重悬计数和接种。

4.在无菌状态下将适量预热的生长培养基加入培养瓶中，必要时可将培养的细

胞分散接种到多个培养瓶中。

5.将培养瓶的旋盖外旋一圈，便于进行充分的气体交换（或者使用透气性瓶盖），

并将培养瓶放回培养箱中继续培养。

注意事项：

●贴壁细胞在进行解离（消化）过程中，如果室温下效果不理想，可转移至37℃

培养箱中加快该过程，但要注意控制时间，每30秒需要镜检一次。

●细胞在缓冲液润洗过程中要尽量完全彻底，培养液中的血清残留会影响消化

效果。