液相色谱原理基础知识1
液相色谱的原理以及操作要点
液相色谱的原理以及操作要点液相色谱（Liquid Chromatography，简称LC）是一种常用的分离和分析技术，它基于不同物质在流动相中的分配行为来实现分离。
本文将介绍液相色谱的原理，同时探讨液相色谱的操作要点。
一、液相色谱的原理液相色谱的原理主要基于两个关键概念：分配系数和吸附性质。
1. 分配系数分配系数（Distribution coefficient）是指样品在固定相和流动相之间的分配比例。
它是液相色谱中物质分离的基础。
分配系数的大小决定了物质在固定相上停留的时间，从而实现了不同成分的分离。
2. 吸附性质液相色谱还涉及到物质在固定相上的吸附行为。
当样品溶液通过固定相时，固定相表面上的吸附剂与样品物质发生相互作用，使得物质被吸附，从而发生分离。
二、液相色谱的操作要点为了有效地进行液相色谱实验，以下是一些操作要点需要注意：1. 样品制备样品制备是液相色谱分析的首要步骤。
样品应准备恰当，并考虑到溶解度、稳定性以及待分析物之间的相互干扰。
此外，样品需要经过适当的前处理（如过滤、稀释等）以达到分析要求。
2. 流动相选择流动相的选择对液相色谱分离效果起到至关重要的作用。
合适的流动相应能够与待分析物有良好的相容性，并且具有适当的溶解性和流动性。
常用的流动相包括水、有机溶剂和缓冲溶液。
3. 固定相选择固定相是液相色谱中的另一个关键部分。
不同的固定相具有不同的化学性质，因此会影响到分离的选择性和效果。
根据待分析物的特性，选择合适的固定相对于分离效果至关重要。
4. 色谱柱选择色谱柱是液相色谱系统中用于分离的核心组成部分。
不同的色谱柱具有不同的长度、直径和固定相材料，这些参数会影响到分离性能和分析时间。
根据待分析物的特性和分离要求，选择合适的色谱柱尤为重要。
5. 色谱条件优化为了获得最佳的分离效果，需要进行色谱条件的优化。
例如，可以调整流速、梯度程序和柱温等参数，以达到更好的分离和峰形。
6. 数据处理和解释液相色谱实验完成后，需要对得到的色谱图进行数据处理和解释。
液相色谱仪的原理
液相色谱仪的原理液相色谱仪是目前最常用的分离分析技术之一，主要用于生物、医学、化学、食品等领域的分子分离和检测。
该仪器的工作原理是基于物质在液相中的相互作用和运动规律进行分离，其表现形式是将待分离的混合液进样口，通过一系列的固定相介质进行分离，最后得到不同组分的峰形。
下面将详细介绍液相色谱仪的原理。
1. 液相色谱仪的基本构成液相色谱仪主要由三部分组成：进样系统、色谱柱及检测器。
（1）进样系统进样系统是将待分离的混合液输入色谱柱的装置，其主要组成部分是进样管（或进样器）、进样阀、移液器、进样泵和自动进样器。
进样系统的主要作用是把待分离的混合液均匀地输送到色谱柱中，并在一定时间内恒定流量地保持进样量。
（2）色谱柱色谱柱是液相色谱仪的核心部件，它的主要作用是将待分离的混合液进行分离，色谱柱一般采用高效液相色谱（HPLC）柱，根据固定相的不同，分为反相柱、离子柱、大小分离柱等。
其中反相柱是最常用的，其固定相材料是碳链、C18等疏水性材料，色谱柱的尺寸和尺寸分布对分离结果影响很大。
（3）检测器检测器是用于检测样品分离出来的不同化合物峰形的仪器，它的作用是将不同组分的物质转换为电、光或其他信号，进而检测其浓度和特性。
常用的检测器有紫外光谱检测器、荧光检测器、电化学检测器、质谱检测器等。
其中紫外光谱检测器最常用，其原理是光在样品中产生吸收，形成图谱。
液相色谱的分离原理是利用物质在液相中的物理、化学或生物相互作用进行分离。
其中液相是物质在分离中发生交互作用的媒介，液相的选择对液相色谱分离效果的影响很大。
一般液相色谱中分为移动相和固定相两种。
移动相是指流经固定相的溶液，主要用于运输待分离的混合物质。
固定相是指置于色谱柱内的固体或固体填料，通过其特定的化学性质，与样品分子进行物理或化学上的交互作用，使得不同组分的物质分离出来。
常用的固定相材料有反相材料、离子交换材料、氢氧根离子交换材料、硅胶等。
3. 液相色谱的操作步骤（1）样品准备：每次实验前应将待分离的样品制备好，包括样品的溶解、过滤、稀释等操作，确保样品清晰透明，无杂质，符合要求。
液相色谱基础知识
原理： ☼ 原理：根据物质在某些介质中电离后所产生的电 导变化来测定电离物质含量。 导变化来测定电离物质含量。广泛应用于 离子色谱法。 离子色谱法。
☼ 优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，可用 优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，
梯度洗脱。 梯度洗脱。 缺点：对温度变化敏感，每升高1℃, ℃,电导率增加 ☼ 缺点：对温度变化敏感，每升高 ℃,电导率增加 2%-2.5%。
液相色谱基础知识
■ 溶剂等级
☼鬼峰的出现
洗脱曲线
☺水/MeOH梯度 ODS ODS柱 1ml/min在 0~10Mins内 MeOH 0~100% 线性变化后 保持15Min
鬼峰
液相色谱基础知识
■ 溶剂等级
在微量分析和梯度洗脱时建议使用HPLC级溶剂和纯化水 级溶剂和纯化水 在微量分析和梯度洗脱时建议使用
0.001~9.999
岛津VP系列液相色谱仪 岛津VP系列液相色谱仪 VP
柱塞和密封圈的关系
水 出口单 向阀 密封圈 吸液移动 柱塞杆 送液移动 入口单 向阀 泵头清洗流路 流动相
岛津VP系列液相色谱仪 岛津VP系列液相色谱仪 VP
手动进样阀7725i原理
岛津VP系列液相色谱仪 岛津VP系列液相色谱仪 VP
☺无在线脱气机应注意：
1 每天脱气 2 如使用氦脱气，对混合好的溶剂脱气时间不能过长。
液相色谱基础知识
梯度形式的选择
洗脱模式：高压梯度
低压梯度 用两台输液泵将两种流动相混合并进入系统 常压下用比例阀将流动相混合，单泵进入系统
☺线性梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间成线性变化（增或减） ☺指数梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间成指数关系（增或减） ☺折线梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间无规则变化
高效液相色谱HPLC基本原理
Take peak spectrum
Match: 998
Compare with library
250 300 250 300 W a v e l e n g t h (nm)
W a v e l e n g t h (nm)
*Library Searching may be performed in an automated fashion.
一、 概述 高效液相色谱 (HPLC) 是以溶剂液体为流动相的色谱方法。按照固定相 不同可分为：液液分配色谱；吸附色谱(液固色谱)；离子交换色谱；尺寸排
阻色谱(凝胶渗透色谱)。
早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径1~5cm, 长50~500cm的玻 璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充的固定相颗粒直径多在 150~200m范围内。即使这样，流速仍然很低(<1mL/min)，分析时间仍然很
2）荧光检测器
许多有机物具荧光活性，尤其是芳香族化合物具有很强的活性。荧光检测 器是一种选择性很强的检测器，其灵敏度比UV检测器高2~3个数量级。
3）示差折光检测器 原理：利用两束相同角度的光照射溶剂相和样 品+溶剂相，利用二者对光的折射率不同，其中一 束（通常是通过样品+溶剂相）光因为发生偏转造 成两束光的强度差发生变化，将此差示信号放大并 记录，该信号代表样品的浓度。 为通用型检测器，灵敏度为10-7g/mL。但对温 度变化敏感，且不适于梯度淋洗。
串联泵 单元泵原理
单元泵工作原理
Damper阻尼器
Outlet Ball Valve出口 单向阀
Purge valve 冲洗阀
Active Inlet Valve入 口单向阀
液相色谱仪原理
液相色谱仪原理液相色谱仪是一种广泛应用于分析化学领域的仪器，其原理基于溶质在流动液相与固定相之间的分配行为。
液相色谱仪在实验室中被广泛应用于化合物分离、纯化及定量分析。
本文将介绍液相色谱仪的基本原理和工作过程。
1. 液相色谱仪基本原理液相色谱仪是利用流动相和固定相之间的亲疏作用分离化合物的一种分析仪器。
在最简单的液相色谱仪中，流动相即液相通过一固定相的柱子，被分离的化合物因为分配系数不同而在柱子中分离。
固定相通常为多孔质量均一的固体，而流动相则是液态。
根据化合物在流动相和固定相之间的分配系数不同，可以实现不同化合物的分离。
2. 液相色谱仪的工作原理液相色谱仪的工作原理可以简单概括为固定相对化合物进行分配，不同化合物依据分配系数在固定相上停留时间不同而被分离。
液相色谱仪通常由进样器、流动相泵、柱子、检测器和数据处理系统组成。
•进样器：用于将待分析样品注入进流动相中。
•流动相泵：将流动相以一定速率通过柱子。
•柱子：填充了固定相的柱子，分离化合物。
•检测器：检测化合物在流出的过程中浓度的变化。
•数据处理系统：将检测到的数据转换为图谱或结果输出。
3. 液相色谱仪的应用液相色谱仪广泛应用于药物、环境、农业等领域的分析中。
其高效、准确的分离和定量分析功能，使其成为科研、医疗和生产实验室中不可或缺的分析仪器之一。
通过液相色谱仪的应用，科研人员可以更加准确地分析样品成分，而在生产中，液相色谱仪则具有纯化化合物、检测杂质、质量控制等重要作用。
结论通过本文介绍，我们了解到液相色谱仪是一种利用流动相和固定相之间的分配行为进行化合物分离的重要分析仪器。
其基本原理是化合物在不同相之间的分配系数不同，通过这一原理实现对化合物的分离和分析。
液相色谱仪在科研和生产实验室中扮演着重要的角色，为我们的分析工作提供了有力的支持。
液相色谱基础知识
液相色谱—视差折光检测器
检测器组成：光源——透镜——两 束平行光——样品池和参比池—— 光电二极管——比较两者信号差 值——输出信号 。
液相色谱—凝胶色谱
பைடு நூலகம்
凝胶渗透色谱仪（GPC仪）、体积 排阻色谱(Size Exclusion Chrom.) 。 分离原理：利用多孔物质做固定相， 按照待测组分分子尺寸大小进行分 离。测定相对分子量大小、分子量 分布。
环己烷
正丁醇 乙醇 水 异丙醇
乙酸正丙酯
丙酸甲酯 四氯化碳 N,N-二甲基 甲酰胺 苯
260
260 265 270 280
碘甲烷
二硫化碳 硝基甲烷 硝基乙烷 2-硝基丙烷
350
380 380 380 380
甲醇
甲苯
285
液相色谱—荧光检测器
荧光检测器：样品中物质分子能在 特定波长的光激发后跃迁到高能级 状态，在返回到基态的过程中，会 发出波长较长的光，称做荧光。 荧光强度F=I0Φabc I0——激发光强度 Φ——荧光量子产率
Refractive Index Detector
A valve is opened and pure solvent passes into one half of a cell. The eluate flows through the other half of the cell. The two halves are separated by a glass plate mounted at an angle such that bending of the incident beam occurs if the two solutions differ in refractive index.
液相色谱基础理论知识
一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
又称为色层法、层析法。
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（T swett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。
后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。
高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。
它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。
又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。
也称现代液相色谱。
二、HPLC的特点和优点HPLC有以下特点：高压—压力可达150~300Kg/cm2。
色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。
高速—流速为0.1~10.0 ml/min。
高效—可达5000塔板每米。
在一根柱中同时分离成份可达100种。
高灵敏度—紫外检测器灵敏度可达0.01ng。
同时消耗样品少。
HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：速度快—通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。
分辨率高—可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。
灵敏度高—紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。
高效液相色谱法基本原理
高效液相色谱法基本原理
1．基本概念
色谱峰参数：峰高或峰面积(用于定量)，峰位(保留值表示，用于定性)，峰宽(用于衡量柱效)
保留值：保留时间、死时间、调整保留时间
峰宽：标准差、半峰宽、峰宽（色谱峰展宽是指由于柱内外各种因素引起的色谱峰变宽或变形，从而造成柱效降低）
2.塔板理论：把组分在两相间的连续转移过程，分解为间歇的在单个塔板中的分配平衡过程
理论塔板数 n=5.54(tr/wh/2)2
色谱柱的理论塔板数越多，柱效越高；同样长度中塔板高度越小，柱效越高。
3.速率理论：主要说明使色谱峰扩张而降低柱效的因素
范氏方程 h=a b/μ cμ
a为涡流扩散项。
采用适当粒度、均匀的填料并填充均匀可减小涡流扩散
b为纵向扩散系数。
流动相为液体，柱温为室温，b/μ可忽略不计
c为传质阻抗系数。
在能完全覆盖载体表面的前提下，应适当减少固定液用量。
液相色谱基本原理
液相色谱基本原理
液相色谱（Liquid Chromatography，简称LC）是一种基于溶
液流动性的分离技术，广泛应用于化学、生物、医药等领域。
其基本原理是将待分析的混合物通过溶液流动，并在固定相上进行分离。
液相色谱的基本原理包括以下几个方面：
1. 手段：液体作为流动相，传递溶解后的待测物进入色谱柱中。
2. 色谱柱：色谱柱是液相色谱的核心部件，通常由一根加有固定相（Stationary Phase）的管道组成。
固定相的选择取决于待
分离物质的性质，如极性、分子大小等。
3. 固定相：液相色谱中的固定相可以是脂肪、硅胶、酸性树脂等。
固定相的选择应根据待测物质的极性、溶解性等特点。
4. 流动相：流动相在液相色谱中起到溶解、输送待测物质的作用。
流动相可以是无机溶液、有机溶剂或其混合物。
5. 分离机理：在液相色谱中，样品分离主要通过样品分子在固定相表面上与流动相的相互作用来实现。
不同成分在固定相上的相互作用力量差异较大，从而导致它们在色谱柱中以不同速度移动。
6. 检测器：液相色谱的检测器用于检测分离出的各个组分，并将其转化为电信号进行记录和分析。
常用的检测器包括紫外-
可见吸收检测器、荧光检测器、电子喷雾检测器等。
液相色谱的基本原理是基于分子之间的相互作用力差异实现物质的分离。
通过调整流动相的成分、固定相的性质或改变操作条件等，可以实现对不同成分的定量分离和分析。
液相色谱具有灵敏度高、分析速度快、选择性好和适用性广等特点，成为许多实验室和工业界的常用分析技术之一。
液相色谱原理及操作
液相色谱原理及操作液相色谱（Liquid Chromatography，简称LC）是一种基于样品在液相中与固定相之间分配系数差异的分离技术。
液相色谱广泛应用于医药、食品、环境等领域，具有分离效率高、样品处理简便、分析速度快等优点。
本文将介绍液相色谱的原理和操作方法。
一、液相色谱的原理1.分离原理液相色谱将样品溶解在流动相中，通过样品与固定相之间的相互作用，使得组分在固定相上进行吸附和解吸过程，从而实现组分之间的分离。
其中的吸附和解吸过程分别对应了样品分子和流动相之间的平衡状态，即“样品在固定相上吸附的速度等于样品从固定相上解吸的速度”。
2.固定相的选择和作用固定相通常是一种多孔的颗粒状材料，如硅胶、葡萄糖凝胶、氨基硅胶等。
固定相的选择应根据分析样品的特性和需求来确定。
对于极性物质，一般选择非极性固定相；对于非极性物质，一般选择极性固定相。
固定相通过化学亲和性、电荷分布以及空间效应等力对样品进行吸附和解吸，实现组分的分离。
3.流动相的选择和作用流动相通常是溶解在有机溶剂或水中的溶液或混合溶剂。
流动相的选择要根据样品的特性、需求和固定相的性质来确定。
流动相的作用包括维持固定相的湿润、分散样品、稀释样品、提供适当的流动速度等。
4.检测器的选择和作用液相色谱中常用的检测器有紫外可见光检测器、荧光检测器、电化学检测器等。
检测器的选择应根据样品的特性以及分析方法的要求来确定。
检测器的作用是对样品组分进行定性和定量分析、检测检测物质的浓度、检测化学反应等。
二、液相色谱的操作方法1.样品的准备样品的制备要根据不同的分析目的进行。
样品的处理可以包括固体样品的研磨、溶解、萃取等步骤。
在样品制备过程中要注意避免样品的氧化、光降解、挥发等影响分析结果的因素。
2.设备的准备液相色谱仪的主要组成部分包括进样器、流动相驱动装置、固定相柱和检测器等。
在操作前应确认仪器的正常工作状态、流动相的供给情况、固定相的状态以及检测器的灵敏度和稳定性。
液相色谱法基本原理
液相色谱法基本原理
液相色谱法（Liquid Chromatography，简称LC）是一种用于分离、鉴定和定量混合物中各个组分的实验室技术。
其基本原理可以概括如下：
1.移动相和固定相：液相色谱法涉及两种相：移动相
（通常是液体）和固定相（固体或液体固定在固体
表面）。
移动相流过固定相。
2.样品注入：样品溶解在移动相中并被注入色谱系
统。
3.组分分离：样品中的不同组分在移动相和固定相之
间的互相作用差异导致它们以不同的速率移动。
这
种互相作用可能基于极性、分子大小、形状或其他
化学性质。
4.极性和非极性相互作用：在正相液相色谱中，固定
相是极性的，而移动相是非极性或中等极性的。
组
分根据其极性被分离。
反相液相色谱则相反，固定
相是非极性的，而移动相是极性的。
5.检测和定量：随着组分从柱子出来，它们通过一个
或多个检测器。
检测器可以基于不同的物理或化学
性质，如紫外-可见光谱、荧光或质谱。
6.洗脱曲线：每个组分产生洗脱曲线（或峰），其位置
（保留时间）和大小（面积或高度）可用于鉴定和
定量分析。
液相色谱法的关键在于选择合适的移动相和固定相组合，以实现最佳的分离效果。
它广泛应用于生物化学、环境分析、药物检测等领域。
液相色谱流动相基础知识-扫盲篇
液相色谱流动相基础知识-扫盲篇一、液相色谱流动相的性质要求一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。
选好填料（固定相）后，强溶剂使溶质在填料表面的吸附减少，相应的容量因子k降低；而较弱的溶剂使溶质在SPME填料表面吸附增加，相应的容量因子k升高。
因此，k值是流动相组成的函数。
塔板数N一般与流动相的粘度成反比。
所以选择流动相时应考虑以下几个方面：①流动相应不改变填料的任何性质。
低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料会计考试有时遇到某些有机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质。
碱性流动相不能用于硅胶柱系统。
酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。
②纯度。
色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。
③必须与检测器匹配。
使用UV检测器时，所用流动相在检测波长下应没有吸收，或吸收很小。
当使用示差折光检测器时，应选择折光系数与样品差别较大的溶剂作流动相溶剂瓶，以提高灵敏度。
④粘度要低（应<2cp）。
高粘度溶剂溶剂瓶会影响溶质的扩散、传质，降低柱效，还会使柱压降增加，使分离时间延长。
最好选择沸点在100℃以下的流动相。
二、液相色谱流动相的pH值采用反相色谱法分离弱酸（3≤pKa≤7）或弱碱（7≤pKa≤8）样品时，通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。
对于弱酸，流动相的pH值越小，组分的k值越大，当pH值远远小于弱酸会计考试的pKa值时，弱酸主要以分子形式存在；对弱碱，情况相反。
分析弱酸经济师样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液；分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和30mmol/L三乙胺溶液。
注：流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的相互网上培训作用，减轻或消除峰拖尾现象。
液相色谱基础知识---岛津
液相色谱基础知识
流动相的选择
采用 ¡ HPLC¡ 级溶剂 避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂 对试样有适宜的溶解度 溶剂粘度要小 与检测器相匹配
HPLC Business Dept Shimadzu Corporation
溶 剂 等 级
水的等级
纯化水 蒸馏水 去离子水
碳酸钙颗粒
HPLC Business Dept Shimadzu Corporation
液相色谱基础知识
二、定义 色谱法(Chromatography)：利用组分在两相 间分配系数不同而进行分离的技术 流动相：携带样品流过整个系统的流体 固定相：静止不动的一相
HPLC Business Dept Shimadzu Corporation
HPLC Business Dept Shimadzu Corporation
进样器
自动进样器 手动进样器
原理：（六通阀） 注入方式：
1）全量注入 2）部分注入
HPLC Business Dept Shimadzu Corporation
16
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甲醇
HPLC Business Dept Shimadzu Corporation
乙睛
正己烷
溶 剂 等 级
鬼峰的出现
e rv u C nt e i ad Gr
水 / 甲醇梯度
ODS 柱 总流速1 ml/min, 在10分钟 之内甲醇比例由0升到 100%，维持10分钟
HPLC Business Dept Shimadzu Corporation
高效液相色谱知识
⑤分析速度快、载液流速快：较经典液体色谱法速度 快得多，通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品 甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。
精选2021版课件
3
三、HPLC 的组成
• HPLC系统一般由高压输液泵、进样器、OL Apple系列 色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成 。
• 一、高压输液系统
1、泵的性能 ①流量稳定，其RSD应＜0.5%，这对定性定量的准确性至
关重要；②流量范围宽，分析型应在0.1~10 ml/min范 围内连续可调，制备型应能达到100 ml/min；③输出 压力高，一般应能达到150~300 kg/cm2；④液缸容积 小；⑤密封性能好，耐腐蚀。
2、梯度洗脱
精选2021版课件
②高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到 最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能 高出许多倍。
③高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在uL数 量级。
④应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高 效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、 热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。
• 梯度洗脱有两种实现方式：低压梯度（外梯度）和高 压梯度（内梯度）。
• 两种溶剂组成的梯度洗脱可按任意程度混合，即有多 种洗脱曲线：线性梯度、凹形梯度、凸形梯度和阶梯 形梯度。线性梯度最常用，尤其适合于在反相柱上进 行梯度洗脱。
• 在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不 断变化，因此带来一些精选特20殊21版问课件题，必须充分重视： 5
高效液相色谱知识
• 一、液相色谱的原理 • 二、HPLC的特点
• 三、HPLC 的组成 • 四、流动相 • 五、缓冲溶液的作用 • 六、梯度洗脱的流动相
液相色谱基础知识
梯度洗脱形式： 梯度洗脱形式：
线性梯度：在梯度洗脱时，流动相强度的变化和时间成线性比例 指数梯度：在梯度洗脱时，流动相强度随时间的变化呈指数关系 折线梯度：在梯度洗脱时，流动相强度随时间的变化呈跳跃关系
梯度洗脱形式的选择
液相色谱基础知识
梯度洗脱： 梯度洗脱：
优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和 提高分离精度，提高检测器的灵敏度
液相色谱基础知识
液相色谱基础知识
液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法 液相色谱：
适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的 适用于高沸点、大分子、 分析 流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用
气相色谱： 气相色谱：以气体作为流动相的色谱分离方法
适用于沸点较低、热稳定性好的中小分子化合物的分析 适用于沸点较低、 流动相只起运载样品分子的能力
注意事项： 注意事项：
溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差 梯度混合的溶剂互溶性要好 梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器 （如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动 相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）
样 品
1.
处
理
使用适宜的流动相溶解样品 在溶剂选择的时候，应注意以下原则： -- 减少溶剂峰，尤其是不可使用组分峰靠近溶剂峰 的流动相 -- 保证样品在流动相中的溶解度，避免样品在系统 中尤其在色谱柱中产生沉淀
溶 剂 等 级
分析纯级(实线）和 HPLC 级溶剂（虚线）的吸光度比较
甲醇
乙睛
正己烷
General Maintenance and Troubleshooting
溶 剂 等 级
缓冲液的使用
使用前必须过滤 以免造成腐蚀、 使用后一定要对柱子进行清洗 ，以免造成腐蚀、磨损及 阻塞:首先用纯水冲洗 首先用纯水冲洗30-60min（0.1-0.5ml/min），再用 ），再用 阻塞 首先用纯水冲洗 （ ）， 甲醇冲洗30min(0.1-0.5ml/min) 甲醇冲洗 易受到细菌和霉菌的影响
液相色谱概述与基本原理
采用更小粒径的填料，实现更高的分离度和分析速度。
反相高效液相色谱（RP-HPLC）
发展反相色谱柱和洗脱液体系，增强对极性化合物的分离效果。
亲水作用色谱（HILIC）
利用亲水作用力进行分离，适用于极性化合物的分离和分析。
提高分离效率和灵敏度
新型检测器
开发和应用新型检测器，如质谱检测 器、荧光检测器等，提高检测灵敏度 和选择性。
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按固定相的极性分
类
可分为正相色谱和反相色谱。正 相色谱采用极性固定相，适用于 极性物质的分离；反相色谱采用 非极性固定相，适用于非极性物 质的分离。
03
液相色谱的应用
在化学分析中的应用
分离和纯化有机化合物
液相色谱可用于分离和纯化有机化合物，如芳香烃、醇、醛、酮等， 常用于有机合成和天然产物的分离。
02
有毒有害物质分析
03
生态毒理学研究
液相色谱可用于检测工业废水、 废气中的有毒有害物质，为环境 保护提供科学依据。
液相色谱可用于研究环境污染物 对生物体的毒性作用，为生态毒 理学研究提供技术支持。
04
液相色谱的发展趋势和挑战
技术创新和改进
高效液相色谱（HPLC）
通过改进色谱柱填料和固定相，提高分离效率和选择性。
微柱和纳升液相色谱
采用微柱和纳升液相色谱技术，降低 样品消耗量和流动相体积，提高分离 效率和灵敏度。
解决实际应用中的问题
复杂样品处理
发展样品前处理技术，如固相萃取、在 线萃取等，简化样品处理过程，提高分 析效率。
VS
多维液相色谱
采用多维液相色谱技术，实现更复杂的样 品分离和分析，提高分离效果和峰容量。
液相色谱基础知识
紫外可见检测器
紫外可见检测器
原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收 定量基础：Lambert-Beer定律，A＝KCL 优点：1）对温度和流速变化不敏感
2）可用于梯度分析 缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质
紫外可见检测器
光栅
l
样品池
Ein
Eout
光电管
D2 / W 灯
Ein
Ein
参比池
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流动相注意点
离子对试剂的使用 具有缓冲盐流动相的使用 分析结束及开
始 流动相平衡 加快平衡时间 异丙醇的使用
LC检测器
紫外可见检测器（UV/VIS） 二极管阵列检测器（PDA） 示差检测器（RID） 电导检测器（CDD） 荧光检测器（RF） 电化学检测器（L-ECD） 质谱检测器（MS） 蒸发光散射检测器（ELSD）
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流路中形成气泡引起的问题
改变保留时间和峰面积
流动相中形成气泡对液流的不良影响 泵中形成气泡使液流波动
峰变形
柱中气泡形成和累积使流动相绕流
尖峰或锯齿状噪声
检测池中气泡形成和累积产生基线噪声
输液泵
输液泵类型： 注射泵 柱塞往复泵 隔膜泵
输液泵控制方式：
恒流控制 恒压控制
柱塞往复泵
马达和凸轮
液相色谱基础知识
一、色谱起源
石油醚
色素
碳酸钙颗粒
色谱
组分
HPLC的分离类型
正相色谱 (NP-HPLC) 反相色谱 (RP-HPLC) 反相离子对色谱 (RPIC) 离子交换色谱 (IEC) 空间排阻色谱 (SEC) 手性化合物分离模式(Chiral separation
mode)
液相色谱工作原理
液相色谱工作原理液相色谱（Liquid Chromatography, 简称LC）是一种分离和分析化合物的重要技术，广泛应用于化学、生物、药物和环境等领域。
其原理是利用化合物在流动相和固定相之间的分配行为，通过不同化合物在两相间的分配系数差异，实现化合物的分离和分析。
本文将从液相色谱的工作原理、基本构成和操作流程进行详细介绍。
1. 工作原理。
液相色谱的工作原理基于化合物在流动相和固定相之间的分配行为。
当样品溶液通过色谱柱时，化合物会在流动相和固定相之间不断分配，即在两相之间发生平衡。
根据化合物在两相之间的分配系数不同，它们将以不同的速率通过色谱柱，从而实现分离。
流动相的选择对于分离效果至关重要，常用的流动相包括水、甲醇、乙腈等。
而固定相则是填充在色谱柱中的吸附剂，常见的固定相包括疏水相、离子交换相、亲和相等。
通过调整流动相的组成和色谱柱的性质，可以实现对不同化合物的有效分离。
2. 基本构成。
液相色谱主要由流动相输送系统、进样器、色谱柱、检测器和数据处理系统组成。
流动相输送系统用于将流动相输送至色谱柱，通常包括泵和管道等。
进样器用于将样品引入色谱系统，常见的进样方式包括注射器和自动进样器。
色谱柱是液相色谱系统中最重要的部分，不同的色谱柱具有不同的分离机理和分离能力。
检测器用于监测色谱柱输出的化合物，常见的检测器包括紫外-可见光谱检测器、荧光检测器、质谱检测器等。
数据处理系统用于记录和处理检测器输出的信号，常见的数据处理系统包括计算机和数据采集系统。
3. 操作流程。
液相色谱的操作流程通常包括样品制备、流动相准备、色谱柱平衡、进样和分离、检测和数据处理等步骤。
首先，需要对待测样品进行适当的制备，包括溶解、过滤等操作。
接下来是流动相的准备，根据样品的性质和分离要求选择合适的流动相，并进行气泡排除和流速调节等操作。
然后进行色谱柱的平衡，以保证色谱柱内部的平衡状态。
接着是样品的进样和分离，将制备好的样品通过进样器引入色谱系统，经过色谱柱分离后，化合物被检测器检测并输出信号。
液相色谱仪工作原理液相色谱概述
液相色谱仪工作原理液相色谱概述012009-09-02 18:44:46| 分类：分析仪器 | 标签：色谱优化 e名京人液色迷人液相色谱专家|字号大中小订阅岛津shimadzu的液相色谱概述01液色迷人的液相色谱概述01液相色谱仪工作原理一、液相色谱仪－高压输液系统输液系统由贮液罐、过滤器、梯度洗脱装置、高压输液泵、脱气装置等组成。
高压泵是高效液相色谱仪最重要的部件之一。
由于高效液相色谱仪所用色谱柱直径细，固定相粒度小，流动相阻力大，因此，必须借助于高压泵使流动相以较快的速度流过色谱这。
高压泵需要满足以下条件：能提供150－450kg/cm2的压强；流速稳定，流量可以调节；耐腐蚀。
目前所用的高压泵有机械泵和气动放大泵两种。
梯度淋洗装置可以将两种或两种以上的不同极性溶剂，按一定程序连续改变组成，以达到提高分离效果，缩短分离时间的目的。
梯度淋洗的作用与气相色谱中的程序升温装置类似。
（一）贮液罐贮液罐为不锈钢、玻璃或氟塑料制成的容器，容量为1到2 L，用来贮存足够数量、符合要求的流动相。
贮液罐可以是一个普通的溶剂瓶，也可以是一个专门设计的储液器。
储液器往往和泵通过管路构成循环系统以便除去溶剂中的气体。
现多数使用溶剂瓶，一般采用耐腐蚀的玻璃瓶或聚四氟乙烯瓶。
贮液罐的放置位置要高于泵体，以保持输液静压差，使用过程应密闭，以防止因蒸发引起流动相组成改变，还可防止气体进入。
（二）高压输液泵气相色谱由高压钢瓶直接提供动力，高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部件之一，是流动相的动力源。
高压输液泵功能是将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。
液相色谱为了获得高柱效，所用色谱柱径较细，所填固定相粒度很小，因此，对流动相的阻力较大，为了使流动相能较快地流过色谱柱，就需要高压输液泵。
1.对高压输液泵的要求（1）能在高压下连续工作，一般要求耐压40～50MPa·cm2，能在8～24 h连续工作。
1.液相色谱特点及主要类型、原理
3 .固定相及分离柱 气相色谱中的固定液原则上都可以用于 液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。 在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项 技术要求非常高的工作 .
4.柱外效应(extra column effect) 是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽。 可分为柱前和柱后两种。 柱前展宽：主要由进样引起 柱后展宽：是由接管和检测器流通池体 积以及检测器响应时间等因素所引起。
柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm 且不均匀
常压输送流动相 ；柱效低（H↑，n↓）
分析周期长、无法在线检测
2．HPLC：分离和分析 柱内径2~6mm，固定相粒径<10μm（球 形，匀浆装柱） 柱效高（H↓，n↑） 高压泵输送流动相； 分析时间大大缩短、可以在线检测
四、HPLC与GC差别
主要差别：分析对象、流动相及操作条件的 差别 1．分析对象
2、液-固吸附色谱
基本原理： 各组分在吸附剂上的吸附性 能的差别 固定相： 固体吸附剂 应用：对中等分子量的油溶性试样，对 具有官能团的化合物和异构体有较高选择 性；
3、离子交换色谱
基本原理：各离子组分在固定相上发生的反 复离子交换反应能力的差别； 固定相：阴（阳）离子交换剂 流动相：pH缓冲溶液（酸性、碱性） 应用：离子及可离解的化合物、氨基酸、核 酸、蛋白质等。
7、亲和色谱(AC) Affinity chromatograph
原理：利用生物大分子和固定相表
面配基存在的某种特异性亲和力，
进行选择性分离 。 这种固载化的配基将只能和具有亲 和力特性吸附的生物大分子作用而 被保留。改变淋洗液后洗脱
小结：分离类型选择
液相色谱分离类型参考表 相对分子量 排阻色谱 >2000 样品 溶于水 水为流动相
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流动相极性变化对分离的影响
20 % 水
30 % 水
40% 水
1 : 对羟基苯甲酸甲酯 2 : 对羟基苯甲酸乙酯 3 : 对羟基苯甲酸丙酯 4 : 对羟基苯甲酸丁酯
GPC系统开发 LC-1（LC-830）销售 LC-3A系列销售 LC-4A系列销售 LC-5A系列销售 LC-6A系列销售 LC-10A系列销售 LC-VP系列销售 LC-2010销售 LC-20A Prominence销售 LC-15C销售 LC-30A Nexera销售
＜与DuPont签订许可合同后制造销售＞ ＜CDQR方式的单柱塞型送液单元为特征＞ ＜内置微型计算机的全自动HPLC＞ ＜世界上首创的微量型LC对应HPLC＞ ＜世界上最早的积木型HPLC、现在的HPLC的前身＞ ＜世界上最早采用微冲程送液单元和减低噪音技术的检测器＞ ＜采用有效性支持功能的积木型HPLC＞ ＜追求性能和操作性更加完善的一体型HPLC＞ ＜为分析实验室带来革新的HPLC ＞ ＜为了让LC分析更为便捷> ＜130MPa耐压系统，低系统容量，高温分析和样品自动前处理＞
正相色谱
——流动相的极性小于固定相的极性
硅 胶 柱 : 常用 氰 基 柱 : 常用 氨 基 柱 : 分析糖 二醇基柱 : 分析蛋白质
SiO2 硅胶
SiO2
-Si-CH2CH2CH2CN -Si-CH2CH2CH2NH2 -Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)
化学键合相
岛津液相色谱操作培训
岛津国际贸易（上海）有限公司 分析仪器事业部 分析中心
1
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400-650-0439
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相互作用力是什么?
非常弱
强 HO
SiOH SiOH
弱 OH
氢键力
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氢键力
如果样品有
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相互作用力是什么?
疏水性
OH
C18 (ODS)
弱
SiO2
强
OH
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疏水性
如果样品有
Essentia
2010
THECNLOGY BREAKTHROUGH
UHPLC LC-30A
Nexera
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LC-20A Prominence
5
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在售产品
3
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岛津HPLC的历史
1997
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Flexible HPLC System with Micro-stroke Volume Solvent Delivery Unit
色谱起源
石油醚
色素混合物 碳酸钙颗粒
色谱 分离组分
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色谱发展史
20世纪初，俄国植物学家M.S. Tswett提出经典液相色谱法； 20-30年代，柱分配色谱和纸色谱； 50年代，气相色谱，薄层色谱； 60年代，凝胶渗透色谱及高效液相色谱； 70年代，高效毛细管气相色谱法； 80年代，电色谱； 90年代，光色谱。
有机相: 甲醇
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固定相极性变化对分离的影响
SiO2
C18 (ODS)
强 样品
SiO2
C8
一般 样品
SiO2
C4
弱 样品
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– CH3CH2CH2--- : 碳链
–
: 芳香基
作用力强
如果样品有
– COOH – NH2 – OH
: 羧基 : 氨基 : 羟基
作用力弱
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反相色谱流动相的选择
优化水相（缓冲液）和有机相的比例非常重要 甲醇，乙腈和 THF 是常用的有机溶剂。
基础知识讲解内容
1、色谱基础知识 2、硬件基础知识 3、定量基础知识 4、维护基础知识
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第一部分 色谱基础知识
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LC-VP
2000
THECNLOGY BREAKTHROUGH
LC-2010
2004
THECNLOGY BREAKTHROUGH
LC-20A Prominence
2008
THECNLOGY BREAKTHROUGH
UFLC Prominence
2010
THECNLOGY BREAKTHROUGH
LC-15C
HPLC特点
分离性能好 灵敏度高（10-9～10-12 g） 选择性高（同分异构，旋光异构） 分析速度快 进样量小（1-100 μL）
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HPLC分类
反相色谱（reversed phase chromatography） 离子对色谱（ion-pair chromatography） 正相色谱（normal phase chromatography） 离子交换色谱（ion exchange chromatography） 尺寸排阻色谱（GPC / GFC）
色谱分类
高效液相色谱
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
气相色谱
Gas Chromatography (GC)
薄层色谱
Thin-Layer Chromatography (TLC)
毛细管电泳
Capillary Electrophoresis (CE)
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反相离子对色谱应用
有机酸、碱、盐的分离
包括：
— 阴阳离子表面活性剂 — 大分子脂肪酸 — 烷基磺酸盐和芳香硫酸盐 — 含氮化合物 — 生物碱 — 水溶性维生素 — 酚类
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流动相：水（缓冲液） + 离子对试剂 + 有机溶剂 离子对试剂：所带电荷与待测离子相反
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常用离子对试剂
阴离子化合物
– 氢氧化四丁基铵 – 溴化四丁基铵
阳离子化合物
– 丁烷基磺酸钠 （C4） – 戊烷基磺酸钠 （C5） – 己烷基磺酸钠 （C6） – 庚烷基磺酸钠 （C7） – 辛烷基磺酸钠 （C8） – 癸烷基磺酸钠 （C10） – 十二烷基磺酸钠 （SDS）
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反相色谱
——流动相的极性大于固定相的极性
C18 (ODS) C8 (octyl) C4 (butyl) 苯基
TMS
氰基
非极性
-O-Si(CH3)2-C18H37
SiO2
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反相离子对色谱流动相的选择
离子对试剂的类型 所带电荷与待测物质相反
离子对试剂的浓度 10-4~10-2 mol/L 在一定范围内，浓度越大，被分离物的保 留值越大
流动相的 pH
3. n-苯甲酸丙酯
4. n-苯甲酸丁酯
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反相离子对色谱