抗体药物偶联物的制备研究PPT课件.
抗体药物偶联制备
抗体药物偶联制备
抗体药物偶联制备是一种将抗体与药物分子结合在一起，以提高药物的靶向性和有效性的技术。
以下是一般的抗体药物偶联制备步骤：
1. 选择合适的抗体和药物：根据疾病目标和药物特性，选择合适的抗体和药物分子。
2. 修饰抗体：利用化学方法将抗体表面引入偶联官能团。
常用的修饰方法包括活性酯化、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯化、巯基化等。
3. 链接药物：将修饰后的抗体与药物分子进行偶联。
常用的偶联方法包括亲核取代反应、酰胺形成反应、酯化反应等。
4. 纯化和检测：对偶联后的抗体药物进行纯化，以去除未反应的杂质。
常用的纯化方法包括凝胶过滤层析、负离子交换层析等。
同时，对偶联后的抗体药物进行质量检测，确保偶联效率和药物的活性。
5. 评估抗体药物的效价和稳定性：通过体外和体内实验，评估抗体药物的靶向性、抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和药物释
放性能等。
需要注意的是，抗体药物偶联制备是一个复杂的过程，需要充分考虑抗体和药物的特性、偶联方法的选择、纯化和检测等因
素。
同时，制备过程中需要注意控制修饰和偶联的条件，以确保药物的活性和抗体的稳定性。
《抗体制备过程》课件
免疫动物的筛选
选择合适的动物种类： 如小鼠、大鼠、兔子
等
确定动物的健康状况： 确保动物健康，无疾
病
确定动物的年龄：选 择合适的年龄，如成
年动物
确定动物的性别：选 择合适的性别，如雌
性动物
确定动物的免疫状态： 选择免疫状态良好的
动物
确定动物的遗传背景： 选择遗传背景合适的
动物
确定动物的饲养条件： 确保动物饲养条件良
免疫佐剂的选择原则：根据抗 原性质、免疫途径、实验目的 等因素选择
免疫佐剂的优化方法：通过实 验筛选最佳浓度、组合方式等
抗体纯化技术的优化
亲和层析法： 利用抗体与抗 原的特异性结 合，实现抗体
的纯化
离子交换层析 凝胶过滤层析
法：利用抗体 法：利用抗体
与离子交换树 分子大小不同，
脂的相互作用， 实现抗体的纯
抗体应用
医学领域：用于诊 断和治疗疾病
生物技术领域：用 于基因工程和生物 制药
食品工业：用于食 品检测和食品安全
环境监测：用于环 境污染物检测和监 测
抗体制备过程
免疫原的制备
免疫原选择：选择合适的抗原或半抗原 免疫原纯化：通过纯化技术去除杂质 免疫原处理：对免疫原进行化学修饰或物理处理 免疫原保存：在适当的条件下保存免疫原，防止降解或变质
免疫原的纯化： 去除杂质，提 高抗原的纯度
免疫原的浓度： 选择合适的抗 原浓度，以提 高抗体的产量
和质量
免疫原的保存： 选择合适的保 存方法，如低 温保存、干燥 保存等，以保 持抗原的活性
和稳定性
免疫佐剂的选用与优化
免疫佐剂的作用：增强免疫反 应，提高抗体产量
免疫佐剂的种类：铝盐、脂质 体、核酸等
《抗体的制备与应用》PPT课件说课讲解
Day
0
Resting B cell
2
4
Antibody
6
forming cell
(plasma cell)
8
Antibody Structure and Function
Structure of immunoglobulins
Basic structure
Heavy chain and Light chain（重链和轻链） Variable region and Constant region（可变区和恒定区） Other structures
❖ 基因工程抗体的分类
1、全抗体
❖（1）嵌和抗体（chimeric antibody） ❖（2）人源化抗体（humanized antibody）
2、小分子抗体
❖（1）Fab ❖（2）ScFv ❖（3）单域抗体 ❖（4）分子识别单位
3、其它抗体
❖ 多价微型抗体
双链抗体（diabody） 微型抗体(minibody) 三链抗体(triabody)
株难、不稳定、产量低、人体不能随意免疫 3、现代免疫学和分子生物学技术的推动 4、基因工程抗体的优点
❖ 基因工程抗体的优点：
易于获得稀有抗体; 人抗鼠抗体反应（Human anti－
mouse antibody reaciton, HAMAR） 低; 小分子抗体：渗透力强、HAMAR低、 亲和性高、靶向性高、组织非特结合少 等。
4. （三）用于疾病的治疗
5. 抗细胞表面分子单抗，用于移植排斥反应的防治 6. 抗细胞因子单抗用于自身免疫性疾病的治疗 7. 抗肿瘤单抗用于肿瘤的导向治疗
单克隆抗体用于免疫治疗存在的问题
1. 单克隆抗体的特异性
详细介绍抗体的生产制备 PPT
• 增加抗原的表面积，并改变抗原的活性基团构型，从而增强抗原的免疫原性； • 佐剂与抗原混合能延长抗原在局部组织的存留时间，降低抗原的分解速度，使
抗原缓慢释放至淋巴系统中，持续刺激机体产生高滴度的抗体； • 佐剂可以直接或间接激活免疫活性细胞并细胞破碎：提取细胞可溶性抗原，需将细胞破碎，常用方法有冷热交替 法、超声破碎法，反复冻融法、自溶法和酶处理法等。
（3）蛋白提纯
① 超速离心法：常用密度梯度介质有蔗糖、甘油；
② 选择性沉淀法（盐析沉淀法）：其原理是根据蛋白质理化特 性的差异，采用各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原 成分沉淀，从而达到纯化的目的。如选用33～50％饱和度的 硫酸胺收集沉淀物；
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交流
1）细胞性抗原或颗粒性抗原
细胞性抗原：主要包括人、动物的细胞，还有细菌、螺旋体及寄生虫等。 如菌体（O）抗原的制备：选择标准菌株，接种于斜面或平板培养基表面；置 温箱37℃ 培养24h，用适量的无菌生理盐水刮下菌苔，移入无菌含有玻璃珠的 三角瓶中，充分摇匀菌体；100 ℃ 水浴2～2.5h杀菌并破坏鞭毛抗原。取处理 过的菌液，检测有无活菌的存在，合格后用无菌生理盐水稀释成每毫升8亿～ 10亿个细菌，加入苯酚（石炭酸）至最终浓度为5％，即为O抗原。
▪ 单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）:由一个识别一种抗原表位的B细 胞克隆产生的同源抗体。高度均一、特异性强、效价高、少或无交叉反应 性。
多克隆抗体（抗血清）的制备流程
抗原
半抗原+载体
佐剂 免疫动物（3-5次）
测效价 动物采血，分离血清
抗血清纯化、鉴定、保存
抗体药物偶联物
抗体偶联药物(antibody-drug conjugates， ADC) 因其良好的靶向性及抗癌活性目前已成为抗肿瘤抗体药物研发的新热点和重要趋势，受到越来越多的关注 。
ADC 药物由单克隆抗体 、 高效应的细胞毒性物质以及连接臂三部分组成， 它将抗体的靶向性与细胞毒性药物的抗肿瘤作用相结合， 可以降低细胞毒性抗肿瘤药物的不良反应 ， 提高肿瘤治疗的选择性， 还能更好地应对靶向单抗的耐药性问题.
有以下几个问题，需要思考：1） 靶标与抗体的选择 2）接头与偶联技术 3）负载药物 4）ADC药物的质量属性分析
重点说一下偶联技术：
非特定位点：通常药物与抗体的偶联是通过抗体上赖氨酸残基或链间二硫键还原产生的半胱氨酸残基实现的 。
这两种方式所获得的抗体药物偶联物中单个抗体上偶联的药物个数为 0个到 8 个不等， 具有较大的异质性，这对抗体偶联药物的批间一致性提出 了巨大的挑战 。
位点特异性偶联的方法还包括使用非天然氨基酸、 硒代半胱氨酸和酶解偶联法。
简单介绍一下一个在研的ADC项目：
构成：Herceptin+linker+MMAF/MMAE，通过在Herceptin碳端（重链或轻链）引入额外序列CAAX，进而采用特定的酶反应使linker+drug部分能偶联在特定位点。
采用在血浆中稳定的而在靶向部位易裂解的linker，保证了ADC药物的安全性以及有效性。
临床前数据表明，此药物与Herceptin具有相同的体外结合亲和力以及相同的PK特性；在HER2
阳性细胞株上，展现出良好的体外细胞毒性；在体内异种乳腺癌细胞株BT-474以及胃癌细胞株NCI-N87试验中，表现出强的抑制肿瘤效果。
{对ADC项目或此项目有兴趣的，可以交流一下}。
抗体制备过程PPT课件
背部皮下，每处注射0.2 ml, 共2～4点。待肿瘤到达一定大小后(一般10～20天
)那么可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可到达1-10mg／ml。但采血量有
限。
+
② 腹水的制备 常规是先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷)或液体石腊于
BaLb／c鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可
+ 1. 有限稀释法的程序
+
① 制备饲养细胞悬液(同融合前准备)
+
② 阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1～5×10３／ml
+
③ 取130个细胞放入含饲养细胞完全培养液，即20个细胞／ml，100μl
／孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下细胞悬液补加含饲养细胞的完全培
养液,细胞数为10个／ml，100μl／孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。余下
备的，与其它抗原无交叉反响性。与其它常规免疫 血清相比，单抗的特异性高、效价高、质地均一， 便于精制浓缩，应用单抗可以提高检测方法的敏感 性和特异性。同时，他又可作为提纯抗原、制备疫 苗、生产生物制剂和用于根底研究的重要手段。
+ 3 .生产简单，易于标准化 + 一旦选育成功一株高效价的杂交瘤细胞株，经鉴定
料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm,8分钟。
+
(4) 弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。
+
(5) 轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。
+
(6) 在室温下融合可先以预热40℃:
+
① 30秒内参加预热的1ml45％PEG(Merek,分子量4000)含5％DMSO，边加
抗体偶联药物 ppt课件
抗体偶联药物
定义 原理 对Ag、Ab、连接子和药物分子的要求 抗体的突变 几种ADC定点偶联方法的比较 连接方式 ADC偶联比的测定方法 上市的药品 前景 挑战
精品资料
抗体偶联药物
抗体偶联药物
三、对抗体、药物、连接子、靶标和抗原的要求
抗体偶联药 物
溶 药物
解 度
分子
抗体偶联药物
⑤ADCs药物特殊 靶点的寻找
抗体偶联药物
①抗原大量特异性的表 达在靶细胞表面在正常 组织或细胞表面不表达 或少表达
③一定的内吞 速率
②抗原应尽量不分泌，因为 分泌型抗原可与血液循环中 抗体结合，从而导致与肿瘤 细胞结合的抗体减少
要求
④有合适的内吞转运
途径
抗体偶联药物
靶向功能，能够有效地将 细胞毒分子输送到靶细胞；
具有较低的免疫原性。 具有合适的连接位点，偶
抗体偶联药物
ADCs产业化制备工艺复杂，包括重组抗体制备、化学药 物与抗体的偶联反应、ADCs的制剂与质控等环节，任一环 节出现问题，都会影响其安全性和有效性。
抗体与药物 Βιβλιοθήκη 偶联比不确 定，影响药物 的疗效挑战
ADCs中连接臂、抗 体和药物三者的连接 效率和稳定性
④开发不同作用机 制的新型细胞毒素
抗体偶联药物
溶 药物
解 度
分子
药物的分子量较小，从而减少发生免疫原性的 风险；抗体的分子量也要很小，IgG抗体的分 子量约为150kD，毛细管内皮层和细胞外间隙 难以透过如此巨大的抗体或偶联分子，抗体的 分子量太小，会影响其在体内的半衰期。
抗体偶联药物
• 应在水性缓冲溶液中具有适 当的溶解度，以便于偶联抗 体
抗体偶联药物 - Description of the sub contents 1.在血浆中稳定，避免细胞毒素提前释
抗体药物偶联物的构建——连接位点与连接基团的选择
抗体药物偶联物的构建——连接位点与连接基团的选择1.抗体药物偶联物概念抗体药物偶联物(antibody-drug conjugate，ADC)是通过⼀个化学链接将具有⽣物活性的⼩分⼦药物连接到单抗上，单抗作为载体将⼩分⼦药物靶向运输到⽬标细胞中，⽬前应⽤最⼴的是针对肿瘤细胞的递送。
利⽤⼩分⼦药物的细胞毒性杀死肿瘤细胞是许多化疗药物的机制，然⽽为了追求更好的治疗效果，⼩分⼦药物的细胞毒性往往很强。
由于选择性不⾜，导致对于正常细胞也存在着杀伤，进⽽导致对机体的伤害。
最⼤耐受量和最⼩有效剂量之间的剂量范围即为治疗窗，药物选择性的不⾜导致治疗窗变得狭窄，这给临床⽤药带来了不便。
提⾼药物的选择性，是拓展治疗窗的⼀个⼿段。
抗体是⼀类具有特殊亲和⼒的蛋⽩，利⽤其对靶细胞特异性的结合，有望作为药物靶向递送的载体，进⽽提⾼药物的选择性。
图1 药物治疗窗⽰意图2.⾸个抗体药物偶联物药物辉瑞旗下的Mylotarg（gemtuzumab ozogamicin）是⾸款得到美国FDA批准，⽤于治疗表达CD33抗原的新诊断急性⾻髓性⽩⾎病（AML）成⼈患者的抗体药物偶联物。
Mylotarg含有可以靶向CD33的单克隆抗体和与之连接的细胞毒素卡其霉素（calicheamicin）。
CD33是⼀种在成髓细胞表⾯表达的抗原，在多达90%的AML患者中都存在。
Mylotarg通过与CD33抗原结合实现对肿瘤细胞的靶向效应。
该类药物的成功上市证明了抗体药物偶联物作为药物的可能性与⼴泛应⽤前景。
图2 Mylotarg结构式（来源：）3.抗体与药物连接位点的选择对抗体进⾏药物偶联时，往往使⽤带有特殊侧链的氨基酸作为反应位点。
其中以半胱氨酸和赖氨酸为最多。
半胱氨酸在抗体中以⼆硫键的形式存在，因此需要对其进⾏还原为⾃由巯基进⾏下⼀步反应。
其中在抗体（IgG）链间有4对⼆硫键，⽐较容易被还原。
⽽在抗体链内，有12对⼆硫键，较难被还原。
赖氨酸则⼴泛分布于抗体结构域，⼤约有86个赖氨酸残基，其中有⼤约20个赖氨酸残基可作为连接位点。
抗体药物偶联物结构
抗体药物偶联物（Antibody-drug conjugates，ADCs）是一种将抗体与药物通过化学连接结合在一起的分子复合物，用于靶向癌细胞等病变细胞。
这种结构通常包括三个主要组件：抗体、链接器和药物负载。
抗体：ADCs的核心是单克隆抗体，通常是针对癌细胞表面特异性抗原的抗体。
这个抗体负责与癌细胞表面的特定抗原结合，以实现靶向性。
链接器（Linker）：链接器是将抗体与药物连接起来的化学结构。
链接器有两种主要类型：可裂解的链接器和不可裂解的链接器。
可裂解的链接器（Cleavable Linker）：这种链接器在抗体与药物到达目标细胞后能够被细胞内部的特定酶或条件性因素降解。
这导致释放药物负载到目标细胞内，实现局部释放。
这种设计有助于减少非特异性的药物释放。
不可裂解的链接器（Non-cleavable Linker）：这种链接器在抗体与药物到达目标细胞后不发生降解。
药物通过内吞作用释放到细胞内。
这种设计可能更适合一些情况。
药物负载：药物负载是通过链接器与抗体连接的药物分子。
这些药物通常是细胞毒性的，可以杀死或阻止癌细胞的生长。
整个结构可以简化为以下模式：
抗体
−
链接器
−
药物负载
抗体−链接器−药物负载
抗体药物偶联物的设计旨在提高药物的靶向性，减少对正常细胞的损伤，从而改善治疗效果和减少副作用。
不同的ADCs可能采用不同的抗体、链接器和药物组合，以满足特定治疗需求。
这是一个不断发展的领域，有许多公司和研究机构致力于开发新的ADCs以及改进已有的技术。
抗体药物偶联物 (ADC) 概述
抗体药物偶联物 (ADC) 概述
抗体-药物偶联物 (ADC)由所需的单克隆抗体、活性药物和适当的接头组成。
抗体和药物之间适当的连接体维持ADC的稳定性并提供特定的桥梁，从而帮助抗体选择性地将药物递送至肿瘤细胞并在肿瘤部位准确地释放药物。
ADC PEG 连接体的选择是靶标依赖性的，基于对所使用的活性药物（包括细胞毒素）、抗体-靶标抗原复合物的内化和降解以及缀合物的临床前体外和体内活性比较的了解。
单分散聚乙二醇 PEG是靶向治疗中应用广泛的一种连接子。
PEG连接体具有高利用率、靶向性、调节PH值等特点。
PEG连接体具有多种官能团选择，可以与不同的抗体和药物缀合，形成不同的连接体，如pH敏感连接体、二硫键连接体、β-葡萄糖醛酸连接基...
单分散胺-PEG-羧基作为小分子连接基，含有亲水基团，可以溶解在大多数溶剂中，因此胺基也广泛用于ADC设计中。
此外，与匹配的抗体或药物连接的胺基可以作为pH敏感的连接体。
抗体制药最新PPT课件
第三节 杂交瘤细胞系的建立
一、免疫B淋巴细胞的制备
1. 抗原 凡是能具有抗原性质的物质均可制备单 克隆抗体，抗原可以是全病毒、亚单位 或纯化分子，也可以是蛋白质、多糖、 脂类等
用于制备单克隆抗体的抗原在理论上讲， 纯度要求就可以不高，也可以使混合抗 原
2. 免疫
动物的选择 目 前 常 用 的 骨 髓 瘤 细 胞 系 来 自 BALB/c 小 鼠和Lou大鼠 免疫方法 A. 体内免疫法 B. 脾内免疫法 C. 体外免疫法
所有抗体混合
31 2 4
BA LB /c
1234
脾脏 淋巴結 B 細胞
31 2 4
二、杂交瘤及杂交瘤技术
细胞杂交的含义包括同一细胞的自融合 或是在诱导物的作用下不同细胞间的融 合 淋巴细胞通过融合剂的作用和肿瘤细胞 形成融合的杂交细胞称杂交瘤细胞 通过肿瘤细胞和淋巴细胞的融合，用于 某些细胞特性的研究和生产所期望的免 疫分子，称为杂交瘤技术
二、 骨髓瘤细胞的选择
在B淋巴细胞杂交瘤技术中，主要是用多 发性骨髓瘤细胞作为亲本细胞，这种细 胞是来自骨髓造血细胞的一种肿瘤，分 泌单一抗体的浆细胞，并且衰变成不表 达自身抗体或部分表达 常见的骨髓瘤亲本细胞系有Sp2/0，NS-1， Y3，YB2
三、 免疫脾细胞的制备
经免疫的BABL/c小鼠或Lou大鼠，摘眼 球、断颈等方法处死后，无菌摘取脾脏， 研磨制取B淋巴细胞悬液，经氯化铵破碎 红细胞后，洗涤并调整到（1～5）X107 个／ml浓度备用
六、杂交瘤细胞的克隆和建株
1. 杂交瘤细胞的克隆化
2. 杂交瘤细胞系建株
七、单克隆抗体的制备
1. 动物体内诱生法
2. 体外培养法
八、单克隆抗体生产的一般流程
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◆考察样品中加入不同硫酸铵含量对分析结果的影 响。加入不同比例2 M硫酸铵缓冲液(2.0 mM Na2HPO4-NaH2PO4磷酸缓冲液中加入2M硫酸铵调 pH 7.0)和PB(20 mM pH 7.0 Na2HPO4-NaH2PO4磷 酸缓冲液），最终浓度硫酸铵分别为0.5、0.8、 1.0、1.3、1.5M。 ◆考察流速为0.2、0.4、0.6、0.8、1mL/min时，系 统压力的变化，分析柱对抗体与药物偶联后生成 产物的情况，室温检测，检测波长为280nm，进样 体积为50pL，浓度1mg/mL，总蛋白进样量为50昭 。
2.3实验药品和仪器
实验药品及其规格
2.4.1、蛋白浓度测定
蛋白浓度采用BCA方法测定。具体步骤为：分别在96 孔板的每个孔中加入20pL 不同浓度（0.2mg/mL、 0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL 和 1.0mg/mL)的蛋 白标准品(BSA标准溶液2mg/mL)和待测样品和空白对 照，然后加入200pL工作液（A液:B液=50:1)，将96孔 板放置于37C的恒温培养箱中反应0.5h。将酶标仪的 检测波长设为562nm，在该波长下检测每个孔中蛋白 质的吸光值。然后根据标准蛋白的浓度和测出的吸光 值，绘制蛋白质浓度标准曲线。从标准曲线计算得到 检测样品的浓度。
河北科技大学本科论文答辩
抗体药物偶联物的制备研究
班级： 学生： 学号： LOGO
目录
实 验 分 以 下 几 项 进 行 介 绍
1.引言
2.实验部部分
3.实验结果与讨论
4.实验结论
1.1课题背景
本课题是对抗体药物偶联物的制备进行研宄，主要 内容如下： 从众多检测蛋白的方法中挑选出适用于检测抗体还 原后产物的最优方法。采用常用的还原剂对抗体进 行还原，检测抗体不同时间下还原程度，得出最优 还原反应时间以及还原过程的动态变化。 对反应温度，反应pH，还原剂与抗体的还原比例进 行响应面试验设计，优化反应条件，从常用的九种 还原剂中筛选出高效的还原剂，用来连接带有马来 酰亚胺接头的药物，进行抗体药物偶联物制备实验 。
2.4.4、反相色谱分析
层析前样品处理：采用BCA法检测抗体与药物偶联后 产物的浓度，将产物用PBS 稀释到 2mg/mL。100^L 2mg/mL IgG 在 PBS 溶液中与 100pL 50mM DTT 在37C ，反应20min，0.22^m的超滤膜过滤，除去样品中杂质 。上样20^L，280nm检测。 采用反相色谱柱 PLRP-S 1000A，8mm，150mmx4.6mm， P/N PL1512-3802 检测，方法：Buffer A: H2O + 0.1% TFA，Buffer B: CH3CN + 0.1% TFA，梯度： 30-45%B 30min，95%B 3 min，30%B 5min。
2.4.2、聚丙烯酰胺凝胶电泳
◆SDS-PAGE是依据通过SDS使蛋白质分子带上大量负
电荷中和蛋白质分子本身电荷，消除蛋白质分子本 身的电荷效应。依据蛋白质的分子大小呈现不同条 带。通过凝胶成像系统所得图片蛋白带的宽度以及 颜色的深浅，采用光密度分析可以判断出蛋白带大 约的蛋白量。 ◆采用非还原的SDS-PAGE电泳，浓缩胶为8%的聚丙烯 酰胺凝胶，分离胶为12%的聚丙烯酰胺凝胶。样品缓 冲液中不含巯基乙醇[6] 。取20pL(0.1mg/mL〜 0.5mg/mL)蛋白样品加适量的样品缓冲液在100C下煮 沸5min， 8000g高速离心5min后上样。考马斯亮蓝 染色，染色剂为考马斯亮蓝R-250。
◆采用3K超滤管超滤膜在4000g转速下离心至少5次，以除
去未反应还原剂。同时将整个反应置换成Tris-HCl 8.0 的缓冲体系中。 ◆加入不同比例2mM药物142B1，Drug：IgG比例分别为4、5 、6。比例和体积如表中所示，加入Tris-HCl pH8.0至反 应体系为200pL (表4-3)。采用混匀器混匀后，将反应体 系放置到37C恒温摇床中，180转速下反应1h。 ◆向最终的反应体系中加入半胱氨酸，使其中浓度达到1mM ，猝灭未反应 的药物。反应后的样品采用BCA法检测浓度。
2.1实验机理
抗体被还原到合适的程度后，进行与药物的偶联 反应，通常在pH 7〜8左右，反应温度0°C下反 应1h。例如如果抗体被还原到4巯基/抗体，通常 加入4-5倍的马来酰亚胺接头的药物反应30min[1] 。其中采用二甲基甲酰胺（DMF)或者二甲基乙酰 胺（DMAC)先将药物溶解，然后与抗体还原后的 产物反应[2，3]。加入过量的小分子硫醇进行猝灭 ，来阻止马来酰亚胺与抗体上的巯基进一步反应 ，药物接头的马来酰亚胺被猝灭后，接下来的步 骤就是要除去多余的药物接头以及有机溶剂， EDTA等添加物。
由于药物的成分、均一性与药物的安全以及 药物的疗效息息相关，因此对抗体药物偶联 物的组成、非均一性分析越来越被重视[4] 。疏水色谱柱TSKgelButyl -NPR (4.6mm X 3.5 cm)以对蛋白的高速、高分辨率的分离 性能为广大研宄人员提供了帮助。它以表面 键合有丁基的、粒径为2.5—的非多孔型亲 水性树脂作为填充剂。
2.4.3、疏水作用层析
◆层析前样品处理：采用BCA法检测抗体与药物 偶联后产物的浓度，将产物用PBS稀释到 1mg/mL[7] 。采用0.22pm的超滤膜过滤，除去样 品中杂质。 ◆采用分析柱TOSOH TSKgel Butyl-NPR检测抗体 与药物偶联后的各个产物的生成情况，液相系 统为AKTA Explorer 100。 ◆分析条件：流动相为 Buffer A: 1.5M (NH4)2S〇4，50mM KHPO4，pH 7.0，BufferB: 50mM KHPO4，pH 7.0 加入 20% 异丙醇。