脑和脊髓微透析采样技术的理论
再竭运动恢复期大鼠纹状体微透析液中Glu和GABA含量的变化
微透析液。 每一时刻收集时间为 ３ ０ ｍｉ ｎ ， 提前 １ ５ ｍｉ ｎ开始采集。
收集完成后立即转入 一 ８ ０ ℃低温冰箱保存。
能［ ８ － ９ ］ ｏ因此本研 究采 用微透析技术 取得纹状体细胞 外液 样
品，利用毛细管电泳一激光诱导荧光技术对其中所含 Ｇｌ ｕ及
ＧＡ Ｂ Ａ含 量 进 行测 定 ，动态 观 察 力竭 运 动 ２ ４ ｈ恢 复期 纹状 体
ＤＶ： ． ２ ． ６ ａｍ），在定位部位用颅钻在头骨钻一直径约为 １ ｒ ． ５ ｏｎ ｔ ｉ 的ｄ ｑＬ ，于定位 头骨 表面 下植入 一根直径 １ ． ３ ０ ｍｍ，长 １ ４ ｍｌ ｎ的灭菌不锈钢引导管 ，并用牙科水泥固定。
２ ． ３ 微透析采样
采样时小心将微透析探针沿 引导管探入右侧纹状体脑区， 利用微量注射泵将人工脑脊液 以２ １ ｔ ． ｌ ／ ｍｉ ｎ的速度恒速灌注 ， 平衡 １ ８ ０ ｍ ｉ ｎ ；分别于运动后 ４ ｈ 、５ ｈ 、６ ｈ 、８ ｈ 、２ ４ ｈ收集
ห้องสมุดไป่ตู้
疲劳与细胞外液 Ｇ ｌ ｕ 及Ｇ ＡＢ Ａ含量之间的关系提供实验依据 。
１ 实验材料
１ ． １ 实验 动物 及分组
１ ２只 Ｓ Ｄ 雄性成年大 鼠体重为 ２ ０ ０～ ２ ３ ０ ｇ ，随机分为 两组：（ １ ） 安静对照组 Ａ（ ｎ ＝ ６ ） 正常饲 养， 不施加运动；（ ２ ） 力竭运动组 Ｂ （ ｎ ＝ ６ ）进行一次性 力竭游泳运动 ；分养于室 温下 （ １ ８～ ２ ５ ℃） ，自然光照周期 ，自由进食饮水 。
２ ． ５ 微透析样品检测
采 用毛细 管 电泳一 激光 诱导荧光技 术测 定大 鼠纹 状体 脑区微透 析液 中 Ｇ ｌ ｕ 、Ｇ ＡＢ Ａ含量 。 ２ ． ６ 数据处理 所 有数据均采用平均数 ± 标准差 （ Ｘ±Ｓ Ｄ）表示 ，用 ｓ ｐ ｓ ｓ １ ３ ． ０ 对数据进行重复测量 资料 的方差分析 ，ａ为 ０ ． ０ ５ 。
微透析技术在脑组织研究中的应用
微透析技术在脑组织研究中的应用微透析技术是将推挽灌流和透析技术结合起来并逐渐完善的一种新型生物采样技术，可在麻醉或清醒的生物体上使用，特别适合于深部组织和重要器官的活体生化研究。
微透析技术最早应用于脑内是在1972年美国耶鲁大学报道的猴脑的微透析研究，之后微透析即开始应用于对脑内神经递质的改变，药物动力学监测以及一些疾病脑内神经生理改变的研究，至今已有30多年的历史。
本文就微透析技术在脑组织研究中的应用作一综述。
1 微透析技术的原理及探针回收率的测定微透析技术是以透析原理作为基础的在体取样技术，是在非平衡条件下即流出的透析液中待测化合物的浓度低于它在探针膜周围样品基质中的浓度，灌注埋在组织中的微透析探针，组织中的待测化合物沿浓度梯度扩散进入透析液，被连续不断地带出，从而达到从活体组织中取样的目的，通过测定流出液即透析液中待测物的浓度来研究组织中待测物的水平。
这是一种动态连续的取样方法。
简单地说，微透析技术的原理就相当于在组织中创造了一个“毛细血管”，使化合物在浓度差的作用下扩散而进入此“毛细血管”，然后随液体流动带出体外进行检测。
微透析技术最大的优点是可在基本上不干扰体内正常生理过程的情况下进行在体、实时和在线取样，透析过程探针周围的组织液成分不会发生改变，所以可以持续收集样品，而且被透析动物可以小到老鼠一般大小。
通过微透析技术可以单独取得细胞外液，因此可对大脑神经递质进行活体监测［1］，由于透析液中不含蛋白质和酶等生物大分子，能直接进样进行高效液相和毛细管电泳等生化分析，免除了复杂的进样前样品处理及由此而产生的样品损失和误差，也不会因在室温取样而酶解，提高了样品的稳定性，而且随着现代技术的进步可以对微透析试验进行全程的自动化控制。
微透析试验中一个重要的步骤是要测定微透析探针的回收率(透析液中待测化合物的浓度与其在样品基质中浓度之比)，由于微透析是在非平衡条件下取样，所以所测得的透析液中化合物的浓度只是探针周围样品基质中该化合物浓度的一部分。
利用微透析技术在大鼠脑内取样的方法
利用微透析技术在大鼠脑内取样的方法本文通过查询文献并结合笔者的实际操作经验，介绍微透析技术原理，以及利用微透析技术进行清醒大鼠rACC脑区定位取样的方法。
标签：微透析；透析液；立体定位；rACC脑区；大鼠前扣带皮层（anterior cingulate cortex，ACC），尤其是其吻侧部（rostral ACC，rACC）是参与情绪情感反应的重要中枢[1-3]。
已有研究证实，rACC也是伤害性刺激传入高位中枢时形成痛厌恶情绪的重要脑区[4-6]，那么在痛情绪发生时rACC脑区神经元释放的神经递质有何变化是我们所关注的。
微透析技术正是一种可以探究这一問题的手段。
该技术是将灌流取样和透析技术结合起来并逐渐完善的一种从生物活体内进行动态微量生化取样的新技术，具有活体连续取样、动态观察、定量分析、采样量小、组织损伤轻等特点[7]。
目前，微透析技术主要应用于大脑、血液、脊髓等部位[8-11]，通过定位后取样再检测，观察目标神经递质的相对变化，可在麻醉或清醒的生物体上使用。
在清醒生物体上进行微透析实验比起麻醉生物体，取得的样本会更接近于正常生理状态[12]。
但由于动物处于可自由活动的状态，存在很多不确定因素，因此实验中所需的条件和对动物的各种操作均要在不断地摸索和尝试中确定。
笔者通过查询文献并结合作者的实验操作经验，介绍利用微透析技术进行清醒大鼠rACC脑区定位取样的方法，现报道如下。
1 定位1.1 微透析探针的选取微透析探针的供应商有瑞典的CMA公司，美国的BAS公司和日本的EICOM公司，另外也有实验室采用自制的微透析探针。
本实验室采用的是EICOM公司的探针，根据定位脑区的深度和所需检测的目标神经递质的分子量大小（一般检测的神经递质为氨基酸类神经递质和单胺类神经递质），选择所需的探针规格。
EICOM公司的脑组织探针主要有三个系列，本实验室选用的探针样式为A-Z系列带有导管、内芯和导管配套的螺帽，探针规格为管长4 mm，膜长2 mm，膜材料：人造纤维素，50 kDa截留分子量，见图1。
临床--脑脊液检验采集与处理、理学检查
脑脊液检验采集与处理、理学检查标本采集与处理（一）脑脊液检验的适应证和禁忌证脑脊液检验需腰椎穿刺采集标本，必要时行小脑延髓池和脑室穿刺。
脑脊液穿刺的时机与疾病有关，化脓性脑膜炎于发病后1～2d、病毒性脑膜炎于发病后3～5d、结核性脑膜炎于发病后1～3周、疱疹性脑膜炎于流行性感冒前驱症状期开始后5～7d穿刺采集标本。
（二）标本采集与处理留取脑脊液标本于3个无菌试管中，每个试管1～2ml。
第一管作病原生物学检验；第二管作化学和免疫学检验；第三管作理学和细胞学检验。
标本采集后应立即送检，并于1h内检验完毕。
标本放置过久，可造成细胞破坏、葡萄糖等物质分解、细菌溶解等，影响检验结果。
理学检查（一）颜色肉眼观察脑脊液颜色变化，分别以无色、乳白色、红色、棕色或黑色、绿色等描述。
正常脑脊液无色透明，新生儿胆红素较多可呈黄色。
如表：脑脊液常见的颜色变化及临床意义（二）透明度正常人CSF清晰透明病理状态，透明度改变：细胞数量和细菌病毒性脑膜炎清晰透明或微浑 WBC＞300×106/L结核性脑膜炎毛玻璃样浑浊化脓性脑膜炎脓性、块样浑浊报告方式：清晰透明、微浑、浑浊三级报告（三）凝固性正常人CSF12～24小时以后不形成薄膜。
病理状态，蛋白质＞10g/L，薄膜或凝块。
（四）比密脑脊液比密为：腰椎穿刺1.006～1.008；脑室穿刺1.002～1.004；小脑延髓池穿刺1.004～1.008。
凡是脑脊液中的细胞数量增加和蛋白质含量增高的疾病，其比密均增高。
常见于中枢神经系统感染、神经系统寄生虫病、脑血管病、脑肿瘤、脑出血、脑退行性变和神经梅毒等。
微透析在外用制剂评价中的应用
微透析在外用制剂评价中的应用标签：微透析；外用制剂；体内外评价；综述内病外治是中医理论精髓之一，经皮给药又是中医主要的外治方法之一。
经皮给药可以避免胃肠道刺激、避开肝脏首关效应，同时能够在病变部位维持稳定持久的血药质量浓度，近年来受到越来越多制剂工作者的关注。
对于经皮给药制剂，药物只有透过皮肤才能在局部或全身发挥作用，而目前对经皮给药制剂的体内评价受到局部组织采样和动态监测困难、药效物质基础不明确等因素的限制，外用制剂的发展受到制约。
因此，如何对经皮给药制剂进行体内外药代动力学进行评价，对外用制剂的研发具有直接的现实意义。
1 现有评价经皮给药制剂药代动力学的方法1.1 体外扩散池法两室Franz扩散方法、流通池扩散方法是目前最常用评价药物透皮吸收的方法。
所用材料为离体动物、人皮肤或人工膜。
其主要优势是实验条件可以得到准确的控制，但也还有明显的不足之处。
对高乌甲素透皮吸收不同接收液的比较研究发现，以生理盐水/乙醇液为接受液的所拟合方程的透皮速率常数为最高，提示接受液加入一定浓度的乙醇在提高高乌甲素的溶解度的同时，可使角质层膨胀疏松，增加皮肤的通透性，从而减少时滞[1]。
对于在生理盐水中溶解度较小的药物，选择何种接收液能模拟人体的正常状态是目前的一个难点，特别是一定有机溶媒的存在，会改变角质层的结构，虽然得到的稳态渗透速率或累计渗透量增加，但并不符合生理情况。
皮肤的处理和贮藏也可能影响到皮肤的屏障功能，虽然目前尚无明确的结论，但一些研究表明，冷冻前皮肤组织的水合作用可能影响到其后的通透特性[2-3]。
因此，离体研究结果不能准确反映药物在皮肤中的吸收、分布、代谢、转归等局部药代动力学过程。
1.2 体内血浆药物浓度法该法是目前最常用的评价药物透皮吸收的体内分析方法。
对于经皮给药系统（TDD），此方法能直接反映药物的药代动力学过程。
如东莨菪碱、硝酸甘油、可乐定、雌二醇、睾酮、芬太尼等局部给药可以提高全身血药水平，通过监测血药浓度，可为药物的治疗提供依据。
微透析技术及其在中医药研究中的应用
于监测脑细胞外神经化学物质。之后这项技术得到许多
基金项 目： 国家 ９ ３ ＊ ７ 计划资助项 目（ ０ Ｃ ５２ ） ２ ５ Ｂ ２３ ０ 作者简 介： 向： 刘 １ 一） 女 副 ７ 在 研
经 穴脏腑 相关 。 收稿 日期 ：０７—０ —２ ２０ ３ ０ 修 回 日期 ：Ｏ ７ ４ ７ ２０ —０ —０
术， 是在非平衡条件下（ 即流出的透析液中待测化合物
的浓 度 低 于它 在探针 膜 周 围样 品基质 中 的浓度 ）灌 注 ，
埋在组织中的微透析探针 ， 组织中的待测化合物沿浓 度梯度扩散进入透析液 ， 被连续不断地带出， 从而达到
从 活体 组 织 中取样 的 目的 ， 过 测定 流 出液 即透 析 液 通 中待 测 物 的浓 度来 研究 组 织待 测 物 水 平 ， 是一 种 动 这
术 支撑 。
关键词 ： 透析技 术 ； 医药研 究 ； 用 微 中 应
中 图分 类 号 ： ２—０ Ｒ ３ 文献 标识 码 ： Ａ 文章 编号 ：０２— ４ ６ ２ ０ ） ４ ０ １ ２ １０ ２ ０ （０７ ０ —００ —０
微透析是一种在体采样技术 ， 其机理是利用微透
析探 针 等技术 对 生物 样 品等 进 行 透 析 ， 探 针植 入透 将 析 部位 （ 如脑 、 液 、 体 组织 等 ）小 分 子 物 质 在 浓 度 梯度 ， 的作 用 下穿 过透 析膜 ， 入透 析液 ， 进 而透 析液 不 断被移 走 从而保 持 浓 度 梯度 … １。上 世 纪 ８ ０年代 中期 兴 起 的 微 透析 技术 ， 渐受 到生 物 医学 界 和 分 析 化 学 界 的关 逐 注 ， 入 上世 纪 ９ 代 ， 项 技 术在 生 命 科 学研 究 中 进 ｏ年 这 得 到广 泛应用 。近年 来 ， 于微 透 析 技 术 及 其应 用 研 由
简述csf方法的步骤
简述csf方法的步骤CSF（Cerebrospinal Fluid）法是一种常用的检测脑脊液成分和生物学性质的方法，主要用于脑脊液疾病的诊断和治疗。
其步骤如下：1.采集脑脊液采集前需要对病人进行详细询问及体格检查，明确采集适应症及禁忌症，确认无风险后进行采集。
一般选择L3-4或L4-5点，注意局部消毒，用长针头穿过皮肤和椎间隙，最终进入蛛网膜下腔，采集脑脊液。
采集后，需要及时送至实验室进行检测。
2.外观检查收到脑脊液样本后首先进行外观检查，检查脑脊液是否为清澈无色透明液体，或者出现针眼效应，脑脊液中是否混浊、脓性或者带血。
对于混浊或有异样的脑脊液需要进一步分析原因。
3.离心离心是用来处理脑脊液中混有细胞及其他杂质的方法。
将脑脊液离心5分钟后，上层液为脑脊液，下层沉淀物为细胞和杂质。
4.检测生化指标生化指标检测是CSF检测中最常见的方法，从脑脊液中检测蛋白、糖、氯、钠等指标，包括总蛋白质浓度、白蛋白和球蛋白比例、糖浓度、氯浓度和钠浓度等。
这些指标的变化可以帮助医生判断是否存在一些疾病。
5.静压检测静压是指脑脊液在穿刺时能够通过椎管进入大脑和脊髓的压力，可以反映出泌脑脊液的功能状态。
通常，健康的人的脑脊液静压是60至180毫米水柱。
如果脑脊液静压超过正常范围，可能会存在一些疾病，需要进行进一步检查。
6.细胞分类细胞分类检测可以鉴别脑脊液中的不同类型的细胞，包括白细胞、红细胞及上皮细胞等，并确定它们的数量。
根据检查结果，可以判断是否存在一些细胞异常或病毒感染。
总的来说，CSF法是一种较为简单和常用的脑脊液检测方法，可以帮助诊断和治疗多种疾病，但也需要严格掌握采集和处理方法，否则会影响检测结果。
脑脊液检验方法及临床意义
脑脊液检验方法及临床意义摘要】探讨脑脊液(CSF)常规检测方法及临床应用。
对标本采集、理学检验、化学检查及显微镜检查方法进行分析。
为临床提供更多的诊断指标，为中枢神经系统疾病的诊断、鉴别诊断、治疗及预后观察提供了丰富的信息。
【关键词】脑脊液检验方法临床应用【中图分类号】R445 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2014）33-0068-02脑脊液(CSF)是一种细胞外液，主要由各脑室的脉络丛通过血液透析作用而产生，充满脑室系统及脑和脊髓的珠网膜下腔，最后同到血液循环。
它的产生和叫流保持着动态平衡，正常成人脑脊液量120～180ml[1]。
随着生物化学、免疫学检验技术尤其是分子生物学技术的发展，CSF检验开拓了许多新的研究领域，为临床提供更多的诊断指标，为中枢神经系统疾病的诊断、鉴别诊断、治疗及预后观察提供了丰富的信息。
1.标本采集标本采集后应立即送检，化验一般不超过1h。
容器要清洁、无菌，容积不应太大。
穿刺采集时，尽量避免将血液带入标本。
为了不影响细胞汁数，遇高蛋白标本时，可加少量抗凝剂。
2.理学检验标本采集2.1颜色正常脑脊液为无色透明。
①无色，除正常外，梅毒性神经炎、慢性结核性脑膜炎、脊髓灰白质炎，脑炎等也无色。
②红色脑脊液中混入血红细胞所致，由于出血量和出血时间的不同，可呈不同颜色，淡红、红色、红褐色。
将脑脊液离心，上层溶液呈黄色，隐血试验阳性多为蛛网膜下腔陈旧性出血，上层液体澄清，无色，红细胞均沉于管底，多为穿刺损伤或病变所致的新鲜出血。
③黄色又称黄变症，主要见于珠网膜腔陈旧性出血、椎管梗阻、化脓性脑炎，重症结核性脑膜炎、流行性脑炎、脊髓肿瘤、重症黄疸，某些药物等。
④绿色见于绿脓杆菌、肺炎双球菌、甲型链球菌性脑膜炎。
⑤乳白色(米汤样)见于各种化脓性细菌引起的脑膜炎。
⑥褐或黑色见于侵犯脑膜黑色素肉瘤。
2.2透明度正常脑脊液为澄清透明，根据混浊程度可报告为清晰、微混和混浊，脑脊液透明度降低见于乙型脑炎、脊髓灰质炎、脑脓肿等。
2.脑脊液、骨髓的采集
常用实验动物脑脊液、骨髓的采集脑脊液的采集麻醉犬，让犬处于侧俯卧位，使其头与尾尽量向腹中弯曲，用剪毛剪将第七腰椎周围被毛剪去，用3％碘酊和75％酒精严格消毒后，在犬背部客骨连线中点稍向下方摸到第七腰椎间隙（第七腰椎与第一荐骨之间）插入腰椎穿刺针头，当针达到管内时（蛛网膜下腔）可见到犬后肢有抽动，即证明穿刺针头已进入椎管。
此时不要再向下刺，以免损伤脊髓。
然后抽出穿刺针芯，可见透明的脑脊髓液慢慢滴出。
犬一次抽2～3ml，但抽好后，注入同样量的生理盐水，以保持原来脑脊椎里的压力。
(一)狗、兔脑脊液的采集通常采取脊髓穿刺法穿刺部位在两髂连线中点稍下方第七腰椎间隙。
动物轻度麻醉后，侧卧位固定，使头部及尾部向腰部尽量弯曲，剪去第七腰椎周围的被毛。
消毒后操作者在动物背部用左手姆、食指固定穿刺部位的皮肤，右手持腰穿刺针垂直刺入，当有落空感及动物的后肢跳动时，表明针已达椎管内( 蛛网膜下腔)，抽去针芯,即见脑脊液流出。
如果无脑脊液流出，可能是没有刺破蛛网膜。
轻轻调节进针方向及角度，如果脑脊液流的太快，插入针芯稍加阻塞，以免导致颅内压突然下降而形成脑疝。
(二)大鼠脑脊液的采集可采用枕大孔直接穿刺法在大鼠麻醉后，头部固定于定向仪上。
头颈部剪毛、消毒，用手术刀沿纵轴切一纵行切口(约2cm）用剪刀钝性分离颈部背侧肌肉。
为避免出血，最深层附着在骨上的肌肉用手术刀背刮开，暴露出枕骨大孔。
由枕骨大孔进针直接抽取脑脊液。
抽取完毕逢好外层肌肉、皮肤。
刀口处可撒些磺胺药粉，防止感染。
采完脑脊液后，应注入等量的消毒生理盐水，以保持原来脑脊髓腔的压力。
骨髓的采集1. 大鼠、小鼠骨髓的采集：用颈椎脱臼法处死动物,剥离出胸骨或股骨，用注射器吸取少量的Hank平衡盐溶液，冲洗出胸骨或股骨中全部骨髓液。
如果是取少量的骨髓作检查，可将胸骨或股骨剪断，将其断面的骨髓挤在有稀释液的玻片上，混匀后涂片凉干即可染色检查。
2. 大动物骨髓的采集：狗等大动物骨髓的采集可采取活体穿刺方法。
微透析技术
微透析技术一、微透析技术微透析(Microdialysis)技术是一种将灌流取样和透析技术结合起来并逐渐完善的一种从生物活体内进行动态微量生化取样的新技术。
具有活体连续取样、动态观察、定量分析、采样量小、组织损伤轻等特点。
可在麻醉或清醒的生物体上使用，特别适合于深部组织和重要器官的活体生化研究。
目前已成为实验神经生理学和神经化学的重要研究工具之一, 它可提供递质释放、摄取和代谢的必要信息。
1、主要原理以透析原理作为基础，通过对插入生物体内中的微透析探头在非平衡条件下进行灌流，物质沿浓度梯度逆向扩散，使被分析物质穿过膜扩散进入透析管内,并被透析管内连续流动的灌流液不断带出，从而达到活体组织取样的目的。
2、微透析系统及其特点2.1、微透析系统装置主要由微量泵、微透析探头、收集器、连接管及配套设备组成。
2.1.1、微量泵以注射泵为佳,有利于减少恒流泵和蠕动泵的波动, 流速一般为1~5μl/min。
2.1.2、微透析探头有直线性探头、环形探头、同心型探头等不同的类型(微透析管因实验对象不同而形状大小各异)；按照探头的形状分为穿颅探头、U型探头、I型探头、环形探头等。
目前普遍应用的是同心型探头，微透析探头通常是由一管式半透膜与不锈钢、石英或塑料毛细管构成双层管道；长度一般为1～10 cm。
半透膜由再生纤维素、聚碳酸酯或聚丙烯腈制成, 载留分子量5～10 KD不等。
实际应用需根据具体组织和待测物选择不同的微透析探头。
微透析技术最大的优点是可在基本上不干扰体内正常生命过程的情况下进行在体( in vivo)、实时( real time) 和在线(on line) 取样, 特别适用于研究生命过程的动态变化。
微透析技术的优点是活体取样、动态观察、定量分析、采样量小、组织损伤轻等。
该技术的另一大优点是样品的采集与分析过程既可在位又可离位进行。
此外微透析技术的独到之处是可以单独取得细胞外液, 因此可对体内神经递质的释放量进行动态监测, 具有重要的生物学意义。
脑内微透析采样技术
对高K+的影响
高K+能诱导神经元产生去极化进而释放 神 经 递 质 增 加 ， 研 究 发 现 当 灌 流 液 中 K+ 浓度由30mM增加到100mM，灌流液中DA、 5-HT、Ach、NA等释放迅速增加。同时发 现氨基酸类物质释放也增加。
应用脑电刺激的影响
通过电刺激脑内神经投射通路促 进神经递质的释放。
TTX是一种神经毒素，能够阻断Na+通道， 抑制神经元的电活动，减少神经递质的 释放。根据文献报道，TTX对DA，5-HT等 这类递质的释放有较高的敏感性。而对 氨基酸如谷基酸、牛磺酸等物质的释放 无效。
对Ca2+的依赖性
Ca2+的内流与神经递质的释放有密切的关 联，降低细胞外Ca2+浓度能抑制突触神经 递 质 的 释 放 。 实 验 发 现 用 不 含 Ca2+ 的 Ringer's 液 灌 流 发 现 灌 流 液 中 递 质 如 DA 、 5-HT、Ach、NA等释放逐渐消失。
样品检测
透析样品可直接用HPLC-电化学/荧光/紫 外检测技术或其他高灵敏度微量化学分 析法测定。对于某些含量极低的物质， 可增加回收率的方法来弥补灵敏度的不 足。如可加长透析膜的有效长度、改变 灌流速度，也可使用药方法（如在灌流 液中添加摄取阻断剂）以提高待测物质 含量。
微量采样的定量方法
在微透析实验中，我们通常关心的是药 物或行为操作所引起的神经递质释放的 变化，这种变化可以用相对于基础浓度 的百分数表示。也可以通过计算透析回 收率，将透析液中物质的浓度转换成脑 内细胞外的实际浓度。
微透析与传统的灌流方法相比 具有：
由于灌流液并不直接与脑组织接触，其 对脑组织损害较小。
微透析样品通过透析膜过滤而得到，样 品避免受到大分子物质如蛋白质、酶类 等污染，透析样品可直接进样测试。
微透析技术的应用
参考文献
[1]余自成，陈红专，微透析技术在药物代谢和药代动力学研究中的应用，中国离床药理学杂志2001年1月第17卷第1期76-80
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第二是flexible probe，它是由两根由透析膜覆盖的硅管组成。它的柔性足以在清醒动物的血管内取样，但是在体内其他组织，如肝，肌肉和肿瘤等，还有一定局限性。因为他还是不能确保探针不伤害靶组织。[6]
第三是linear probe，可用于肌肉，皮肤，肝脏和肿瘤等空间分辨率不像脑中那么重要的地方。Linear probe是将探针穿在组织中，使得透析膜能够完全的植入靶组织。[6]
[3] William F.Elmquist,Ronald J.Sawchuk,Application of Microdialysis in Pharmacokinetic Studies,Phramaceutical Research,Vol.14,No.3(1997)267-288
[4] Roger K. Verbeeck,Blood microdialysis in pharmacokinetic and drug metabolism,Advanced Drug Delivery Reviews 45 (2000) 217–228
[5] Virna J.A. Schuck, Irene Rinas, In vitro microdialysis sampling of docetaxel,Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 36 (2004) 807–813
大鼠脑脊液骨髓的采集方法
大鼠脑脊液骨髓的采集方法步骤一：麻醉大鼠将大鼠置于麻醉箱中，使用一般常用的麻醉方法，如使用注射器将麻醉剂注射到大鼠体内，或将大鼠放入具有麻醉效果的气体环境中（如氧化乙烯、异氟醚等），使大鼠进入深度麻醉状态。
步骤二：准备工具和材料准备需要的实验器材和材料，包括注射器、微量注射器、针头、创口贴、消毒液、手套等。
步骤三：固定大鼠的头部将麻醉好的大鼠放到一块柔软的垫子上，然后将大鼠的头部固定在取样位置上，以保证操作时头部不会有移动。
步骤四：刮除毛发并消毒使用刀片或电动剃刀将取样部位的毛发刮除干净，并用消毒液进行彻底消毒，以避免感染。
步骤五：穿刺脊髓采用腰椎穿刺法，使用无菌注射器和针头将其插入到脊髓腔内。
刺穿脊髓后，抽取相应的脑脊液样品。
步骤六：收集脑脊液利用微量注射器收集抽取的脑脊液样品，注意避免气泡的产生。
收集足够的脑脊液样品用于后续实验。
步骤七：处理采集部位在完成采集后，将针头缓慢地拔出，然后用无菌纱布或创口贴轻轻按压采集部位，以止血，防止感染。
大鼠骨髓的采集方法：步骤一：麻醉大鼠将大鼠置于麻醉箱中，使用一般常用的麻醉方法，如使用注射器将麻醉剂注射到大鼠体内，或将大鼠放入具有麻醉效果的气体环境中（如氧化乙烯、异氟醚等），使大鼠进入深度麻醉状态。
步骤二：准备工具和材料准备需要的实验器材和材料，包括注射器、微量注射器、针头、创口贴、消毒液、手套等。
步骤三：固定大鼠的肢体将麻醉好的大鼠放到一块柔软的垫子上，然后将大鼠的肢体固定在取样位置上，以保证操作时肢体不会有移动。
步骤四：消毒使用适当的消毒液对骨髓采集部位进行消毒，以避免感染。
步骤五：穿刺骨髓用带有针头的注射器穿刺骨髓。
穿刺一般选择胫骨、肱骨或股骨中的一根较粗的部位，并确保穿刺角度和力度适合。
步骤六：采集骨髓通过注射器吸取骨髓样品，并将其收集在一支干燥、清洁的离心管中。
确保采集到足够的骨髓样本以供后续实验使用。
步骤七：处理采集部位在完成采集后，将针头缓慢地拔出，然后用无菌纱布或创口贴轻轻按压采集部位，以止血，防止感染。
药物通过渗透血 - 脑脊液血 - 脑屏障进行中枢神经系统感染的治疗
药物通过渗透血 - 脑脊液/血 - 脑屏障进行中枢神经系统感染的治疗介绍由病原体引起的中枢神经系统（CNS）感染用药物降低灵敏度是治疗的挑战。
尤其由抗肺炎球菌，耐甲氧西林葡萄球菌，多重耐药革兰氏阴性需氧杆菌，或其他几个生物（包括曲霉，尖端赛多孢子菌，和星状诺卡氏菌）造成的青霉素感染，主要影响患者中枢神经系统中免疫功能低下。
本文旨在提高中枢神经系统内抗感染的药代动力学特殊性的认识。
颅内，椎管内的空间由多个隔室组成。
即使在同一个隔室的各个区域如，脑脊液（CSF）、心室、脑池、腰，药物浓度也会有很大的差异。
这最可能是中枢神经系统的细胞外空间。
多数人们一般研究在心室、腰椎、脑脊液的药物浓度，但药物浓度出现在组织匀浆（即，不仅在脑组织）一般很难解释，本文旨在脑脊液中的研究。
许多药物进入颅内隔室药代动力学数据是不完整的。
因为这个原因，本文将基于药物'的物理化学性质提供一些线索，其有助于评估这些化合物最有前途的用于中枢神经系统感染的治疗。
血-脑/血-脑脊液屏障的生理学最先证明血脑/血脑脊液屏障的存在是由保罗·埃尔利希在19世纪末实验得出的：他将苯胺染料注射进实验动物的血液中，观察到除大脑外的所有器官都被染色。
在20世纪初，艾氏学生埃德温·戈德曼静脉注射台盼蓝（静脉注射）或皮下.台盼蓝将脉络丛和硬脑膜染色，但没有大幅进入脑脊液。
相反，直接将台盼蓝注入脑脊液，大脑和脊髓被染色，表明在脑脊液和脑组织之间不存在紧密的扩散屏障。
先前，对血-脑/血-脑脊液屏障的报道说：鞘内注射30mg的亚铁氰化钠会引起惊厥，而静脉注射更高的2个数量级的剂量没有引起中枢神经系统症状。
此后，用较强的亲水性化合物进行的实验，例如，菊粉和辣根过氧化物酶，结果表明，血脑屏障的形态关联是由脑血管内皮细胞紧密连接的。
硬脑膜和蛛网膜之间，若干扁平细胞层通过紧密连接和紧密间隙连接相连，并被一个不完整的基底膜覆盖。
在小脑区域，毛细血管内皮不具备紧密连接（下丘脑正中隆起，在第四脑室底部最后区，以及第三脑室顶部的穹窿下器）。
脊髓穿刺术实训报告总结
一、实训背景脊髓穿刺术是一种常用的神经外科操作，主要用于诊断和治疗中枢神经系统疾病。
随着医学技术的不断发展，脊髓穿刺术在临床上的应用越来越广泛。
为了提高医学生的临床操作技能，加强理论知识与实践技能的结合，我们组织了脊髓穿刺术实训。
本次实训旨在让学生掌握脊髓穿刺术的操作方法、适应症、禁忌症以及注意事项，提高临床诊断和治疗水平。
二、实训目的1. 掌握脊髓穿刺术的操作步骤和技巧；2. 了解脊髓穿刺术的适应症、禁忌症和并发症；3. 提高医学生的临床思维能力和团队合作意识；4. 培养医学生严谨、细致、负责的工作态度。
三、实训内容1. 脊髓穿刺术的理论知识：讲解脊髓穿刺术的定义、发展历程、适应症、禁忌症、并发症、术前准备、术中注意事项等。
2. 脊髓穿刺术的操作技能：通过模拟操作和真人操作，让学生掌握脊髓穿刺术的操作步骤、技巧和注意事项。
3. 脊髓穿刺术的并发症处理：讲解脊髓穿刺术可能出现的并发症，如出血、感染、神经损伤等，并介绍相应的处理方法。
4. 脊髓穿刺术的临床应用：分析脊髓穿刺术在临床诊断和治疗中的应用案例，提高学生的临床思维能力。
四、实训过程1. 理论学习：通过课堂讲解、阅读教材、查阅资料等方式，让学生掌握脊髓穿刺术的相关理论知识。
2. 模拟操作：在模拟人模型上进行脊髓穿刺术的操作练习，熟悉操作步骤和技巧。
3. 真人操作：在临床老师的指导下，对真人进行脊髓穿刺术的操作，巩固所学知识。
4. 交流讨论：在实训过程中，学生之间、学生与老师之间进行交流讨论，分享操作心得，提高操作水平。
五、实训成果1. 学生掌握了脊髓穿刺术的操作步骤和技巧，能够独立进行脊髓穿刺术操作。
2. 学生了解了脊髓穿刺术的适应症、禁忌症和并发症，提高了临床诊断和治疗水平。
3. 学生培养了严谨、细致、负责的工作态度，提高了临床思维能力。
4. 学生加强了团队合作意识，能够与临床老师和其他同学共同完成实训任务。
六、实训总结1. 脊髓穿刺术实训是医学教育中非常重要的一环，有助于提高医学生的临床操作技能和理论水平。
【实用】干化学分析PPT文档
干化学分析仪 Kubelka-Munk理论和Williams-Clapper公式
固相，大多无需定标，稳定周期长（数月），全血可直接上机检测
品中特定成分的浓度或活度。
。
4
一、干化学分析技术的基本原理
• 干化学技术普遍采用多层膜固相试剂技术，即干 式化学的多层膜试剂载体，它集中现代化学、光 学、酶工程学、化学计量学和计算机技术于一体， 已使其作为定量方法。
干式化学的多层膜试剂 载体
磁卡校正，无需排水系统，分析 每次测试原则上需要校正，需
前后无需清洗
要排水系统，测试前后需清洁
固相介质
反应杯
反射光度法
透射光度法
差示电位法
离子选择性电极法
Kubelka-Munk理论和Williams-
理论基础
Clapper公式
Lambert-Beer定律
11
三、干化学分析技术的影响因素
➢ 1.仪器监测 ➢ 2.校准频度 ➢ 3.质控物 ➢ 4.干片试剂的储存与使用 ➢ 5.工作环境温度和湿度
超应微量用，L操a作mb简e单rt，－占用Be空e间r定小，律使时用过必程须中符灵活合机3动个性条强。件：
10
干化学和湿化学生化检测的主要区别
区别点 试剂
干化学
湿化学
固相，大多无需定标，稳定周期 液体，需要定标，稳定周期短， 长（数月），全血可直接上机检 全血不可直接上机检测
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脑和脊髓微透析采样技术的理论、方法和应用1王云综述 1 岳云2史琳审校1首都医科大学附属北京朝阳医院麻醉科（100020）2比利时布鲁塞尔自由大学医学中心麻醉科1、概述全麻下中枢神经系统功能变化的研究是麻醉学领域内重要的课题之一，全麻下中枢神经系统的功能诸如学习和记忆、感觉和运动、觉醒与无意识等的变化与神经元之间的信息传递有着极大的关系。
而神经元之间的信息的传递是以递质分子的释放、识别和灭活为基础的。
神经细胞间隙是神经元之间传递信息的主要场所，因此了解全麻下中枢神经系统活动机理，必须对神经细胞间隙中的化学物质进行动态监测。
传统的神经化学的研究大多是对离体脑组织的分析，这些离体分析方法所提供的通常是一种静态的、混杂的结果，包括了细胞器、细胞浆及细胞外液中成分的总和。
随着认识的深入和材料科学的进步，人们在推挽灌流基础上发展了的微透析技术，再加上微量递质检测技术的飞速发展，使得活体动物神经递质的在线测量成为可能，从而使行为学的研究与中枢神经系统相应区域的神经递质的释放相联系起来，有利于更深层次地揭示整体动物神经活动过程中的化学调控规律。
目前，此技术已成为研究全麻下神经化学特别是神经递质和神经肽的重要手段，并开始应用于疼痛的脑和脊髓机理的研究，临床上亦有使用该技术监测脑代谢的报道。
2、脑和脊髓微透析的原理2．1原理微透析是监测活体组织细胞外化学物质变化的一种技术，它以小分子物质和水能通过半透膜顺浓度梯度扩散的原理为基础。
将透析膜植入特定区域，用组分和理化性质类似于相应组织细胞外液的溶液进行持续灌流，当待测物质的浓度在透析膜一侧较高时，这些物质就会顺浓度梯度进行扩散。
由于灌流的持续进行，透析管内的液体不断的流动更新，因此跨膜浓度梯度始终存在。
通过不断收集一定量的灌流液测定其中的待测物质的含量，从而达到对该物质的动态监测。
2．2回收率（recovery）微透析探头的透析效能可以它对待测物质的回收率来表示，通过比较透析液和探头外介质中待测物质的浓度可以确定该物质的回收率。
相对回收率（relative recovery）是指透析液中物质浓度与透析探头外介质中该物质浓度的比值。
它与灌流液的流速成反变关系，当流率接近零时，相对回收率可接近100%。
相对回收率通常以百分数表示。
绝对回收率（absolute recovery）是指用不含待测物质的灌流液灌流时，单位时间内进入透析管并从透析管内流出的该物质的总量。
它在一定范围内与灌流液的流速成正变关系，当流率为零时绝对回收率也为零。
2．3定量方法在微透析实验中，了解神经递质在探头外介质中的实际浓度不是必不可少的。
人们更感兴趣的是某种药物或行为操作所引起的神经递质及其代谢产物的变化趋势（增加或减少），这种变化可用给予药物或操作后透析液中该物质的浓度相对于基础状态（随实验设计而定）下透析液中的浓度的百分数来表示。
这种定量方法是目前微透析研究中应用最多的定量方法，简单明了且能说明问题。
3、微透析下影响神经递质释放的离子因素微透析技术作为一个研究在体神经递质释放的方法，其前提假设是细胞外物质浓度准确地反映了突触部位的物质浓度。
问题是一种神经递质的细胞外浓度不仅仅受神经元突触末梢释放的影响，还受酶降解、递质弥散和递质的再摄取的影响。
而且，神经胶质细胞也可释放神经递质并且不受Ca2+的影响。
因此，透析液内神经递质的浓度并不完全反映突触神经递质的释放。
许多学者对此进行了对照研究，认为实验因素如疼痛、药物等所诱导的透析液内神经递质水平的变化至少可以部分反映突触的释放。
他们的研究还认为离子如K+，Na+，Ca2+等因素对透析液内神经递质的水平影响较大。
透析灌流液内的高K+是诱发神经递质释放的重要因素。
高K+灌流液内的K+能透过透析膜进入组织使细胞去极化，导致递质的释放。
开放Na+通道的神经毒素藜芦定（veratridine）也可刺激神经递质的释放。
Na+通道阻断剂如河豚毒素（tetrodotoxin）可减少神经递质的释放或阻断刺激所诱发的神经递质的释放。
除了某些氨基酸呈电压依赖性释放（与Ca2+机制无关）外，经典的神经递质均为Ca2+依赖性囊泡释放。
采用低Ca2+高Mg2+的灌流液灌流将减少透析液内递质的水平（Mg2+可通过与Ca2+竞争运输和结合而阻断Ca2+通道）。
从灌流液中去除Ca2+并加入Ca2+通道阻断如维拉帕米等，自发性释放、药物和K+刺激所诱发的神经递质的释放都将减少，由此可证明经典神经递质的囊泡释放理论。
然而，由于技术的限制（基础水平接近于检测限）、非囊泡释放和神经胶质细胞源性的递质的释放等，神经递质的Ca2+依赖性自发释放很难得到证实。
4、设计微透析实验的注意事项4.1探头的类型、性能和选择神经麻醉学领域多为脑和脊髓微透析实验，使用的探头为同心圆型或线形，瑞典CMA 公司和美国BAS公司生产多种类型的实验用探头。
另外，该公司还可按客户要求制造特殊的探头。
BAS公司还生产线形和环形探头可供脊髓微透析使用。
线形探头的透析膜在中间，可用于清醒自由活动大鼠脊髓背角微透析。
环形探头的透析膜在中间并呈环形，常用于麻醉或清醒自由活动大鼠鞘内脑脊液微透析。
微透析实验前必须先确定实验的待研究部位如脑或脊髓、待研究部位的空间大小、待测物质的分子量大小、待测物质在透析液内浓度的数量级等，以便选用探头。
一般在满足实验要求（如空间分辨率和所测定物质等）的情况下，尽量选用膜长较长（回收率高）、杆和膜径较细（组织损伤小）的探头。
4.2 灌流液成分和灌流速率为使灌流成分不影响生理或实验情况下神经递质的释放，灌流液通常选用生理液如林格氏液或人工脑脊液（ACSF）。
灌流液成分如K+，Na+，Ca2+，Mg2+和pH对物质的回收率有较大的影响，理想的灌流液应尽可能接近细胞外液。
灌流速率与相对回收率成反变关系，与绝对回收率成正变关系。
流率越低，透析液中的物质浓度越高。
透析实验使用的灌流速率一般在0.5-10µl/min之间。
脑微透析通常使用的灌流速率为2µl/min，脊髓微透析通常使用的灌流速率为5µl/min。
每次透析样品收集的容量与所研究物质的检测方法以及实验所需的时间分辨率有关。
当使用高效液相（HPLC）等检测待测物质时，对样品的收集量要求较低，可收集较少的容量如10-20µl以提高实验的时间分辨率；当分析仪器灵敏度较低，实验对时间分辨率要求不高时可尽量收集较多的样品，以提高检测的响应值。
一些肽类物质如P物质和降钙素基因相关肽等在透析液中的浓度较低，常采用放射免疫法（radioimmunoassay, RIA）或酶联免疫法（enzyme immunoassay, ELISA）检测, 这些检测方法对待测物质的绝对量的要求比浓度高，可在满足实验所需的时间分辨率的前提下通过提高灌流速率和延长收集时间达到。
4.3 增加透析液内物质的检出率的策略由于透析液内神经递质的基础水平往往接近于分析仪器的检测限，因此实验中得到一个稳定的神经递质的基础释放值并不容易。
乙酰胆碱释放后易酶解破坏、单胺类物质释放后易被突触前膜再摄取或者在透析过程中氧化分解、神经肽类因物质分子量较大而回收率较低，这些因素导致透析液中的这些物质的检出难度较大。
为提高这些物质的检出率，学者们提出了一些有价值的策略。
5-HT易被再摄取和单胺氧化酶氧化，当透析液内的5-HT和吲哚不能检出时，在灌流液内加入再摄取阻断剂和氧化酶抑制剂，可使它们达到可检出的水平。
但是，再摄取阻断剂能改变神经递质释放的药理学机制，使获得的结果的解释更加复杂化。
乙酰胆碱释放后易被胆碱酯酶分解，检测乙酰胆碱时灌流液中常加入胆碱酯酶抑制剂。
单胺类神经递质易被氧化，收集样品时可在收集管中预先加入抗氧化剂如抗坏血酸、高氯酸、冰醋酸等。
单胺和氨基酸递质在细胞外的水平为nmol范围，而神经肽类的细胞外水平为pmol水平。
为检测神经肽的在微透析液内的基础水平，常需在灌流液内加入肽酶抑制剂。
然而，即使加入了肽酶抑制剂，神经肽的基础水平也往往测不到。
微透析技术的非常差的时间分辨率（如样品的收集常需10-30min）妨碍对神经递质的短时脉冲式释放的检测。
但是对于神经肽来说，其释放后的清除明显较慢且大多释放后通过空间的传递发挥作用，微透析时间分辨率差的特点对神经肽的检测影响并不大。
4.4 微透析探头在脑内产生的组织和生物化学变化探头的损伤、炎症反应及随后的胶质细胞的增生，均可引起局部脑代谢和脑血流量的急剧变化。
探头植入后，其邻近区域脑组织糖代谢增强、脑血流下降，24h后才可恢复正常。
根据这一观察，开始微透析的时间应在24-48h间。
然而，实际实验中通常在探头植入后1-4h 就开始了微透析实验。
探头植入后第3天，可观察到星形胶质细胞的肥大和神经轴突的顺行和逆行退化。
在2周以后，星形胶质细胞可由结缔组织逐渐替代。
这些变化使得慢性微透析（探头植入后2-3天）成为学者们争论的问题之一。
影响慢性微透析的可能因素主要包括组织学变化引起的脑组织生化变化、探头外面的炎性细胞和结缔组织以及血脑屏障完整性的变化等。
目前的研究认为，探头植入后短期内进行微透析实验其结果可以反应脑细胞外液的变化，但慢性微透析实验的可靠性仍值得进一步研究。
5、脑和脊髓微透析的方法学5.1 脑微透析技术脑微透析是最常用的微透析技术，目前已可进行皮层、海马、脑干的某些区域、中脑导水管周围灰质、甚至某些核团的微透析。
5.1.1 动物的准备在神经麻醉学领域多采用SD大鼠200-300g。
首先在大鼠脑立体定向图谱上寻找所要研究的脑区的坐标。
将动物用5%的水合氯醛麻醉（300mg/kg）后，置于立体定向仪上，上耳棒、牙托，下垫温毯，经肛门植入温度计监测体温，自动加温仪设置温度37.4℃。
切开头皮，根据坐标位置在颅骨上钻孔，小心操作尽量不损伤硬膜。
在立体定向仪下旋转垂直臂将微透析探头导引管植入目标脑区。
用调好粘稠度的牙托粉将探头导引管固定，牙托粉变得坚硬后可稍加缝合大鼠头皮，并肌注青霉素3000U/ 天。
5.1.2 脑微透析实验操作脑内埋置透析导引管的大鼠恢复3-5天后，如伤口愈合良好、活动状态佳、无神经损害症状，并且与实验者有一定的“感情基础”后即可用于实验。
实验前应仔细准备微透析系统。
将大鼠透析导引管内芯取出后，左手握鼠，右手拇指和食指夹住探头在大鼠合作的情况下将探头植入导引管抵达目标脑区。
给大鼠围上脖夹，连接清醒系统仪器即可进行透析工作。
值得注意的是，由于探头插入对脑组织的损伤会诱发神经递质的释放，必须冲洗60-90min 后才能开始微透析液的收集工作。
一般在连续收集三个基础样品经检测物质的浓度稳定后，才可开始实验。
为防止透析液内物质的分解氧化，探头的出端管道应尽量短，收集小管应置于低温收集器或冰盒内。