腺病毒介导的MAT2B过表达促进猪肌内脂肪细胞分化

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腺病毒介导的小鼠胰岛细胞细胞周期蛋白A2基因过表达及其对细胞增殖的影响

论著基础研究һ基金项目:新疆维吾尔自治区青年科学基金(２０１５２１１Ｃ１１０)作者简介:黄婷(１９８６~)ꎬ女ꎬ硕士ꎬ主治医师ꎬ研究方向:糖尿病及甲状腺疾病ꎮ通信作者:张丽(１９７２~)ꎬ女ꎬ博士ꎬ主任医师ꎬ研究方向:内分泌疾病ꎬ电子邮箱:ｍ１８１２９２５４３２１＠１６３.ｃｏｍꎮ腺病毒介导的小鼠胰岛细胞细胞周期蛋白Ａ２基因过表达及其对细胞增殖的影响һ黄㊀婷㊀魏㊀巍㊀杨晶晶㊀张㊀丽(新疆医科大学第二附属医院内分泌科ꎬ乌鲁木齐市㊀８３００６３ꎬ电子邮箱:ｈｔ６６２３ｈｔ＠１６３.ｃｏｍ)ʌ摘要ɔ㊀目的㊀探讨腺病毒介导的小鼠胰岛细胞细胞周期蛋白Ａ２(ｃｙｃｌｉｎＡ２)基因过表达及其对细胞增殖的影响ꎮ方法㊀将对数生长期的小鼠胰岛素瘤ＭＩＮ６细胞分为实验组㊁空病毒对照组及空白对照组ꎬ实验组及空病毒对照组分别给予腺病毒介导的ｃｙｃｌｉｎＡ２基因及空腺病毒载体转染ＭＩＮ６细胞ꎬ空白对照组不给予处理ꎮ检测３组ＭＩＮ６细胞ｃｙｃｌｉｎＡ２ｍＲＮＡ及蛋白的表达情况ꎬ以及细胞增殖活性ꎮ结果㊀转染后２４ｈꎬ实验组ｃｙｃｌｉｎＡ２ｍＲＮＡ及蛋白表达水平均高于空病毒对照组及空白对照组(Ｐ<０.０５)ꎻ转染后２４ｈ㊁３６ｈ㊁４８ｈ㊁６０ｈ及７２ｈꎬ实验组的吸光度值均高于空病毒对照组及空白对照组(均Ｐ<０.０５)ꎮ结论㊀腺病毒介导的ｃｙｃｌｉｎＡ２基因成功转染ＭＩＮ６细胞ꎬ并可促进ＭＩＮ６细胞增殖ꎮʌ关键词ɔ㊀细胞周期蛋白Ａ２ꎻ腺病毒ꎻ胰岛素瘤细胞ＭＩＮ６ꎻ增殖ꎻ小鼠ʌ中图分类号ɔ㊀Ｑ７８㊀㊀ʌ文献标识码ɔ㊀Ａ㊀㊀ʌ文章编号ɔ㊀０２５３￣４３０４(２０１８)１３￣１４６１￣０５ＤＯＩ:１０.１１６７５/ｊ.ｉｓｓｎ.０２５３￣４３０４.２０１８.１３.１９ＩｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｃｙｃｌｉｎＡ２ｇｅｎｅｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｉｎｓｕｌｉｎｏｍａｃｅｌｌｓｉｎｍｉｃｅＨＵＡＮＧＴｉｎｇꎬＷＥＩＷｅｉꎬＹＡＮＧＪｉｎ￣ｊｉｎꎬＺＨＡＮＧＬｉ(ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙꎬｔｈｅＳｅｃｏｎｄＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＸｉｎｊｉａｎｇＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＵｒｕｍｑｉ８３００６３ꎬＣｈｉｎａ)ʌＡｂｓｔｒａｃｔɔ㊀Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｙｃｌｉｎＡ２ｇｅｎｅａｎｄｉｔｓｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｉｎｓｕｌｉｎｏｍａｃｅｌｌｓｉｎｍｉｃｅ.Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀ＴｈｅｉｎｓｕｌｉｎｏｍａＭＩＮ６ｃｅｌｌｓａｔｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃｇｒｏｗｔｈｐｈａｓｅｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐꎬｅｍｐｔｙｖｉｒｕｓｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐａｎｄｂｌａｎｋｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ.ＴｈｅＭＩＮ６ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｃｙｃｌｉｎＡ２ｇｅｎｅａｎｄｅｍｐｔｙａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬｉｎｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐａｎｄｅｍｐｔｙｖｉｒｕｓｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐꎬａｎｄｔｈｅｂｌａｎｋｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｗａｓｎｏｔｇｉｖｅｎａｎｙｔｒｅａｔｍｅｎｔ.ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｃｙｃｌｉｎＡ２ｍＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｏｆＭＩＮ６ｃｅｌｌｓꎬａｓｗｅｌｌａｓｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｔｈｅｔｈｒｅｅｇｒｏｕｐｓ.Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀Ａｆｔｅｒ２４ｈｏｆｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎꎬｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｃｙｃｌｉｎＡ２ｍＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐｗｅｒｅｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎｔｈｅｅｍｐｔｙｖｉｒｕｓｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐａｎｄｂｌａｎｋｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ(Ｐ<０.０５).Ａｆｔｅｒ２４ｈꎬ３６ｈꎬ４８ｈꎬ６０ｈａｎｄ７２ｈｏｆｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎꎬｔｈｅＡｖａｌｕｅｓｉｎｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐｗｅｒｅｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎｔｈｅｅｍｐｔｙｖｉｒｕｓｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐａｎｄｂｌａｎｋｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ(ａｌｌＰ<０.０５).Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀ＴｈｅＭＩＮ６ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｃｙｃｌｉｎＡ２ｇｅｎｅꎬｐｒｏｍｏｔｉｎｇｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＭＩＮ６ｃｅｌｌｓ.ʌＫｅｙｗｏｒｄｓɔ㊀ｃｙｃｌｉｎＡ２ꎬＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓꎬＩｎｓｕｌｉｎｏｍａＭＩＮ６ｃｅｌｌꎬＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎꎬＭｏｕｓｅ㊀㊀糖尿病是严重危害人类健康的内分泌代谢性疾病ꎬ其发病率和病死率在全球呈逐年增加趋势ꎬ预计到２０３５年ꎬ糖尿病患病人数将达到６亿ꎬ较２０１４年增长５５％ꎬ糖尿病及其并发症严重影响患者生活质量及预期寿命ꎬ给患者家庭及社会带来沉重负担[１]ꎮ胰岛β细胞被破坏及数目减少所导致胰岛β细胞功能下降是糖尿病发病的重要机制ꎮ胰腺移植可以实现以器官替换为基础的治疗ꎬ弥补原器官损失的β细胞ꎮ然而ꎬ供体器官的短缺和术后需要终身应用免疫抑制剂限制其在临床上的推广应用[２－３]ꎮ目前ꎬ内源性胰岛β细胞再生用于治疗糖尿病成为新的研究热点[４－１１]ꎮ本研究选择腺病毒作为载体介导细胞周期蛋白Ａ２(ｃｙｃｌｉｎＡ２)基因转染小鼠ＭＩＮ６细胞ꎬ观察ｃｙｃｌｉｎＡ２的表达情况及其对小鼠ＭＩＮ６细胞增殖的影响ꎬ以探讨ｃｙｃｌｉｎＡ２基因诱导小鼠ＭＩＮ６细胞增殖的可行性ꎬ为内源性胰岛β细胞再生提供理论参考依据ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀主要试剂与仪器１.１.１㊀主要仪器:－２０ħ低温冰箱(合肥美菱公司ꎬ１６４１广西医学㊀２０１８年７月第４０卷第１３期ＤＷ￣ＨＬ３８８型)ꎬ二氧化碳(ｃａｒｂｏｎｄｉｏｘｉｄｅꎬＣＯ２)细胞培养箱(上海力康仪器有限公司ꎬＳｍａｒｔＣｅｌｌＨＦ￣９０型)ꎬ生物安全柜(上海力康仪器有限公司ꎬＨＦ１２００ＬＣ型)ꎬ台式高速冷冻离心机(上海力康仪器有限公司ꎬＮｅｏｆｕｇｅ１５Ｒ型)ꎬ台式低速离心机(上海飞鸽仪器有限公司ꎬＴＧＬ￣１６ＧＢ型)ꎬ荧光倒置显微镜(日本尼康公司ꎬＥｃｌｉｐｓｅＴＳ１００￣Ｆ型)ꎬ凝胶成像系统(中国上海天能科技有限公司ꎬＴａｎｏｎ￣２５００型)ꎬ全光栅酶标仪(美国Ｂｉｏ￣Ｒａｄ公司ꎬＸ￣ｍａｒｋＴＭ型)ꎬＰＣＲ扩增仪(美国Ｔｈｅｒｍｏ公司ꎬＩＭＨ４００￣Ｓ型)ꎬ恒温水浴锅(上海精宏仪器厂ꎬＤＫ￣８０型)ꎬ液氮罐(成都金凤仪器厂ꎬＹＤＳ￣５０￣１２５型)ꎬ电子分析天平[(０.０１ｍｇ)德国梅特勒ꎬＡＢ３０４￣Ｓ型]ꎬ手动单道移液器(德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司ꎬＲｅｓｅａｒｃｈｐｌｕｓ型)ꎮ１.１.２㊀主要试剂:胎牛血清(批号或货号:１６００００４４㊁Ｌｏｔ＃１１８３７２３)㊁高糖杜氏改良伊格尔培养基(ＤｕｌｂｅｃｃｏᶄｓｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅｍｅｄｉｕｍꎬＤＭＥＭꎻ批号或货号:Ｃ１１９９５５９９ＢＴ㊁Ｌｏｔ＃８１１３２３８)㊁０.２５％胰酶㊁青霉素－链霉素双抗(１００００Ｕꎻ批号或货号:１５１４０￣１２２㊁Ｌｏｔ＃１７０５７０６)均购自美国Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司ꎻ磷酸缓冲盐溶液(ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅꎬＰＢＳ)粉剂购自北京中杉金桥生物有限公司(ＺＬＩ￣９０６２)ꎻ腺病毒载体－细胞周期蛋白Ａ２(ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒ￣ｃｙｃｌｉｎＡ２ꎬＡｄ￣ＣＣＮＡ２)㊁腺病毒载体－绿色荧光蛋白(ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒ￣ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎꎬＡｄ￣ＧＦＰ)均购自上海汉恒生物科技有限公司ꎻ细胞计数(ｃｅｌｌｃｏｕｎｔｉｎｇｋｉｔ￣８ꎬＣＣＫ￣８)细胞增殖－细胞毒性检测试剂盒购自上海贝博生物试剂公司(批号或货号:ＢＢ￣４２０２￣２㊁Ｌｏｔ＃ＢＢ１４０１１１)ꎮ１.２㊀实验方法１.２.１㊀细胞培养:将小鼠胰岛素瘤细胞ＭＩＮ６(购于北京博谷生物)从液氮中取出复苏后ꎬ倒置显微镜下观察细胞密度并接种到２５ｃｍ２培养瓶中ꎬ以含有１０％胎牛血清的高糖ＤＭＥＭ培养液(含１％青－链霉素双抗溶液)为培养基ꎬ置于３７ħ㊁饱和湿度㊁５％ＣＯ２的细胞培养箱中培养ꎮ细胞贴壁融合达９０％时ꎬ即可进行细胞传代培养ꎮ１.２.２㊀实验分组及腺病毒转染ＭＩＮ６细胞:取对数生长期的ＭＩＮ６细胞ꎬ以５ˑ１０５个/瓶接种至培养瓶中ꎬ放ＣＯ２培养箱中培养２４ｈ后(细胞融合达到５０％~７０％)进行如下实验:(１)将ＭＩＮ６细胞分为空白对照组(即未给予处理的ＭＩＮ６细胞组)㊁空病毒对照组(即空腺病毒载体转染ＭＩＮ６细胞的Ａｄ￣ＧＦＰ组)㊁实验组(即腺病毒介导的目的基因ｃｙｃｌｉｎＡ２转染ＭＩＮ６细胞的Ａｄ￣ＣＣＮＡ２组)ꎬ并培养于培养板中ꎮ(２)从－８０ħ冰箱取出腺病毒并在冰上缓慢融化备用ꎮ(３)吸去细胞原有培养基ꎬ加入１/２体积的新鲜培养基ꎮ经过多次实验我们发现病毒滴度(ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｎꎬＭＯＩ)值＝３００时ꎬ目的基因能高效稳定地转染ＭＩＮ６细胞(不同ＭＯＩ腺病毒感染ＭＩＮ６细胞的荧光见图１)ꎬ因此根据该ＭＯＩ值换算对应的病毒原液体积ꎬ并按体积及分组将病毒原液加入相应孔中ꎬ摇匀ꎬ放于培养箱中继续培养２ｈꎬ换为新鲜培养基培养２４ｈ后在荧光显微镜下观察并拍照ꎮ每组重复３次ꎮ１.２.３㊀ＭＩＮ６细胞ｃｙｃｌｉｎＡ２ｍＲＮＡ表达水平的检测:腺病感染后的ＭＩＮ６细胞培养２４ｈ后ꎬ收集细胞提取总ＲＮＡꎮ取１μｌ总ＲＮＡ样品稀释６０倍ꎬ用紫外分光光度仪测总ＲＮＡ的浓度和纯度ꎬ通过琼脂糖凝胶电泳ꎬ用凝胶成像系统观察ＲＮＡ条带检测ＲＮＡ的完整性ꎮ根据反转录试剂盒(南京生兴生物技术有限公司ꎬ批号:Ａ１２８０ꎬＡ１２５０)操作步骤将ＲＮＡ反转录为ｃＤＮＡꎬ根据以下体系配制ＰＣＲ反应液:Ｎａｃｌｅａｓｅ￣ｆｒｅｅｗａｔｅｒ１３μｌꎻ５ˑＲＴ缓冲液４μｌꎻＲＴＥｎｚｙｍｅＭｉｘｔｕｒｅ１μｌꎻＰｒｉｍｅｒＭｉｘｔｕｒｅ１μｌꎻｃＤＮＡ１μｌꎬ在ＰＣＲ扩增仪上完成荧光实时定量ＰＣＲ反应ꎬ反应条件为:９５ħ１ｍｉｎ预变性ꎬ９５ħ１５ｓꎬ５８ħ２０ｓꎬ７２ħ３２ｓꎬ共４３个循环ꎮ在８０ħ读板１次ꎬ然后以０.１７ħ/ｓ的速度从６５ħ到９５ħꎬ每隔２ｓ记录１次荧光值ꎬ获得熔解曲线ꎮＣｙｃｌｉｎＡ２引物为:５ᶄ￣ＴＧＴＧＧＡＣＣＴＴＣＡＣ￣ＣＡＧＡＣＣＴ￣３ᶄꎬ５ᶄ￣ＡＡＡＧＣＣＧＧＣＡＧＴＣＴＴＴＣＡＣＴ￣３ᶄꎮ以甘油醛￣３￣磷酸脱氢酶(ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ￣３￣ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅꎬＧＡＰＤＨ)为内参ꎮ采用相对定量公式２－әәＣｔ１００％ꎬ计算ｃｙｃｌｉｎＡ２ｍＲＮＡ相对表达量ꎬәＣｔ＝Ｃｔ(目的基因)－Ｃｔ(ＧＡＰＤＨ)ꎮ图１㊀不同ＭＯＩ腺病毒感染ＭＩＮ６细胞的荧光图片２６４１ＧｕａｎｇｘｉＭｅｄｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌꎬＪｕｌ.２０１８ꎬＶｏｌ.４０ꎬＮｏ.１３续图１㊀不同ＭＯＩ腺病毒感染ＭＩＮ６细胞的荧光图片１.２.４㊀ＭＩＮ６细胞ｃｙｃｌｉｎＡ２蛋白表达水平的检测:腺病毒感染后的ＭＩＮ６细胞培养２４ｈ后ꎬ每组收集５ˑ１０６个细胞ꎬＰＢＳ洗涤２次ꎬ弃上清液ꎮ采用放射免疫沉淀实验蛋白裂解液(北京索莱宝科技有限公司ꎬ批号:Ｒ００２０￣１００)裂解细胞ꎬ收集上清ꎬ采用二喹啉甲酸蛋白浓度检测试剂盒检测蛋白浓度ꎬ每组取６０μｇ蛋白ꎬ经１０％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳后转至聚偏氟乙烯膜ꎬ用３％牛血清白蛋白室温封闭１ｈꎬ一抗(１ʒ１０００)４ħ孵育过夜ꎬ以β￣肌动蛋白(β￣ａｃｔｉｎ)作为内参照ꎬ含ｔｗｅｅｎ￣２０的磷酸缓冲液洗膜３次ꎬ每次５ｍｉｎꎬ加入１ʒ２０００稀释的山羊抗小鼠抗体(ＩｇＧ￣辣根过氧化物酶)ꎬ３７ħ孵育１ｈꎬＰＢＳ￣Ｔ洗膜３次ꎬ每次５ｍｉｎꎮ加入增强化学发光法试剂孵育２~５ｍｉｎ后在增强化学发光仪中采集图像ꎬ分析蛋白表达量ꎮ１.２.５㊀ＭＩＮ６细胞增殖活性的检测:取对数生长期的ＭＩＮ６细胞ꎬ以５ˑ１０３个/孔密度接种至９６孔板ꎬ按１.２.２的方法进行分组及转染ꎬ将细胞放于培养箱中培养２ｈ后ꎬ换用新鲜培养基分别培养６ｈ㊁１２ｈ㊁２４ｈ㊁３６ｈ㊁４８ｈ㊁６０ｈ㊁７２ｈ后吸弃原有培养基ꎬ每孔加入１００μｌ配置好的１０％ＣＣＫ￣８溶液ꎬ置于３７ħ培养箱中孵育２ｈ后于酶标仪４５０ｎｍ波长处检测Ａ值ꎮ每组设５个复孔ꎮ１.３㊀统计学分析㊀采用ＳＰＳＳ１９.０软件进行统计学分析ꎮ计量资料以(ｘʃｓ)表示ꎬ多组间比较采用单因素方差分析ꎬ方差齐时两两比较采用ＬＳＤ￣ｔ检验ꎬ方差不齐采用ＴａｍｈａｎｅᶄｓＴ２检验ꎮ以Ｐ<０.０５为差异具有统计学意义ꎮ２㊀结㊀果２.１㊀３组ＭＩＮ６细胞ｃｙｃｌｉｎＡ２ｍＲＮＡ表达水平比较㊀空白对照组㊁空病毒对照组㊁实验组的ｃｙｃｌｉｎＡ２ｍＲＮＡ相对表达量分别为１.００９ʃ０.１６４㊁１.１２６ʃ０.１２５㊁２.５４６ʃ０.４８３ꎬ３组比较差异具有统计学意义(Ｆ＝２３.９１４ꎬＰ＝０.００１)ꎬ且实验组ｃｙｃｌｉｎＡ２ｍＲＮＡ表达量高于空病毒对照组及空白对照组(均Ｐ<０.０５)ꎬ空病毒对照组及空白对照组比较差异无统计学意义(Ｐ>０.０５)ꎮ２.２㊀３组ＭＩＮ６细胞ｃｙｃｌｉｎＡ２蛋白相对表达水平比较㊀空白对照组㊁空病毒对照组㊁实验组ｃｙｃｌｉｎＡ２蛋白表达量分别为０.９０３ʃ０.０７６㊁０.９５７ʃ０.０９３㊁１.９７６ʃ０.０７３ꎬ３组比较差异具有统计学意义(Ｆ＝１６５.３５８ꎬＰ<０.００１)ꎬ且实验组ｃｙｃｌｉｎＡ２蛋白表达量高于空病毒对照组及空白对照组(均Ｐ<０.０５)ꎬ空病毒对照组及空白对照组比较差异无统计学意义(Ｐ>０.０５)ꎮ见图２ꎮ图２㊀３组ＭＩＮ６细胞ｃｙｃｌｉｎＡ２蛋白相对表达情况㊀㊀注:从左至右样本编号为:空白对照组￣１㊁空白对照组￣２㊁空白对照组￣３㊁空病毒对照组￣１㊁空病毒对照组￣２㊁空病毒对照组￣３㊁实验组￣１㊁实验组￣２㊁实验组￣３ꎮ２.３㊀不同时间段３组ＭＩＮ６细胞增殖活性比较㊀腺病毒转染后２４ｈ㊁３６ｈ㊁４８ｈ㊁６０ｈ及７２ｈꎬ３组ＭＩＮ６细胞的Ａ值比较差异具有统计学意义(均Ｐ<０.０５)ꎬ其中实验组各时段的Ａ值均高于空病毒对照组及空白对照组(Ｐ<０.０５)ꎮ见表１ꎮ表１㊀不同时间段３组ＭＩＮ６细胞增殖活性比较(ｘʃｓ)组别ｎ６ｈ１２ｈ２４ｈ３６ｈ４８ｈ６０ｈ７２ｈ实验组３５０.３６３ʃ０.０３６０.４８１ʃ０.０２５０.６０８ʃ０.０６４һҖ１.１５８ʃ０.０５５һҖ１.２２８ʃ０.０１６һҖ１.２８２ʃ０.０７４һҖ１.３９０ʃ０.０２２һҖ空病毒对照组３５０.３６２ʃ０.０２４０.４６１ʃ０.０２９０.５００ʃ０.０５７１.０２４ʃ０.０１９１.０４８ʃ０.０１１һ１.１４５ʃ０.０３２һ１.２２６ʃ０.０２６空白对照组３５０.３６４ʃ０.０５３０.４６５ʃ０.０２７０.４７４ʃ０.０４５０.９７０ʃ０.０６４１.０１７ʃ０.０３０１.０３６ʃ０.０５１１.１２１ʃ０.０６６㊀㊀㊀㊀㊀㊀Ｆ值０.００２０.７３４８.０６６１８.７７０１４８.２８９２５.０２０５０.４６３Ｐ值０.９９８０.５０１０.００６<０.００１<０.００１<０.００１<０.００１㊀㊀注:与空白对照组比较ꎬһＰ<０.０５ꎻ与空病毒对照组比较ꎬҖＰ<０.０５ꎮ３６４１广西医学㊀２０１８年７月第４０卷第１３期３㊀讨㊀论在胎儿期ꎬ胰腺导管上皮细胞分化成新的β细胞ꎬ这一过程被称为胰岛β细胞新生ꎮ出生后ꎬ新的胰岛β细胞主要是通过细胞复制产生[１０]ꎮ但有学者研究发现ꎬ一些特殊情况下也存在胰岛β细胞新生现象ꎬ如在链脲佐菌素诱导的胰腺损伤㊁部分胰腺切除㊁胰腺导管结扎㊁赛璐玢包裹胰头以及高糖诱导的胰岛素抵抗成年动物模型中均证实了这一现象[１１－１２]ꎮ胰岛β细胞的这种增殖再生能力成为胰岛β细胞的修复储备 ꎬ为胰岛β细胞替代治疗提供了新的思路ꎮ通过调节与胰岛β细胞增殖发育有关的细胞周期调控分子的表达ꎬ使受损的胰岛β细胞被有功能的新增殖胰岛细胞所代偿ꎬ从而达到修复胰岛β细胞功能的目的[１２]ꎬ这就是内源性胰岛β细胞再生策略ꎮＣｙｃｌｉｎＡ２是细胞周期蛋白Ａ家族成员之一ꎬ在细胞周期调控中扮演着非常重要的作用ꎮＣｙｃｌｉｎＡ２在整个细胞周期过程中均表达[１３]ꎬ其在细胞周期多个环节中均发挥着至关重要的调控作用[１４－１５]ꎬ既是有丝分裂前期ＤＮＡ复制所必需的ꎬ也是Ｇ１/Ｓ期和Ｇ２/Ｍ期顺利完成过渡所不可或缺的[１６－１７]ꎮ胰岛β细胞为可再生细胞ꎬ这为受损胰岛β细胞内源性自身修复提供了先决条件ꎮ而细胞的再生离不开细胞周期中ＤＮＡ合成及有丝分裂两个阶段ꎮ细胞周期依次经历Ｇ１期㊁Ｓ期㊁Ｇ２期㊁Ｍ期ꎬ其中Ｇ１/Ｓ和Ｇ２/Ｍ调控点决定细胞复制或凋亡ꎮＣｙｃｌｉｎＡ２在Ｇ１期出现ꎬ与周期蛋白依赖性激酶２结合ꎬ并使其磷酸化参与细胞ＤＮＡ合成与复制ꎬ促进细胞进入有丝分裂[１８]ꎮ研究显示ꎬ在Ｇ１末期使用微量抗ｃｙｃｌｉｎＡ２抗体注入细胞后ꎬＤＮＡ合成加速ꎬ且细胞进入Ｓ期的过程延缓ꎬ提示ｃｙｃｌｉｎＡ２是细胞进入Ｓ期的正性调节因子[１５]ꎮ在增殖状态的细胞中ꎬｃｙｃｌｉｎＡ２的表达增加ꎮ阻断ｃｙｃｌｉｎＡ２基因表达ꎬ能选择性地将细胞有丝分裂限制在细胞周期任何一个转换点上[１５]ꎮ因此ｃｙｃｌｉｎＡ２在细胞有丝分裂中起着举足轻重的作用ꎮ本研究将带有绿色荧光标记的外源性ｃｙｃｌｉｎＡ２基因通过腺病毒导入小鼠ＭＩＮ６细胞中ꎬ观察ｃｙｃｌｉｎＡ２基因表达及ＭＩＮ６细胞的活性情况ꎬ从而分析增加外源性ｃｙｃｌｉｎＡ２基因是否可以促进小鼠ＭＩＮ６细胞的增殖ꎬ以探讨如何提高胰岛β细胞的修复效率ꎮ结果显示实验组ｃｙｃｌｉｎＡ２ｍＲＮＡ及蛋白表达量高于空病毒对照组及空白对照组(Ｐ<０.０５)ꎮ提示目的基因已被成功转染入靶细胞中ꎬ且ｃｙｃｌｉｎＡ２ｍＲＮＡ及蛋白能稳定高效表达ꎮ而空病毒对照组及空白对照组比较差异无统计学意义(Ｐ>０.０５)ꎬ提示腺病毒对ｃｙｃｌｉｎＡ２基因的转染及表达无明显影响ꎮ本研究结果还显示ꎬ转染后２０~２７ｈꎬ实验组ＭＩＮ６细胞的Ａ值较空病毒对照组及空白对照组升高ꎬ而空病毒对照组及空白对照组比较(除４８ｈ及６０ｈ外ꎬ考虑与样本量较小有关)差异无统计学意义(Ｐ>０.０５)ꎬ提示外源性增加ｃｙｃｌｉｎＡ２基因可提高ＭＩＮ６细胞增殖活性ꎬ这可能是由于其成功表达为ｃｙｃｌｉｎＡ２蛋白ꎬ并能加速细胞周期而腺病毒对ＭＩＮ６细胞增殖活性无明显影响ꎮＰａｇａｎｏ等[１５]研究结果显示ꎬ将ｃｙｃｌｉｎＡ２抗体注入靶细胞后可使细胞周期停滞ꎬ当再次注入ｃｙｃｌｉｎＡ２时ꎬ细胞继续进行有丝分裂过程ꎮＷｏｏ等[１８]研究发现ꎬ经艾塞那肽处理的糖尿病小鼠的胰岛β细胞增殖增多且ｃｙｃｌｉｎＡ２蛋白水平明显增高ꎮ这提示ｃｙｃｌｉｎＡ２表达升高可能直接加速胰岛细胞β细胞增殖ꎬ但ｃｙｃｌｉｎＡ２基因使胰岛β细胞的活性增强的内在机制尚需进一步研究ꎮ综上所述ꎬ外源性ｃｙｃｌｉｎＡ２基因可使小鼠ＭＩＮ６细胞持续稳定表达ｃｙｃｌｉｎＡ２ｍＲＮＡ及蛋白ꎬ并能促进ＭＩＮ６细胞增殖ꎮ参㊀考㊀文㊀献[１]㊀ＡｇｕｉｒｅｅＦꎬＢｒｏｗｎＡꎬＣｈｏＮＨꎬｅｔａｌ.ＩＤＦＤｉａｂｅｔｅｓＡｔｌａｓ[Ｍ].６ｔｈｅｄ.Ｂａｓｅｌ:ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＤｉａｂｅｔｅｓＦｅｄｅｒａｔｉｏｎꎬ２０１３:１－１５５.[２]㊀ＳｍｕｋｌｅｒＳＲꎬＡｒｎｔｆｉｅｌｄＭＥꎬＲａｚａｖｉＲꎬｅｔａｌ.Ｔｈｅａｄｕｌｔｍｏｕｓｅａｎｄｈｕｍａｎｐａｎｃｒｅａｓｃｏｎｔａｉｎｒａｒｅｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｔｈａｔｅｘｐｒｅｓｓｉｎｓｕｌｉｎ[Ｊ].ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌꎬ２０１１ꎬ８(３):２８１－２９３. [３]㊀ＺｈｏｕＱꎬＢｒｏｗｎＪꎬＫａｎａｒｅｋＡꎬｅｔａｌ.Ｉｎｖｉｖｏｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇｏｆａｄｕｌｔｐａｎｃｒｅａｔｉｃｅｘｏｃｒｉｎｅｃｅｌｌｓｔｏｂｅｔａ￣ｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ｎａｔｕｒｅꎬ２００８ꎬ４５５(７２１３):６２７－６３２.[４]㊀ＳｏｒｉａＢꎬＲｏｃｈｅＥꎬＢｅｒｎáＧꎬｅｔａｌ.Ｉｎｓｕｌｉｎ￣ｓｅｃｒｅｔｉｎｇｃｅｌｌｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓｎｏｒｍａｌｉｚｅｇｌｙｃｅｍｉａｉｎｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ￣ｉｎｄｕｃｅｄｄｉａｂｅｔｉｃｍｉｃｅ[Ｊ].Ｄｉａｂｅｔｅｓꎬ２０００ꎬ４９(２):１５７－１６２. [５]㊀ＩｋｅｄａＹꎬＫｕｄｖａＹＣ.Ｈｕｍａｎｆｅｔａｌｐａｎｃｒｅａｔｉｃｉｓｌｅｔ￣ｌｉｋｅｓｔｒｕｃ￣ｔｕｒｅｓａｓｓｏｕｒｃｅｍａｔｅｒｉａｌｔｏｔｒｅａｔｔｙｐｅ１ｄｉａｂｅｔｅｓ[Ｊ].ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｓＴｈｅｒꎬ２０１３ꎬ４(６):１５９.[６]㊀ＤａｖｅＳＤꎬＶａｎｉｋａｒＡＶꎬＴｒｉｖｅｄｉＨＬꎬｅｔａｌ.Ｎｏｖｅｌｔｈｅｒａｐｙｆｏｒｉｎｓｕｌｉｎ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｄｉａｂｅｔｅｓｍｅｌｌｉｔｕｓ:ｉｎｆｕｓｉｏｎｏｆｉｎｖｉｔｒｏ￣ｇｅｎｅｒａｔｅｄｉｎｓｕｌｉｎ￣ｓｅｃｒｅｔｉｎｇｃｅｌｌｓ[Ｊ].ＣｌｉｎＥｘｐＭｅｄꎬ２０１５ꎬ１５(１):４１－４５.[７]㊀ＮａｍＪＳꎬＫａｎｇＨＭꎬＫｉｍＪꎬｅｔａｌ.Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｏｆｉｎｓｕｌｉｎ￣ｓｅｃｒｅｔｉｎｇｃｅｌｌｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄｆｒｏｍｈｕｍａｎａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅ￣ｄｅ￣ｒｉｖｅｄｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｔｏｔｙｐｅ２ｄｉａｂｅｔｅｓｍｉｃｅ[Ｊ].ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎꎬ２０１４ꎬ４４３(２):７７５－７８１. [８]㊀Ｈａｕｇｅ￣ＥｖａｎｓＡＣꎬＳｑｕｉｒｅｓＰＥꎬＰｅｒｓａｕｄＳＪꎬｅｔａｌ.Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｂｅｔａ￣ｃｅｌｌ￣ｔｏ￣ｂｅｔａ￣ｃｅｌｌｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓａｒｅｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｒｅｓｐｏｎｓｅｓｔｏｎｕｔｒｉｅｎｔｓｔｉｍｕｌｉ:ｅｎｈａｎｃｅｄＣａ２＋ａｎｄｉｎｓｕｌｉｎｓｅｃｒｅｔｏｒｙｒｅｓｐｏｎｓｅｓｏｆＭＩＮ６ｐｓｅｕｄｏｉｓｌｅｔｓ[Ｊ].Ｄｉａｂｅｔｅｓꎬ１９９９ꎬ４８(７):１４０２－１４０８.(下转第１４９２页)厚度和黄斑视网膜体积ꎻ治疗后观察组黄斑水肿改善情况优于对照组㊁黄斑中心凹厚度和黄斑视网膜体积与对照组比较均降低(均Ｐ<０.０５)ꎬ提示芪明颗粒与丹红注射液配合西医常规治疗ＮＰＤＲ患者的临床效果优于单纯的西医常规治疗ꎬ可能与芪明颗粒联合丹红注射液可改善微循环㊁扩张血管㊁保护血管内皮㊁改善胰岛素抵抗等相关ꎮ治疗后两组患者中医证候积分与治疗前比较均降低ꎬ且观察组低于对照组(Ｐ<０.０５)ꎬ提示芪明颗粒与丹红注射液配合西医常规治疗ＮＰＤＲ能够降低中医证候积分ꎬ改善患者气阴两虚兼血瘀证症状ꎮ综上所述ꎬ在西医常规治疗的基础上加用芪明颗粒联合丹红注射液治疗气阴两虚兼血瘀型ＮＰＤＲ患者具有确切疗效ꎬ能够降低中医证候积分ꎬ减轻黄斑水肿ꎬ改善眼底循环障碍ꎬ延缓ＮＰＤＲ患者病情进展ꎮ参㊀考㊀文㊀献[１]㊀ＸｕＹꎬＷａｎｇＬꎬＨｅＪꎬｅｔａｌ.ＰｒｅｖａｌｅｎｃｅａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｏｆｄｉａｂｅｔｅｓｉｎＣｈｉｎｅｓｅａｄｕｌｔｓ[Ｊ].ＪＡＭＡꎬ２０１３ꎬ３１０(９):９４８－９５９.[２]ＡｎｔｏｎｅｔｔｉＤＡꎬＫｌｅｉｎＲꎬＧａｒｄｎｅｒＴＷ.Ｄｉａｂｅｔｉｃｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ[Ｊ].ＮＥｎｇｌＪＭｅｄꎬ２０１２ꎬ３６６(１３):１２２７－１２３９.[３]殷玲利ꎬ彭辉灿.糖尿病视网膜病变的治疗进展[Ｊ].现代医药卫生ꎬ２０１７ꎬ３３(１):８０－８３.[４]㊀相萍萍ꎬ王㊀旭.中医药治疗糖尿病视网膜病变研究进展[Ｊ].中华中医药杂志ꎬ２０１４ꎬ２９(３):８１３－８１５.[５]㊀中华医学会糖尿病学分会.中国２型糖尿病防治指南(２０１０年版)[Ｊ].中国糖尿病杂志ꎬ２０１２ꎬ２０(１):５４－１０９.[６]㊀杨义生.糖尿病性视网膜病变[Ｊ].中华医学信息导报ꎬ２００４ꎬ１９(１１):２０－２０.[７]㊀郑筱萸.中药新药临床研究指导原则[Ｍ].北京:中国医药科技出版社ꎬ２００２:３１２－３１６.[８]㊀段俊国.中西医结合眼科学[Ｍ].北京:中国中医药出版社ꎬ２００５:２６３－２６４.[９]㊀中华中医药学会.糖尿病视网膜病变中医防治指南[Ｊ].中国中医药现代远程教育ꎬ２０１１ꎬ９(４):１５４－１５５.[１０]姚㊀毅ꎬ赵军平ꎬ马志中ꎬ等.糖尿病眼底病防治指南[Ｊ].继续医学教育ꎬ２００５ꎬ１９(１１):３３－４３.[１１]陈艳蕾ꎬ王学昌ꎬ郑晓丽.中西医结合治疗糖尿病视网膜病变４０例疗效观察[Ｊ].河北中医ꎬ２００６ꎬ２８(１):６０.[１２]焦伟炜ꎬ刘学政.黄芪甲苷对糖尿病大鼠视网膜Ｍüｌｌｅｒ细胞的影响[Ｊ].解剖科学进展ꎬ２０１５ꎬ２１(５):５１２－５１４.[１３]陈㊀放ꎬ刘开扬ꎬ徐㊀珊ꎬ等.葛根素对ＳＴＺ诱导的糖尿病大鼠视网膜的保护作用及机制研究[Ｊ].中国药理学通报ꎬ２０１１ꎬ２７(９):１２７９－１２８４.[１４]刘金虹.丹红注射液的临床应用进展[Ｊ].中国药房ꎬ２０１４ꎬ２５(２３):２１８９－２１９１.(收稿日期:２０１８－０２－２６㊀修回日期:２０１８－０５－１１)㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀(上接第１４６４页)[９]ＬöｓｅｒＰꎬＳｃｈｉｒｍＪꎬＧｕｈｒＡꎬｅｔａｌ.Ｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｌｉｎｅｓａｎｄｔｈｅｉｒｕｓｅｉｎｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｒｅｓｅａｒｃｈ[Ｊ].ＳｔｅｍＣｅｌｌｓꎬ２０１０ꎬ２８(２):２４０－２４６.[１０]ＫｉｍＫＡꎬＬｅｅＭＳ.Ｒｅｃｅｎｔｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｂｅｔａ￣ｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓｂｙｃｙｔｏｋｉｎｅｓ[Ｊ].ＦｒｏｎｔＢｉｏｓｃｉ(ＬａｎｄｍａｒｋＥｄ)ꎬ２００９ꎬ１４:６５７－６６４.[１１]ＬｅｅＣＳꎬＤｅＬｅóｎＤＤꎬＫａｅｓｔｎｅｒＫＨꎬｅｔａｌ.Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｐａｎｃｒｅａｔｉｃｉｓｌｅｔｓａｆｔｅｒｐａｒｔｉａｌｐａｎｃｒｅａｔｅｃｔｏｍｙｉｎｍｉｃｅｄｏｅｓｎｏｔｉｎｖｏｌｖｅｔｈｅｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ￣３[Ｊ].Ｄｉａｂｅｔｅｓꎬ２００６ꎬ５５(２):２６９－２７２.[１２]ＤｅｌＺｏｔｔｏＨꎬＭａｓｓａＬꎬＲａｆａｅｌｏｆｆＲꎬｅｔａｌ.Ｐｏｓｓｉｂｌｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｃｈａｎｇｅｓｉｎｉｓｌｅｔｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｉｓｌｅｔｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ￣ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｅｌｌｍａｓｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｓｕｃｒｏｓｅａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｔｏｎｏｒｍａｌｈａｍｓｔｅｒｓ[Ｊ].ＪＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌꎬ２０００ꎬ１６５(３):７２５－７３３.[１３]ＨｏｗｅＪＡꎬＨｏｗｅｌｌＭꎬＨｕｎｔＴꎬｅｔａｌ.Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｄｅｖｅｌ￣ｏｐｍｅｎｔａｌｔｉｍｅｒｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｔｈｅｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｅｍｂｒｙｏｎｉｃｃｙｃｌｉｎＡａｎｄａｎｅｗｓｏｍａｔｉｃＡ￣ｔｙｐｅｃｙｃｌｉｎａｔｇａｓｔｒｕｌａｔｉｏｎ[Ｊ].ＧｅｎｅｓＤｅｖꎬ１９９５ꎬ９(１０):１１６４－１１７６.[１４]ＧｏｎｇＤꎬＦｅｒｒｅｌｌＪＥＪｒ.ＴｈｅｒｏｌｅｓｏｆｃｙｃｌｉｎＡ２ꎬＢ１ꎬａｎｄＢ２ｉｎｅａｒｌｙａｎｄｌａｔｅｍｉｔｏｔｉｃｅｖｅｎｔｓ[Ｊ].ＭｏｌＢｉｏｌＣｅｌｌꎬ２０１０ꎬ２１(１８):３１４９－３１６１.[１５]ＰａｇａｎｏＭꎬＰｅｐｐｅｒｋｏｋＲꎬＶｅｒｄｅＦꎬｅｔａｌ.ＣｙｃｌｉｎＡｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄａｔｔｗｏｐｏｉｎｔｓｉｎｔｈｅｈｕｍａｎｃｅｌｌｃｙｃｌｅ[Ｊ].ＥＭＢＯＪꎬ１９９２ꎬ１１(３):９６１－９７１.[１６]ＪｉａｎｇＬꎬＬｉｕＴꎬＳｏｎｇＫ.Ｇｒｏｗｔｈｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｈｕｍａｎａｄｉ￣ｐｏｓｅ￣ｄｅｒｉｖｅｄｓｔｅｍｃｅｌｌｓｄｕｒｉｎｇｌｏｎｇｔｉｍｅｃｕｌｔｕｒｅｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙｃｙｃｌｉｎａａｎｄｃｙｃｌｉｎＤ１[Ｊ].ＡｐｐｌＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌꎬ２０１２ꎬ１６８(８):２２３０－２２４４.[１７]ＨｏｎｄａＡꎬＶａｌｏｇｎｅＹꎬＢｏｕＮａｄｅｒＭꎬｅｔａｌ.Ａｎｉｎｔｒｏｎ￣ｒｅｔａｉｎｉｎｇｓｐｌｉｃｅｖａｒｉａｎｔｏｆｈｕｍａｎｃｙｃｌｉｎＡ２ꎬｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎａｄｕｌｔｄｉｆｆｅｒ￣ｅｎｔｉａｔｅｄｔｉｓｓｕｅｓꎬｉｎｄｕｃｅｓａＧ１/Ｓｃｅｌｌｃｙｃｌｅａｒｒｅｓｔｉｎｖｉｔｒｏ[Ｊ].ＰＬｏＳＯｎｅꎬ２０１２ꎬ７(６):ｅ３９２４９.[１８]ＷｏｏＹＪꎬＰａｎｌｉｌｉｏＣＭꎬＣｈｅｎｇＲＫꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆｃｙｃｌｉｎＡ２ｉｎｄｕｃｅｓｍｙｏｃａｒｄｉａｌｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎａｎｄｅｎｈａｎｃｅｓｃａｒｄｉａｃｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｉｓｃｈｅｍｉｃｈｅａｒｔｆａｉｌｕｒｅ[Ｊ].Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎꎬ２００６ꎬ１１４(１Ｓｕｐｐｌ):Ｉ２０６－Ｉ２１３.(收稿日期:２０１８－０２－２８㊀修回日期:２０１８－０５－２５)。

METRNL的生物学功能及病理生理意义综述

METRNL的生物学功能及病理生理意义综述摘要：神经胶质细胞分化调节因子样因子(Meteorin-like, METRNL) 在骨骼肌中大量表达, 是新发现的肌肉因子。

研究发现运动和温度变化等生理性因素参与了METRNL表达的调节。

在脂肪组织, METRNL激活M2型巨噬细胞, 诱导脂肪组织产热增加, 促进能量消耗;此外还在骨生成、脂肪细胞分化和增殖、免疫应答等过程中发挥重要的生物学作用。

METRNL 表达在肥胖, II型糖尿病以及皮肤病等疾病的发生、发展中明显改变, 参与其病理生理调节。

本文将着重对其生物学功能及病理生理意义进行综述。

关键词：肌肉因子; Meteorin-like; 巨噬细胞替代激活;众所周知，骨骼肌是人体最大的内分泌器官，合成和分泌多种肌肉因子，广泛的参与机体的多种生理和病理生理过程。

神经胶质细胞分化调节因子样因子(Meteorin-like, METRNL) 是新发现的肌肉因子，研究表明其具有丰富的生物学功能。

Meteorin是2004年Nishino等人在全反式维甲酸(retinoic acid, RA) 孵育的小鼠胚胎细胞p19中发现一个新的、可分泌的神经生长因子。

Meteorin来源于英文单词流星"meteor";，因为这种物质可以使神经胶质细胞像流星一样延伸出长长的突触"尾巴";，因此得名。

它在神经胶质细胞分化和诱导轴突延长中有重要作用。

由于METRNL与Meteorin在蛋白序列有4 0%的同源性，因而被命名为Meteorin样因子。

早在2007年，北京协和医院宫伟雁在其博士毕业论文对METRNL首次进行了报道。

但直到2014年，哈佛医学院Spiegelman实验室在《Cell》上报道运动诱导骨骼肌合成和分泌METRNL，并发现其在抑制脂肪组织炎症、促进脂肪褐色化中发挥重要作用，METRNL才真正引起人们的广泛关注，大量研究发现METRNL在骨和脂肪组织增殖、分化，外皮黏膜组织炎症及代谢调节中都有着重要的作用。

提高腺病毒对猪皮肤组织转染效率的研究的开题报告

提高腺病毒对猪皮肤组织转染效率的研究的开题报告
标题：提高腺病毒对猪皮肤组织转染效率的研究
背景：
转基因技术已经广泛应用于动植物基因工程和生物医药领域中。

其中，基于腺病毒的基因递送系统是一种有效的转基因途径，可用于基因治疗、基因沉默和基因表达研究。

然而，腺病毒在动物体内的递送效率受到宿主细胞类型、体液和抗体的影响。

猪皮肤是猪体表的一个重要组织，猪皮肤基因转染是猪皮肤生物学研究和医学皮肤疾病治疗的重要手段。

因此，提高腺病毒对猪皮肤的转染效率非常重要。

研究目的：
本研究旨在提高腺病毒对猪皮肤组织的转染效率，为猪皮肤生物学研究和医学皮肤疾病治疗提供新的转基因技术手段。

研究内容：
1. 猪皮肤细胞株的建立：从健康的猪皮肤组织中分离细胞，培养和鉴定细胞类型和纯度。

2. 构建不同载体的腺病毒载体：选用常用的重组腺病毒载体进行修饰，构建表达目的基因的腺病毒载体。

3. 优化转染条件：根据不同载体的特点和转染条件，选择最适宜的转染条件，如细胞的密度、腺病毒载体的浓度、共转染试剂的配比等。

4. 评价转染效率：采用荧光蛋白标记的方法或PCR检测从猪皮肤细胞中检测目的基因的表达情况，并计算转染效率并进行比较。

意义和价值：
本研究将提高腺病毒对猪皮肤组织的转染效率，为和研究和医学皮肤疾病治疗提供了新的转基因技术手段。

猪皮肤细胞株的建立，还可以为猪皮肤细胞研究提供宝贵的实验材料和数据。

同时，本研究可以推动腺病毒递送系统的研究进展。

表达猪白介素2基因重组腺病毒的构建及其免疫增强作用

表达猪白介素2基因重组腺病毒的构建及其免疫增强作用何雷;张彦明;向华;唐青海;徐彦召;杨小云;王静;代晨【期刊名称】《西北农业学报》【年(卷),期】2010(019)011【摘要】以猪白介素2基因(pIL-2)为研究对象构建表达pIL-2的重组腺病毒,并研究其作为细胞因子佐剂的免疫增强作用.用RT-PCR的方法扩增pIL-2基因,将pIL-2基因克隆到腺病毒穿梭载体AdTrack中,构建出重组腺病毒穿梭质粒AdTrack-pIL-2,然后在大肠杆菌BJ5183内和骨架载体AdEasy同源重组,获得重组腺病毒骨架载体AdEasy-pIL-2,转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒Ad-pIL-2,并通过兔体交互试验来检测Ad-pIL-2的免疫增强作用.经PCR、RT-PCR和Western blot 检测,成功构建了Ad-pIL-2,病毒滴度可以达到108.25pfu/mL,并通过兔体交互免疫试验证明Ad-pIL-2可以提高兔的抗体水平.用腺病毒构建的Ad-pIL-2在兔体上具有免疫增强作用,为下一步的猪体试验研究和细胞因子佐剂的开发奠定基础.【总页数】7页(P1-7)【作者】何雷;张彦明;向华;唐青海;徐彦召;杨小云;王静;代晨【作者单位】西北农林科技大学,动物医学院,陕西杨凌,712100;西北农林科技大学,动物医学院,陕西杨凌,712100;西北农林科技大学,动物医学院,陕西杨凌,712100;西北农林科技大学,动物医学院,陕西杨凌,712100;西北农林科技大学,动物医学院,陕西杨凌,712100;西北农林科技大学,动物医学院,陕西杨凌,712100;西北农林科技大学,动物医学院,陕西杨凌,712100;西北农林科技大学,动物医学院,陕西杨凌,712100【正文语种】中文【中图分类】S852.65+1【相关文献】1.猪Ⅱ型圆环病毒ORF2与猪GM-CSF基因重组腺病毒共表达及免疫效果分析 [J], 陈降华;刘忠华;李文平2.猪圆环病毒2型ORF2/猪白介素2(POIL-2)嵌合基因真核表达载体的构建、表达及在小鼠体内的免疫效果 [J], 贾松涛;闫若潜;崔保安;吴志明;张志凌;张健;赵雪丽3.表达猪圆环病毒2型ORF2和猪IFN-γ基因重组腺病毒的免疫保护作用 [J], 裴党帅;郑念广;唐明森;夏芳;陈瑞爱;罗满林4.表达H5N1亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒的构建及其免疫原性 [J], 吴运谱;乔传玲;杨焕良;陈艳;展小过;辛晓光;陈化兰5.猪圆环病毒2型ORF2和猪γ干扰素基因重组腺病毒的构建及其免疫原性研究[J],因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和M基因重组腺病毒的构建及表达

猪繁殖与呼吸综合征（ｏｃｅｒｐｏｕｔｅａｄＰｒｉｅｒｄｃｉｎｎｖｒｓｉｔｒｙｄｏ，Ｒ）由猪繁殖与呼吸综ｅｐｒｏｙｓｎｒｍｅＰＲＳ是ａ
经常存在于腺体，第１次就是从腺体组织中分离且
病毒载体。以腺病毒为载体构建重组疫苗，达主表
蛋白为核蛋白，蛋白为基质蛋白［６。由ＯＦＭ４￣－Ｒ５编码的ＧＰ蛋白可以诱导机体产生中和抗体，最主５是要的保护性抗原；由Ｏ６编码的Ｍ蛋白是ＲＦ
２ｈＰＳ洗涤３次；，Ｂ以荧光标记的羊抗鼠的ＩＧ为二ｇ抗，７℃作用３ｎＰＳ洗涤３，３０ｍｉ，Ｂ次吹干，加入缓冲甘油，荧光显微镜下观察。
ｇｎ购自Ｒｏｈｅｔｃｅ公司；光素ＦＴＣ标记羊抗鼠荧ＩＩＧ、根标记羊抗鼠ＩＧ购自Ｇｅｅｅｇ辣ｇｎＴｘ公司；伊文思蓝购自Ｓｇ公司产品；ｉｍａ甲醇、吐温－０购自北京８北化精细化学品有限责任公司。
１２５Ｗｅｔｎｂｔ分析将接种重组腺病毒．．ｓｒｌｅｏ
ｒｄ－Ｐ一的２３ＡｖＧ５Ｍ９ＡＤ细胞培养２，４ｈ用细胞裂解液裂解后，心取上清进行ＳＳＰＧＥ离Ｄ－Ａ。之后转印到硝
摘要：为构建猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＲＳ重组腺病毒活载体疫苗，ＰＲＶ）本研究将ＰＲＳＧＰＲｖ５和

长链脂酰CoA合成酶(ACSL)的研究进展

长链脂酰CoA合成酶(ACSL)的研究进展李庆岗;陶著;杨玉增;张博;史利华;班冬梅;张浩【摘要】长链脂酰CoA合成酶(long-chain acyl-CoA synthetase,ACSL)属于多基因家族编码的酶,在体内催化合成脂酰CoA是哺乳动物利用脂肪酸的第一步反应,因此ACSL在脂肪代谢中起着重要作用.作者从ACSL家族的命名和分类、ACSL基因表达对脂肪代谢的影响、不同ACSL对底物的选择性、转录调控因子对ACSL的调控及当前家畜ACSL的相关研究进展等方面进行了综述,并对今后ACSL研究的重点及意义进行了展望.%Long chain acyl-CoA synthetases (ACSLs) are encoded by a multi-gene family. Synthesis of acyl-CoA catalyzed by acyl-CoA synthetase (ACS) is the first step in mammalian response to the use of fatty acids,so ACSL in fat metabolism plays a major role. In this review, we cover the nomenclature and classing of the ACSL family,the expression of ACSL gene influencing on fat metabolism, the selectivity of different ACSL family on substrate,the regulation of ACSL gene expression by different transcription factors ,and the current research related to livestock ACSL. We also put forward the future research focus and research significance about the ACSL family.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2012(039)006【总页数】4页(P137-140)【关键词】ACSL;脂肪代谢;基因表达;家畜【作者】李庆岗;陶著;杨玉增;张博;史利华;班冬梅;张浩【作者单位】中国农业大学动物科技学院,北京100193;安徽省农业科学院畜牧兽医研究所,安徽合肥230031;中国农业大学动物科技学院,北京100193;中国农业大学动物科技学院,北京100193;中国农业大学动物科技学院,北京100193;中国农业大学动物科技学院,北京100193;中国农业大学动物科技学院,北京100193;中国农业大学动物科技学院,北京100193【正文语种】中文【中图分类】Q552外源及内源性的脂肪酸要进入其代谢途径必须进行活化，即催化合成脂酰CoA，这是哺乳动物利用脂肪酸的第一步反应，ACS（acyl－CoA synthetase）在CoA 和ATP存在的情况下催化游离脂肪酸合成脂酰CoA（Piccini等，1998），催化反应是不可逆的，反应分为两步，第一步是催化游离脂肪酸与ATP结合成脂酰－AMP释放一个焦磷酸（脂肪酸＋ATP→acyl－AMP＋PPi）；第二步是催化脂酰－AMP与CoA结合成脂酰－CoA，并释放出AMP（acyl－AMP＋CoA→acy－CoA＋AMP）。

第十六次全国动物遗传育种学术讨论会系列学术报告会

时间
报告人及报告名称
5月15日14:00-18:15
猪抗病及肉质相关基因的研究（姜运良山东农业大学）
Toll样受体基因在仔猪泻痢中的作用（谢新民湖南农业大学）
猪CFL2基因及荷包猪肉质相关基因发育表达的研究（苏玉虹辽宁医学院）
Lit1/KCNQ1OT1基因与克隆猪异常表型的相关性研究（李长春华中农业大学）
IGF-Ⅰ基因在不同发育时期鹅肌肉组织中表达规律的研究（郝哲吉林农业大学）
转录因子TEAD1正调控Mrpl21基因的转录活性（王凤丽华中农业大学）
高通量测序筛选F18大肠杆菌抵抗和敏感型仔猪十二指肠差异miRNA（叶兰扬州大学）
FABP在鸡脂类代谢中的功能研究（王启贵东北农业大学）
用δ差异显示法筛选鹅脂肪沉积性状阳性EST的研究（曲湘勇湖南农业大学）
001215肌肉生长抑制素mst滩因敲除猪的研究进展潘登科中国农业科学院北京畜牧兽医研究所犊牛体外胚胎生产技术的研究北京奶牛中心慢病毒载体在畜禽转基因中的应用研究浙江省农业科学院眼外肌卫星细胞的肌肉再生优越性研究沈清武西北农林科技大学转基因动物简便快速可视化核酸检测方法的建立华中农业大学从全基因组表达水平挖掘与奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎相关的基因何阳花中国农业大学精原干细胞体内介导制备抗病转基因鸡的研究扬州大学lxra激活剂影响奶山羊乳腺上皮细胞的基因表达西北农林科技大学鸡foxola因5?调控区rs13973515位点的pgl3promoter载体构建及其定点突变王思兵华南农业大学使用手工克隆技术制备侏儒症转基因猪模型杜玉涛深圳华大基因研究院山羊pthrp基因干扰重组腺的制备与鉴定西北农林科技大学姜曲海猪内源性反车寻病毒的相关研究猪脂肪组织发育相关mirna定及表达分析李国喜西北农林科技大学枇猪前体脂肪细胞的原代和传代培养及诱导分化的研究胡艳霞山东农业大primir1031重组腺的构建及山羊原代乳腺上皮细胞中的表达滋西北农林科技大学piggybac转座子在绒山羊基因组中的整合位点及其特征分析白丁平西北农林科技大学猪osbpl基因在骨骼肌中的印记鉴定及与部分性状关联性分析王猛山东农业大学不问长度原始转录本对小鼠mir195过表达效果影响的比较华中农业大学地点

FABP4与肿瘤上皮-间质转化信号通路相关性的研究进展

FABP4与肿瘤上皮-间质转化信号通路相关性的研究进展张燕;夏敏【摘要】近年来,脂肪酸结合蛋白家族4(FABP4)在肿瘤转移中的研究机制广受关注.FABPs是一种广泛存在于哺乳动物脂肪、肝脏、小肠等多种器官组织细胞内的小分子胞内蛋白,脂肪酸结合蛋白的脂肪细胞型称为FABP4.与细胞膜上其他因子相比,FABP4可以优先与脂肪酸结合,进入胞质进行氧化、酯化等化学修饰,转运脂肪酸至身体各个部位,参与脂质合成、代谢及肿瘤转移的信号转导.肿瘤转移即肿瘤细胞丢失自身特性,不断增殖生长,上皮-间质转化是启动恶性肿瘤侵袭与转移的关键步骤.【期刊名称】《医学综述》【年(卷),期】2019(025)009【总页数】5页(P1734-1738)【关键词】肿瘤;脂肪酸结合蛋白4;上皮-间质转化;信号通路【作者】张燕;夏敏【作者单位】南京医科大学附属无锡人民医院消化内科,江苏无锡214023;南京医科大学附属无锡人民医院消化内科,江苏无锡214023【正文语种】中文【中图分类】R73-37肿瘤是全球十大死亡原因之一，2014年估计我国恶性肿瘤新发病例数约380.4万例，中国每年的新发病例与死亡病例约占全球的21.8%和27%[1]。

大部分肿瘤起病隐匿，早期并无明显的临床症状，大部分患者发现时已是中晚期或广泛转移，而早期手术患者5年后仍表现出无症状的转移和复发，所以大部分肿瘤患者并非死于肿瘤本身，而是死于肿瘤转移和复发。

肿瘤的转移是一个涉及多基因、多途径的复杂过程，其中上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在肿瘤的转移中发挥重要作用。

脂肪酸结合蛋白家族(fatty acid binding proteins，FABPs)是广泛存在多种组织的脂肪因子，其中FABP4是FABPs中最具特征性的亚型，FABP4与糖脂代谢、肥胖、心血管疾病、动脉粥样硬化等疾病有关，近年来研究发现FABP4可促进肿瘤侵袭转移，包括乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、结直肠癌等[2-6]。

Betatrophin是一种新的糖脂代谢影响因子

Betatrophin是一种新的糖脂代谢影响因子田清平;唐朝枢;庞永正;刘梅林【摘要】Betatrophin是一种新发现的影响糖脂代谢的因子.人类Betatrophin基因定位于染色体19p13.2,鼠类该基因定位于9号染色体,这是一个高度保守的基因,人类Betatrophin的氨基酸序列与鼠类有73％同源性,82％相似性,主要表达在肝脏和脂肪组织,对糖脂代谢有重要影响.【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2014(034)011【总页数】4页(P1570-1573)【关键词】Betatrophin;糖尿病;脂代谢紊乱【作者】田清平;唐朝枢;庞永正;刘梅林【作者单位】北京大学第一医院老年病内科,北京100034;北京大学第一医院心血管疾病研究所,北京100034;北京大学第一医院心血管疾病研究所,北京100034;北京大学第一医院老年病内科,北京100034【正文语种】中文【中图分类】R589随着生活水平的提高，肥胖、糖尿病和脂代谢紊乱等已成为威胁人类健康的重要问题。

尽管治疗药物层出不穷，依然未能彻底解决这一问题。

深入研究此类疾患的发病机制，找到新的治疗靶点，是各国学者潜心钻研的努力方向。

近两年，不同的研究团队先后报道了一个新的影响糖脂代谢的因子，并根据各自研究发现该因子的特点给予不同命名，包括Betatrophin[1]、Lipasin(lipase inhibition)[2]、RIFL(refeeding induced in fat and liver)[3]、和ANGPTL8(angiopoietin-like protein8，血管生成素样蛋白8)[4]。

这个因子的基因名称是Gm6484(小鼠)和C19orf80(人)。

人类Betatrophin基因定位于染色体19p13.2，鼠类该基因定位于9号染色体。

基因编码的蛋白质有198个氨基酸。

Betatrophin是高度保守的基因，人类Betatrophin氨基酸序列与鼠类有73%同源性，82%相似性[3]。

猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报收稿日期：2021-05-21基金项目：国家自然科学基金（31902247）作者简介：方谱县，男，博士后，主要从事动物冠状病毒研究通信作者：方六荣，E-mail:**************** 2023,31(6):1-10·研究论文·猪δ冠状病毒N 蛋白单克隆抗体的制备及初步应用摘要：为制备猪δ冠状病毒（PDCoV ）N 蛋白的特异性单克隆抗体，并初步应用于临床样品中PDCoV 抗原的免疫组织化学（IHC ）检测，本研究以原核表达的PDCoV N 蛋白免疫BALB/c 小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，基于纯化的N 蛋白建立的间接ELISA 方法筛选获得稳定分泌N 蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，并对单克隆抗体的免疫反应特异性、亚类进行系统鉴定。

结果显示：通过3次亚克隆筛选获得8株可分泌PDCoV N 蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

经IFA 和Western blot 分析，证实制备的单克隆抗体均与猪δ冠状病毒反应，且不与猪流行性腹泻病毒（PEDV ）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV ）反应，特异性良好。

单克隆抗体亚类鉴定结果表明，1A11、3C6、1E7、1E12株单克隆抗体属IgG1型，4F3、2A3株单克隆抗体为IgG2a 型，3E4单克隆抗体为IgM 型，8株单克隆抗体的轻链均为κ链。

利用1A11单克隆抗体对PDCoV 、PDEV 、TGEV 感染猪的空肠、回肠组织进行IHC 检测，结果表明1A11能与感染PDCoV 的组织发生特异性免疫反应，而不与感染PDEV 和TGEV 的组织发生反应，特异性良好。

本研究制备的PDCoV N 蛋白单克隆抗体可为PDCoV 诊断方法的建立以及N 蛋白的功能研究奠定基础。

关键词：猪δ冠状病毒；N 蛋白；原核表达系统；单克隆抗体；免疫组化中图分类号：S852.4文献标志码：A文章编号：1674-6422（2023）06-0001-10Preparation and Preliminary Application of Monoclonal Antibodies AgainstRecombinant N Protein of Porcine DeltacoronavirusFANG Puxian 1,2, ZHANG Huichang 1,2, XIA Sijin 1,2, JIANG Xiaocui 1,2, SUN Qianqian 1,2,XIAO Shaobo 1,2, FANG Liurong 1,2(1. State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, College of Veterinary Medicine, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070,China; 2. The Cooperative Innovation Center for Sustainable Pig Production, Wuhan 430070, China)方谱县1,2，张蕙畅1,2，夏思进1,2，江晓翠1,2，孙倩倩1,2，肖少波1,2，方六荣1,2（1.华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室，武汉430070；2.湖北省生猪健康养殖协同创新中心，武汉430070）Abstract: The objectives of this study were to prepare specific monoclonal antibodies (MAbs) against N protein of Porcine deltacoronavirus (PDCoV) and preliminarily apply them to detect PDCoV antigen in clinical samples in immunohistochemistry (IHC). BALB/c mice were immuni z ed with puriﬁ ed recombinant N protein expressed by prokaryotic expression system followed by fusion of the harvested spleen cells and myeloma cells. The hybridomas stably secreting MAbs against N protein were selected in indirect ELISA using the puriﬁ ed N protein. The results showed that 8 monoclonal cell lines secreting MAbs against PDCoV N protein were obtained through screenings and subsequent three cycles of subclonings. All 8 MAbs reacted with PDCoV in IFA and Western blotting but not with Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) and Porcine transmissible gastroenteritis virus (TGEV). In addition, the heavy chains of MAbs· 2 ·中国动物传染病学报2023年12月猪δ冠状病毒（Porcine deltacoronavirus，PDCoV）是近年来发现的一种重要肠道冠状病毒，感染哺乳仔猪可引发严重的腹泻、呕吐、脱水甚至死亡[1-3]。

中图分类号：S852723

中图分类号:S 852.723　文献标识码:A 文章编号:167324696(2008)0120020205柔嫩艾美球虫免疫与鸡盲肠扁桃体TNF 2α基因表达动态的关系王彩霞,徐　赓,王黎霞,安　健3(北京农学院动物科学技术系,北京　102206) 摘要:根据GenBank 上鸡β2actin 、TN F 2α的基因序列设计引物,应用逆转录2聚合酶链式反应(R T 2PCR )技术克隆获得了β2actin 和TN F 2α基因,采用β2actin 为内参的半定量方法检测TN F 2αmRNA 在鸡柔嫩艾美球虫免疫前后不同时间的表达情况,以探讨TN F 2α基因的表达动态与柔嫩艾美球虫免疫的关系。

结果显示,TN F 2α基因在两次免疫期间的表达量整体上呈现双峰模式,首免后第9d 达到一个高峰,二免后第7d 达到另一个高峰。

结果表明,TN F 2α在抗球虫感染中有一定的作用。

关键词:β2actin 基因;柔嫩艾美球虫;盲肠扁桃体;R T 2PCR ;TN F 2α基因R elationship bet w een Eimeria tenella immunity and kineticexpression of TNF 2αgene in chicken cecal tonsil WAN G Cai 2xia ,XU Geng ,WAN G Li 2xia ,AN Jian(De partment of A ni mal S cience and Technolog y ,B ei j ing College of A g riculture ,B ei j ing 102206,China ) Abstract :According to chicken β2actin and TN F 2αgene sequences in GenBank ,primers were de 2signed ,and t he gene sequences were amplified by reverse t ranscriptase 2polymerase chain reaction (R T 2PCR )f rom t he cecal tonsil of chicken experimentally immunized wit h Ei meri a tenell a .The exp ression le 2vel of TN F 2αmRNA at different time after immunization was detected by semi 2quantitative R T 2PCR wit h β2actin gene as internal reference to st udy t he relationship between E.tenell a immunizatio n and t he kineticexpression of TN F 2αgene in chicken cecal tonsil.The result s showed t hat t he level of expression of TN F 2αgene reached 1st peak on day 9po st 21st 2immunization ,and reached 2nd peak on day 7post 2booster 2immunization.It was concluded t hat TN F 2αhad some effect against E.tenell a infection.K ey w ords :β2actin gene ;Ei meri a tenell a ;cecal tonsil ;R T 2PCR ;t umor necrosis factor 2αgene 鸡球虫病是由艾美属球虫寄生于鸡小肠和盲肠上皮细胞引起的一类原虫病,对养鸡业的危害相当严重。

猪繁殖与呼吸综合征病毒M+N基因重组腺病毒载体的构建

猪繁殖与呼吸综合征病毒M+N基因重组腺病毒载体的构建徐娜;李宝玉;柳纪省【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2010(000)010【摘要】本研究构建了M+N基因的重组腺病毒栽体.首先用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法分别扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因和N基因,将两者用口蹄疫病毒2A序列串联起来,将连接好的M+N基因插入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,经筛选获得了重组质粒pAdTrack-CMV/M+N;然后在大肠杆菌BJ5183内将此重组质粒和腺病毒骨架载体pAdEasy-1进行同源重组,获得了插有外源基因的重组腺病毒质粒pAd/M+N;最后,经Pac Ⅰ酶切线性化后转染HEK-293细胞,成功获得含有M+N基因的重组腺病毒,为重组腺病毒活载体疫苗的研究奠定基础.【总页数】4页(P168-171)【作者】徐娜;李宝玉;柳纪省【作者单位】中国农业科学院兰州兽医研究所传染病室,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部兽医公共卫生重点开放实验室,兰州,730046;中国农业科学院兰州兽医研究所传染病室,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部兽医公共卫生重点开放实验室,兰州,730046;中国农业科学院兰州兽医研究所传染病室,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部兽医公共卫生重点开放实验室,兰州,730046【正文语种】中文【中图分类】S8【相关文献】1.猪Ⅱ型圆环病毒Cap基因重组腺病毒表达载体的构建 [J], 马友记;柳纪省;赵兴绪;李志勇;殷相平;李宝玉2.应用AdEasy-1腺病毒载体系统构建人GDF-5基因重组腺病毒 [J], 罗栩伟;刘康;陈竹;赵明;韩小伟;白亦光;冯刚3.猪源性CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 朱海涛;田敏;于良;吕毅;王博4.猪圆环病毒2型ORF2与T细胞表位基因重组腺病毒表达载体的构建及鉴定 [J], 莫永正;罗满林;陈瑞爱5.共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪γ-干扰素基因的腺病毒载体的构建与鉴定 [J], 牛明福;李翔;曹瑞兵;郑其升;魏建超;姬向波;李鹏;周斌;陈溥言因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

FoxO1转录因子及其翻译后修饰的生物学意义_钟茜

FoxO1 转录因子属于 Fox 家族成员，含有一段约 100 个氨基酸残基组成的保守叉头（ forkhead）盒序列（或称带翼螺旋） . Fox 家族成员为一类与发育、免疫、代谢及癌症发生相关的转录调节因子. FoxO 是 Fox 家族的一个亚群，包括 FoxO1、FoxO3、FoxO4 和 FoxO6. 它们在哺乳动物细胞的凋亡、应激、细胞周期阻滞、DNA 损伤 / 修复，以及糖代谢调节中起着重要作用. FoxO 亚家族具有高度保守的磷酸化位点，这些位点是 Akt / PKB 激酶的磷酸化靶位点. FoxO 活性受翻译后修饰（包括磷酸化和乙酰化）调节. 磷酸化的 FoxO1，从核内转移至胞质中，使 FoxO1 不能作用于其靶向基因，从而使 FoxO1 丧失了其转录因子活性；同时，磷酸化的 FoxO1 容易进一步被泛素化，导致 FoxO1 的降解. 乙酰化的 FoxO1 加速和促进 FoxO1 的磷酸化，致使 FoxO1 的活性降低［1］. 最近，小鼠基因敲除研究证明 FoxOs 可作为肿瘤抑制因子发挥功
phophorylation by Akt are labeled with ○P ； the lysine residues which can be acetylated are labeled with □A
1. 2 FoxO1 基因敲除 1. 2. 1 FoxO1 基因敲除小鼠与血管生成卵黄胚胎卵黄囊的流通代表最早的循环系统是胚胎中第一个血管生成的位点. FoxO1 基因敲除老鼠胚胎发育第 9. 5 天卵黄囊和胚胎出现异常的血管生成以及发育不全的鳃弓，进而导致心周积液，在胚胎发育第 11 天死亡. 野生型卵黄囊有血管生成，但缺乏 FoxO1 的卵黄囊则色泽苍白，没有明显的血管生成. 在添加外源性血管内皮生长因子后，与野生型血管内皮细胞的细长纺锤形形状相比，缺乏 FoxO1 胚胎干细胞分化而来的血管内皮细胞则出现异常的扁平多边形的细胞形态［5］. 在缺乏 FoxO1 的卵黄囊中，连接蛋白-37 和连接蛋白-40 表达明显下降，这些连接蛋白在血管内皮细胞中表达丰富，双重连接蛋白37 / 连接蛋白-40-缺陷的小鼠则会出现血管异常，如血管扩张和栓塞［6］. 此外，与野生型卵黄囊相比， ephrin -B2 的转录水平降低了 65% . 因为胚胎血管系统构建的缺陷以及脑和卵黄囊的动脉和静脉的毛细血管网络中血管生成缺陷，ephrin -B2 基因敲除小鼠胚胎 E11. 5 日前死于子宫内. Ephrin -B2 基因敲除小鼠的表型与 FoxO1 缺陷小鼠的表型非常相似［7］. 这些研究表明 FoxO1 基因与血管生成和胚胎发育紧密相关.

表达猪白细胞介素2重组腺病毒的构建

表达猪白细胞介素2重组腺病毒的构建张健;陈艳;乔传玲;杨焕良;唐续;辛晓光;陈化兰【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2011(033)004【摘要】为构建表达猪白细胞介素2(IL-2)的复制缺陷型重组腺病毒,本研究提取经刀豆球蛋白A(con A)刺激体外培养的长白猪外周血淋巴细胞总RNA,利用RT-PCR 扩增猪IL-2基因,并克隆于质粒pIRES2-EGFP中,将含有IL-2及EGFP的基因片段亚克隆到腺病毒的穿梭质粒pDC315中,构建重组腺病毒穿梭质粒pDC315-IL-2-EGFP.利用脂质体转染方法将pDC315-IL-2-EGFP和腺病毒骨架质粒pBHGloxΔEl,E3Cre共转染HEK293细胞.根据腺病毒感染后形成的典型细胞病变及EGFP的荧光信号筛选重组腺病毒rAd-IL-2-EGFP.经western blot鉴定,结果表明获得了一株能够表达猪IL-2蛋白的重组腺病毒rAd-IL-2-EGFP.本研究为进一步研究猪IL-2在疫苗免疫中的增强作用及研制新型免疫增强剂奠定了基础.%To construct a recombinant adenovirus expressing porcine interleukin 2 (IL-2), The IL-2 gene was amplified by RT-PCR with specific primers from the total RNA, which were extracted from peripheral blood lymphocytes after stimulation with ConA in vitro and cloned into pIRES2-EGFP.The recombinant adenovirus shuttle plasmid pDC315-IL2-EGFP was constructed by inserting IL2-IRES-EGFP into shuttle plasmid pDC315.A recombinant adenovirus expressing IL-2 (rAd-IL-2-EGFP) was generated by co-transfecting the pDC315-IL2-EGFP and the backbone plasmid pBHGlox△E1, E3Cre in HEK293 cells.The rAd-IL2-EGFP exhibited the typicalcytopathic effect of adenovirus and fluorescence expressed by EGFP gene in HEK293 cells and IL-2 expression was confirmed by westernblot.Therefore, rAd-IL-2-EGFP would be useful to study the immune enhancement of the porcine IL-2 in pig.【总页数】3页(P313-315)【作者】张健;陈艳;乔传玲;杨焕良;唐续;辛晓光;陈化兰【作者单位】中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室,黑龙江哈尔滨150001【正文语种】中文【中图分类】S852.65【相关文献】1.表达猪Viperin蛋白重组腺病毒的构建及其对PRRSV复制的抑制作用 [J], 方剑玉;朱文豪;郭小参;白献晓;李海利;徐引弟;郎利敏;王治方;王克领2.表达猪圆环病毒2型Cap蛋白重组腺病毒的构建 [J], 许晗;李海敏;王爱玲;李春燕;李河林;吕其壮;张彦明;郭抗抗3.猪白细胞介素2基因的克隆及腺病毒表达载体的构建 [J], 周庆丰;刘忠华;龚朋飞;周美华;苏润环;何津佳;毕英佐4.表达猪生长激素基因的重组腺病毒的构建及对猪生长的促进效果观察 [J], 曹汉威;张春红;黄忠;阮良基;林洁5.表达猪白细胞介素2(plL-2)重组乳酸杆菌的构建 [J], 沙万里;闫满;刘仲藜;韦舒婉;李国江因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

第12章猪腺病毒徐雪芳

第12章猪腺病毒Steven B.Kleiboeker四十年前，Haig等（1964）第一次在一只腹泻仔猪的直肠拭子中分离到腺病毒。

随后，Kasza 等（1966）在一只患有脑炎的猪脑内第二次分离到了腺病毒。

此后，在大量样品中分离到了该病毒，包括患有肺炎、腹泻、肾损伤和脑炎的病料中。

但是，在健康猪的粪便中亦可分离到腺病毒，并且大部分猪在感染后并无任何临床症状。

近些年来，与人腺病毒相似，猪腺病毒广泛应用于表达载体和疫苗载体（Reddy 等）。

病原学猪腺病毒的三个（A、B、C）毒株均属于腺病毒科哺乳动物腺病毒属。

通过病毒中和实验，目前已经发现有六个血清型（Clarke 等，1967；Haig等，1964；Hirahara 等，1990；Kadoi 等，1995；Kasza 等，1966）。

血清型1，2，3型属于猪腺病毒A株，血清型4型属于猪腺病毒B株，而血清型5型则属于猪腺病毒C株（Buchen-Osmond 2003）。

猪腺病毒的结构、化学和物理特性与腺病毒科的其他成员相同。

腺病毒颗粒直径80～90nm，没有囊膜，20面体立体对称。

衣壳由252个壳微粒组成，其中240个壳微粒是六邻体，形成由等边三角形形成的20面体。

位于20面体顶端的12个壳微粒是五邻体。

每个五邻体由基底和伸出表面的一根长为20-50nm末端有顶球的纤维组成。

通过负染电子显微镜可以观察到腺病毒颗粒呈标准的六边形（图12.1），偶尔也能观察到纤维和顶球。

作为腺病毒科的共同特性之一，猪腺病毒基因为线型双链DNA分子。

通过对多个血清型的猪腺病毒的基因序列分析和限制性片段图谱分析，发现猪腺病毒的基因大小约为32-34 Kb（Kleiboeker 等，1993；Reddy 等，1998；Nagy 等，2001）。

在复杂的RNA连接后又基因编码和翻译了大约40种蛋白质。

大约三分之一的基因编码结构蛋白。

与其他腺病毒一样，基因结构含有早期和晚期的阅读框。

猪GSTM2基因的多态性及与生产性状相关性分析_王嘉博

猪GSTM 2基因的多态性及与生产性状相关性分析收稿日期：2010-04-26基金项目：“十一五”国家科技支撑计划重点项目（2008BADB2B02）作者简介：王嘉博(1985-)，男，硕士，研究方向为动物遗传育种与繁殖的分子生物学研究。

E-mail:wangjiaboyifeng@ *通讯作者：刘娣，教授，博士生导师，研究方向为猪遗传繁育及家畜生物技术。

E-mail ：liudi1963@王嘉博１，２，祝继原２，俄广鑫２，杨少成２，刘娣１，２*（1.东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨150030；2.黑龙江省农业科学院，哈尔滨150086）摘要：母猪产仔性状是评价猪场效益的重要指标，也是猪育种工作的重点。

谷胱甘肽硫转移酶mu 亚基（Glutathione S-transferase Mu2，GSTM2）基因是与母猪生殖系统免疫和生长发育有关的基因。

研究采用PCR-SSCP 的方法分析了GSTM 2基因的单核苷酸多态性，并分析了每个多态位点对母猪繁殖性状的影响。

结果表明，G2、G5、G7位点对母猪总产仔数和活产仔数影响显著，这三个位点都是AB 基因型个体的总产仔数平均数最高，进一步验证了杂合基因型高于纯合基因型性状的理论。

这三个位点对断奶窝平均重影响不显著。

G2位点对窝平均初生重影响显著。

实现了对GSTM2基因多态性的分析，并与母猪产仔性状和初生窝重等生产性状进行了相关性的分析。

得到了基因与性状之间的第一手材料。

关键词：猪；GSTM 2基因；SSCP ；生产性状中图分类号：S828文献标志码：A文章编号：1005-9369（2011）06－0023－05Polymorphism of porcine GSTM 2gene and its correlation analysis with production traits/WANG Jiabo 1,2,ZHU Jiyuan 2,E Guangxin 2,YANG Shaocheng 2,LIU Di 1,2(1.第42卷第6期东北农业大学学报42(6):23~272011年6月Journal of Northeast Agricultural UniversityJune 2011[2]余秋波,王应雄．细胞粘附分子与胚胎着床[J].中国优生与遗传杂志,2005(1)：6-8.[3]Suzuki N,Zara J,Sato T,et al.A novel cytoplasmic protein,bystin,interacts with trophinin,tastin and cytokeratin,and may be involved in trophinin mediated cell adhesion between trophoblast and endometrial epithelial cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,1998,95:5027-5032.[4]Aoki R,Fukuda M N.Recent molecular approaches to elucidate the mechanism of embryo implantation:Trophinin,bystin,and tastin as molecules involved in the initial attachment of blastocysts to the uterus in humans[J].Semin Reprod Med,2000,18:265-271.[5]Kimber S J,Spanswick C.Blastocyst implantation:the adhesion cascade[J].Semin Cell Dev Biol,2000,11(2):77-92.[6]Suzuki N,Nakayama J,Shih I M,et al.Expression of trophinin,tastin,and bystin by trophoblast and endometrial cells in human placenta[J].Biol Reprod,1999,60:621-627.[7]Nadano D,Sugihara K,Paria B C,et al.Significant differencesbetween mouse and human trophinins are revealed by their expression patterns and targeted disruption of mouse trophinin gene[J].Biol Reprod,2002,66:313-321.[8]Fukuda M N,Miyoshi M,Nadano D.The role of bystin in embryo implantation and in ribosomal biogenesis[J].Cell Mol Life Sci,2008,65(1):92-99.[9]Aoki R,Suzuki N,Paria B C,et al.The BYSL gene product,bystin,is essential for survival of mouse embryos[J].FEBS Lett,2006,580:6062-6068.[10]Adachi K,Soeta-Saneyoshi C,Sagara H,et al.Crucial role of BYSL in mammalian preimplantation development as an integral factor for 40S ribosome biogenesis[J].Mol Cell Biol,2007,27:2202-2214.[11]肖丽娟,杨增明.Trophinin,tastin 和bystin 在哺乳动物胚胎着床及早期胎盘形成中的作用[J].生殖医学杂志,2002,11(2):120-123.[12]许振英.中国地方猪种种质特性[M].杭州：浙江科学技术出版社，1989：16-38.东北农业大学学报第42卷谷胱甘肽硫转移酶(Glutathione S-transferases ；简称GSTs)是生物体内一种重要的一相解毒酶，GST mu 2基因属于GSTs 的mu 亚型，mu 亚型在消除自由基、过氧化物、亲电子基团和中间数具有酶功能，并参与细胞保护和调节细胞生长，GSTM2具有前列腺素E 合成酶(PGES)的活性，可以参与前列腺素E2(PGE2)的合成[1]。

猪肌分化因子1基因启动子区多态性及生物信息学研究

猪肌分化因子1基因启动子区多态性及生物信息学研究张雄;张勇;陈祥;李俊;白优;陈村年;李冬光【摘要】为揭示猪肌分化因子(myogenic differentiation 1,MyoDl)基因启动子区多态性,本试验分别以野猪×从江香猪二元杂交猪、杜×长×大外三元杂交猪及贵州宗地花猪为研究对象,采用DNA池和直接测序技术,筛选MyoD1基因5'UTR及部分第1外显子区SNP位点,利用生物信息学软件预测SNP位点对核心启动子区、CpG岛和转录因子结合位点的影响.结果表明,在MyoD1基因5'UTR及部分第1外显子区筛查到3个SNPs位点,分别为A-39G、T+150C和C+227G;生物信息学软件预测发现,A-39G位点附近出现重要转录因子结合位点消失和新位点生成;CpG Island searcher软件分析得到多态位点突变前后CpG岛大小及GC含量发生改变,据此推测猪MyoD1基因5'UTR区域的A-39G位点对调控启动子功能元件有重要影响.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2016(043)005【总页数】8页(P1308-1315)【关键词】MyoD1基因;SNP;启动子;生物信息学【作者】张雄;张勇;陈祥;李俊;白优;陈村年;李冬光【作者单位】贵州大学动物科学学院,贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖省部共建教育部重点实验室,贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室,贵阳550025;贵州大学动物科学学院,贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖省部共建教育部重点实验室,贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室,贵阳550025;贵州大学动物科学学院,贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖省部共建教育部重点实验室,贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室,贵阳550025;贵州省生猪健康养殖工程技术研究中心,贵阳550025;贵州大学动物科学学院,贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖省部共建教育部重点实验室,贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室,贵阳550025;贵州大学动物科学学院,贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖省部共建教育部重点实验室,贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室,贵阳550025;贵州省生猪健康养殖工程技术研究中心,贵阳550025;贵州省生猪健康养殖工程技术研究中心,贵阳550025【正文语种】中文【中图分类】S813.3肌分化因子(myogenic differentiation 1，MyoD1)属于生肌调节因子家族成员(MRFs)，与肌肉基因启动子的特异性区域(E-BOX)结合后，可激活肌肉特异性转录，促进肌前体细胞的增殖和分化。

糖脂毒性对胰腺β细胞的功能损伤作用及机制

糖脂毒性对胰腺β细胞的功能损伤作用及机制郭莉霞【摘要】In recent years , major progress has been made towards a better understanding of the cellular and molecular mechanisms of glucolipotoxicity in the beta cell. However, the role of glucolipotoxicity is still debated. In fact , the beta cell's response to nutrient excess likely represents a continuum encompassing all stages of beta-cell compensation and beta-cell failure. In that sense, some of the early manifestations of glucolipotoxicity should actually be considered as a positive response. The combination of excessive levels of fatty acids and glucose leads to decrease insulin secretion, impaire insulin gene expression and beta-cell death by apoptosis. Finally , glucolipotoxicity contributes to beta-cell failure in type 2 diabetes. The most recent progresses in the molecular mechanisms which glucolipotoxicity induces beta cells mass expansion and function were summarized, and the reciprocity of glucose and fat in development of type 2 diabetes was chiefly explained.%现在关于高糖高脂对胰腺β细胞的毒性机制已经有了明显的进展,但还不完全清楚.实际上,β细胞响应过量营养物质的过程是一个连续的过程,包括β细胞补偿和β细胞功能失调.在早期,β细胞应对高糖高脂的反应是一个积极主动的过程;而到后期,过量的糖脂会导致胰岛素分泌下降,削弱胰岛素基因表达量,并促进胰岛β细胞凋亡.最终对2型糖尿病的发展有促进作用.综述了近年来细胞水平和分子水平,在葡萄糖存在的条件下,脂肪酸对胰腺β细胞的损伤作用及其机制的研究进展,重在说明葡萄糖和脂肪酸在2型糖尿病发展中的共同作用.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2011(028)003【总页数】4页(P70-73)【关键词】糖脂毒性;β细胞;损伤;机制【作者】郭莉霞【作者单位】重庆工商大学药物化学与化学生物学研究中心,重庆,400067【正文语种】中文【中图分类】Q25关于胰腺β细胞功能失调与糖尿病之间关系的研究已经有 20年了[1]。