温度、营养和光强对发状念珠藻生长的影响

2004 年 6 月The Chinese Journal of Process Engineering June 2004

温度、营养和光强对发状念珠藻生长的影响

毕永红1,2，胡征宇1

(1. 中国科学院水生生物研究所，湖北武汉 430072；2. 中国科学院研究生院，北京 100039)

摘要：研究了温度、营养和光强对发状念珠藻(Nostoc flagelliforme Born. et Flah.)生长的影响. 结

果表明，温度、营养和光强的变化影响其生长速率和细胞的生化组成. 藻细胞在25o C温度与45 µmol/(m2⋅s)光强下培养分别得到最大比生长速率；而N, P和Ca2+缺乏显著降低细胞的比生长速率，微量元素As和K缺乏对细胞生长速率没有明显影响. 随着培养温度的增加，胞外多糖含量逐渐下

降；而不同光强对胞外多糖含量也具有显著影响，高光强和低光强下的多糖含量均高，而15∼45 µmol/(m2⋅s)光强下的胞外多糖含量仅是高光强和低光强实验组的10%∼20%左右；营养成份的缺失

不利于多糖的合成，缺Ca等对胞外多糖的分泌影响较大. 适宜的生长温度(25o C)下蛋白质含量高

于其它温度；高光强[90∼180 µmol/(m2⋅s)]下的蛋白质含量显著高于其它光强；营养成份缺失的实验

组蛋白质含量均比未缺失的对照组(BG11)低.

关键词：培养条件；比生长速率；生化成份；发状念珠藻

中图分类号：Q949 文献标识码：A 文章编号：1009−606X(2004)03−0245−05

1 前言

发状念珠藻(Nostoc flagelliforme Born. et Flah.)俗名地毛、发菜等(以下简称发菜)，是一种主要分布在我国西部和西北部荒漠半荒漠地区的陆生固氮经济蓝藻，属于国家一级保护植物，是荒漠生态环境中不多的固氮植物，具有重要的生态作用. 它在中国已经有上千年的食用和药用历史[1]，具有广阔的应用前景. 此外它还是研究极端环境中生命现象的一种良好材料. 在野外发菜生长极其缓慢，前些年大规模无节制的毁灭性采掘不仅使其资源量锐减，而且严重破坏了草原生态系统. 为了保护发菜资源和生态环境，长期以来人们一直试图采用人工培养的方法增加其生物量和资源量，以满足日益增长的市场需求和认识其生命活动规律，并开展了大量的生理生态学研究[2−6]，取得了一些进展，但完全人工养殖一直没有突破. 主要原因是其生长在极端环境中，野外监测几乎难以发现生长的迹象，使其生命活动的许多独特生理特性及生长所需的环境条件不为人知. 人工培养成功的一个先决条件是对其生长发育所需要的环境有充分的了解和把握. 目前报道的培养工作基本以野外采集的丝状体为材料，研究的重点均未涉及培养条件的优化；加之丝状体在长期浸泡后发生解体现象，因此培养一段时间后生长就停滞甚至死亡. 为了了解其生长所需的适宜条件，本工作以细胞(藻丝)为研究对象，进行液体培养实验，以获得其生长发育所需的适宜环境因子，为发菜人工培养积累技术资料.

2 材料与方法

2.1 材料

发菜细胞来源于野外采集的发菜丝状体，实验室破胶鞘后在固体平板上分离纯化，然后在温度(25±0.5)o C、光强40 µmol/(m2⋅s)和光暗周期(L/D)10/14条件下扩大培养得到细胞培养物作为藻种.

收稿日期：2003−09−17，修回日期：2003−12−18

基金项目：中国科学院十五预研项目资助(编号: 201504)；内蒙古科技厅生物资源保护项目资助(编号: 20010206)

作者简介：毕永红(1974−)，男，湖北省赤壁市人，博士研究生，主要从事藻类生理生态学研究；胡征宇，通讯联系人，E-mail: huzy@.

2.2 细胞培养

温度实验：将处于对数生长期的发菜细胞培养物接种到含120 ml BG11培养液[7]的500 ml 锥形瓶中，接种后细胞叶绿素Chl a 含量约为0.53 mg/L ，放置到光暗周期10:14、光强40 µmol/(m 2⋅s) 的光照培养箱中，于不同温度下分别进行静置培养.

营养实验：以BG11培养液为对照组，实验组培养液为缺失不同营养成份的修正BG11培养液(BG110缺N, BG11a 缺P, BG11b 缺K, BG11c 缺Ca ，

BG11d 缺As)，接种后细胞Chl a 含量约为0.53 mg/L ，放置到光暗周期10:14、光强40 µmol/(m 2⋅s)、温度25o C 的光照培养箱中静置培养.

光强实验：接种后细胞液初始浓度为0.11 mg/L ，于温度(28±0.8)o C 、光暗周期10:14、不同光强条件下静置培养. 使用Li −185B 照度计(Li −Core 公司)测定锥形瓶壁不同位置4个点光强的平均值，光源为普通Philips 荧光灯.

以上实验均为3次重复培养.

2.3 数据测定

在细胞培养过程中，每天取样测定叶绿素a 含量，作为生长的生理指标衡量细胞生长速度并计算比生长速率[µ=ln(X t 2

/X t 1

)/(t 2−t 1), 其中X t 2

为对数生长终点的Chl a 浓度(mg/L), X t 1

为对数生长起

点的Chl a 浓度(mg/L), t 2为对数生长终点时间(d), t 1为对数生长起点时间(d)]. 在细胞培养结束时取样测定培养物的胞外多糖、蛋白质等生化组成的含量，比较不同培养条件对细胞生长的影响.

叶绿素的测定使用80%丙酮抽提样品中的色素，在UV −1601紫外可见分光光度计上测定A 663

和A 645，通过Arnon 公式[8]计算得到叶绿素a 含量. 胞外多糖的测定采用蒽酮比色法[9]，样品以5000 r/min 离心5 min ，取上清液1.0 ml 加入蒽酮溶液5 ml ，于100o C 水浴加热10 min ，取出冷却，在紫外可见分光光度计上测定波长625 nm 的吸光度，通过标准曲线计算培养物分泌的胞外多糖. 蛋白质测定用考马斯亮蓝G −250染色法[10].

实验数据使用单因子方差分析(ANOV A)和平均数LSD 多重分析法检验结果的显著性差异.

3 结 果

3.1 培养条件对生长的影响

图1为不同温度下发菜的生长情况. 可见该藻接种到培养液后需要2 d 左右的停滞期以适应环境的变化，且不同温度下培养的细胞生长速度有明显差异(p <0.05). 培养16 d ，5个温度下的比增长速率分别为0.049, 0.095, 0.124, 0.162, 0.148 d −1. 结果显示25o C 下生长速度最快，低温条件下的生长非常缓慢，不利于获得大生物量.

4.

0.5

1.01.5

2.02.5

3.03.5

4.05

C h l o r o p h y l l a (m g /L )

Time (d)

24681012141618

0.5

1.01.5

2.02.5

3.03.5

4.04.5

C h l o r o p h y l l a (m g /L )

Time (d)

图1 不同培养温度下以Chl a 表征的发菜生长 图2 缺失不同营养素的培养液中细胞的生长 Fig.1 Time course of growth expressed by Chl a Fig.2 Time course of growth expressed by Chl a

content under different temperatures content under different culture media