地高辛标记探针的Southern杂交

地高辛标记探针的Southern 杂交

（DIG High Primer DNA Labeling and Detection Starter Kit I ，Cat.No.11 745 832 910，Roche Diagnostics GmbH，Germany）

1. 探针标记步骤（20µl 体系）：

1)将10ng-1µg模板DNA用无菌去离子水补足至16µl。

2)沸水浴或干浴锅98 ℃ 10分钟，使DNA变性成单链并迅速冰浴冷却。

3)充分混匀DIG-high Primer （1#管），并取4 µl至变性DNA管，混匀并

离心。

4)37 ℃温育1小时或过夜（最大到不超过20小时）。

5)停止反应，加2 µl 0.2M EDTA（pH 8.0）或65 ℃加热10分钟。

2. 探针标记效率检测：

将地高辛标记好的探针作一系列的稀释，点到一条尼龙膜上，同时用地高辛标记的control DNA作对照标准，120℃固定30分钟；然后用地高辛抗体免疫检测，按BNT/BCIP显色步骤显色；比较显色结果，选择带有可以接受的背景的最高探针浓度做正式的杂交。操作步骤如下：

1)根据表1 DIG-High Prime DNA标记及检测试剂盒理想条件下探针的标记

产量将标记的探针稀释到1ng/μl，将试剂盒提供的control DNA稀释到1ng/μl (原始浓度是5ng /μl)，然后按照表2作一系列的稀释探针及control DNA

表1 DIG-High Prime DNA标记及检测试剂盒理想条件下探针标记产量

表

2)将上述稀释的2-9 号管的control DNA 及探针DNA各取1μl点膜

3)120℃固定30分钟或紫外交链3-5分钟

4)将膜放入装有20ml Maleic acid buffer 的塑料器皿中，室温振荡2分

钟

5)将膜放入10ml Blocking solution中室温温育30分钟

6)将膜放入10ml Antibody solution 中室温温育30分钟

7)用10ml Washing buffer 洗2次，每次15分钟

8)在10ml Detection buffer 平衡2-5分钟

9)将膜放入2ml 新配制的Color substrate solution 中暗室条件下显色。

显色过程中不要摇动或振荡

10)当斑点或带显示出来后，用50ml灭菌的双蒸水洗膜5分钟，照相

染色至0.1pg的Control DNA出现斑点，比较标记的探针与Control DNA 染色情况计算出地高辛标记的DNA 的量：如果0.1pg的探针及对照稀释点都显色，则探针标记理想；如果0.1pg的对照显色， 0.1pg的标记探针没显色，但0.3pg 显色，则计算探针浓度（约为理想浓度的1/3）以确定杂交时加多少探针（25ng 探针/ml杂交液）；如果0.1pg的对照显色，但标记探针0.3pg的斑点没显色，则应重新标记探针。

（转膜被省略。）

去嘌呤缓冲液：place the gel in a plastic tray.cover with 250 mM HCl.

agitate gently until the bromophenol blue dye turns yellow (5 minutes).

agitate a further 15 minutes and rinse with distilled water.

碱变性液：1.5 mol/L NaCl, 0.5 mol/L NaOH

中和液：0.5 mol/L Tris-HCL(pH=8.0),1.5 mol/L NaCl

20×SSC：2 mol/L NaCl, 0.3 mol/L 柠檬酸钠（pH=7.0）

2×SSC：0.3 mol/L NaCl, 0.03 mol/L柠檬酸钠（pH=7.0）

关于凝胶处理：

1，凝胶放入大培养皿，加变性液没过凝胶，脱色摇床轻微摇动，1h，期间更换一次变性液；

2，倾倒变性液，用无菌超纯水漂洗一次；

3，（先清洗培养皿），加中和液，脱色摇床轻微摇动，1h，期间更换一次中和液；

关于印记：

1，取方玻璃盘，加入适量20×SSC；

2，在方盘上架一玻璃板（注意清洁），玻璃板上铺一Whatman 3MM 滤纸，两端没入20×SSC中，滤纸和玻璃板之间不要留有气泡；

3，取中和后的凝胶，点样孔向下地放在Whatman 3MM滤纸上，用玻璃棒滚动去除胶与滤纸之间的气泡；

4，剪一块与胶大小一致的尼龙膜（带正电荷），放在无菌超蒸水表面，使之自然吸水下沉；