[生物学]地高辛标记系统

检测流程
将地高辛标记好的探针系列稀释，点到一 条尼龙膜上，同时用地高辛标记的control DNA作对照标准，120ºC固定30分钟；
用地高辛抗体免疫检测，按BNT/BCIP显色 步骤显色；
比较显色结果，选择带有可以接受的背景 的最高探针浓度做正式的杂交。
试剂准备（1）
Washing buffer: 0.1M Maleic acid, 0.15M NaCl; pH 7.5(20℃); 0.3%(v/v) Tween20. 15-25℃ stable. Removal of unbound antibody.
用作探针模板的DNA应是线型的，大于100bp，如果模板 DNA >5kb则应用4碱基的限制性内切酶切割成较小片段 （切割后要纯化）
模板的量：10ng-3μg，如果要检测复杂基因组中的单拷贝 基因，标记模板的最低量要300ng（探针浓度：25ng/ml 杂交液）
如果做基因组DNA southern blotting, 应将克隆倒载体上 的DNA 酶切后琼脂糖电泳分离或PCR扩增，得到的片段 都需要用试剂盒纯化
迅速冰浴冷却。 充分混匀DiG-high Primer （1#管），并取4 µ l至
变性DNA管，混匀并离心。 37 ºC温育1小时或过夜（最大到不超过20小时）。 停止反应，加2 µ l 0.2M EDTA（pH 8.0）或65 ºC
加热10分钟。
本次实验标记步骤(10µl)
将300ng 模板DNA用无菌去离子水补足至8 µ l。 沸水浴或干浴98 ºC 10分钟，使DNA变性成单链
地高辛标记的dUTP
地高辛标记系统的特点
标记和检测技术安全 标记的探针稳定可以保存一年 杂交液可以反复使用数次
与放射性同位素标记方法相同之处
标记和杂交技术相似 高灵敏度 低背景 可以标记DNA、RNA 或Oligonucleotides
与放射性同位素标记方法不同之处
无害,安全 产生的废物不需特殊处理 需要分析的时间短 探针稳定
Antibody solution(Ab) solution : 将4#试剂离心，按1： 5000或1：10000加入Blocking solution，2-8 ºC可放12小 时。（每10ml Blocking solution 加1ul Ab抗体即可）.与 地高辛标记的探针结合。
探针的标记
地高辛标记源自文库统
常用标记物分类
放射性同位素标记
非放射性标记 荧光素标记 生物素标记 地高辛标记
地高辛（DIG）是灵敏度高、非放射性核酸 标记检测体系。DIG检测灵敏度接近同位素 而无放射性危险、相比荧光则不需要特殊 检测设备，相比生物素则没有样本内源干 扰之苦，很适合用于核酸非放标记检测。
Maleic acid buffer: 0.1M Maleic acid, 0.15M NaCl; adjust with NaOH(solid) to pH 7.5(20℃)0 15-25℃ stable. Dilution of Blocking solution.
Detection buffer: 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, pH 9.5(20℃). 15-25℃ stable. Ajustment of pH to 9.5.
DIG-dUTP:dTTP的理想比例1：3 20-25bp 可插入一个DIG-dUTP
随机引物法标记的探针是基于模板的不同 区段、不同长度的DNA 片段
可以探测0.03-0.1pgDNA
标记步骤(20µl)
将10ng-1µg 模板DNA用无菌去离子水补足至16µ l。 沸水浴或干浴98 ºC 10分钟，使DNA变性成单链并
地高辛标记与检测的原理
利用不同的方法将Digoxigenin-11-dUTP掺入到新 合成的探针DNA 或RNA链中或寡核苷酸的末端
探针与目标DNA杂交后，用连接有碱性磷酸酶或 其它偶联物的地高辛的抗体检测地高辛标记的探 针
根据地高辛抗体连接的偶合物不同，利用荧光检 测（anti-DIG-fluorescein，rhodamine)、化学发 光检测(anti-DIG-AP and CSPD or CPD-star)或显 色（anti-DIG-AP and NBT/BCIP or other substrates))的方法将探针杂交的位置显现出来
操作基本要求
工作环境及试剂要干净：（1）试剂要高 压灭菌；（2）含有SDS 的试剂要过滤灭 菌；（3）TWEEN20应加到预先灭菌过的 试剂中
用具要干净：用之前一定要清洗得非常干 净
操作尼龙膜时要小心（1）戴无尘手套； （2）用干净的镊子夹取膜的边缘
探针模板DNA的要求
质粒DNA纯度要高。最好用高纯度的质粒DNA 分离和纯 化试剂盒纯化质粒模板或用苯酚/氯仿抽提去除残留的蛋 白质。纯化后的模板用H2O 溶解
并迅速冰浴冷却。 充分混匀DiG-high Primer （1#管），并取2 µ l
至变性DNA管，混匀并离心。 37 ºC温育1小时或过夜（最大到不超过20小
时）。 停止反应，65 ºC加热10分钟。
探针标记效率检测
目的是确定杂交中使用正确的探针量，探 针用量太多会引起背景太深，用量太少则 无杂交或杂交很弱
TE buffer: 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0. 15-25℃ stable. Stopping color reaction.
试剂准备（2）
Blocking solution :用Maleic acid buffer 10×稀释试剂6# （10×Blocking solution ），成1×的工作液，即每9ml Maleic acid buffer中加入1ml 10×Blocking solution 混匀， 现配现用。封闭膜上非特异性结合位点
随机引物标记
利用随机引物标记的方法将 Digoxigenin11-dUTP掺入到新合成的DNA 链中。
反应体系中包含六碱基随机引物、dNTP(含 有碱性条件下不稳定的Digoxigenin-11dUTP，Klenow 酶及反应所需的Buffer
DNA的地高辛标记和检测步骤
探针DNA 的标记及标记效率测定 DNA的转移和固定 杂交 免疫测定 洗去膜上探针再次杂交