地高辛随机引物法标记探针的Southern杂交技术优化
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1. 3 试剂 碱转液 : 1 mol/L NaC l, 0. 4 mol/L NaOH; 漂
洗液 : 2 ×SSC; 琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒 (北 京天根生物公司 ) ; 限制性内切酶 (美国 Promega 公司 ) ; D IG H igh Prime DNA Labeling and Detec2 tion Starter kitⅡ (罗氏公司 ) ; Hybond2N + (带正 电荷 ) 尼龙膜 (英国 Am ersham Pharm acia biotech 公司 ) 。质 粒 pG4AB , 本 实 验 室 保 存 ; X 光 片 , ( Kodark公司 ) ; 正向引物 B T12F: 5′2ATGGACTG2 CAGGCCATACAACTGC23′; 反 向 引 物 BT12R: 5′2 GCGGA GGGCAA GTTA GAA GA GGTTCCA TA GGCG2 3′,由上海生工工程公司合成 。
转膜结束后 ,将尼龙膜取下 ,用 2 ×SSC浸洗 两次 ,每次 5 m in,将膜洗至中性 ,并除去膜上的杂 质及琼脂糖碎片 。 1. 4. 5 固定 (此步骤选用 ) 将湿润的尼龙膜置 于干燥的滤纸上 ,在紫外交联仪中将转有 DNA 的 一面向上 ,以 1. 2 J / cm2交联 ,或者 120℃烘烤 0. 5 h或 80℃烘烤 2 h。尼龙膜暂不杂交时 ,可在 4℃ 下保存备用 (存放时间不宜超过半年 ) 。 1. 4. 6 杂交及显影 杂交及显影过程均按照罗 氏地高辛检测试剂盒的操作手册进行 ,略有改动 。
从事棉花基因工程研究 。 E2mail: gsdui@mail. caas. net. cn
124
中国农业科技导报
11卷
细阐述 ,致使许多实验室获得的杂交结果并不能 令人满意 。因此本研究以 6 个不同的 B t抗虫棉 品种为材料 ,参考前人方法 ,并结合大量的实践经 验 ,优化了地高辛标记探针的 Southern杂交方法 。
图 1 使用未纯化的探针进行 Southern杂交 F ig. 1 Southern blotting w ith unpurified p robe. M: DNA marker; 1:线性化的阳性质粒 ; 2 ～6: B t抗虫棉 DNA; 7:非转基因棉花 DNA. M: DNA marker; 1: Positive linearized p lasm id; 2 ～6: B t
将经碱性转移液浸泡的 W aterman 3 mm 滤纸 置于真空转印仪的多孔屏之上 ,然后将膜放到滤 纸上 ,再将中部裁成方孔的塑料衬垫置于膜和多 空屏上 ,方孔的每一边略比膜窄 5 mm ,按下密封 框 ,最后将凝胶放到膜上 ,倒入碱转液 ,液体要没 过凝胶 。开启真空泵 ,调节进气阀 ,使真空度维持 在 2 in. Hg (约 50 mm 水柱 ) ,真空转印 90 m in 后 ,再将真空度调至 5 in. Hg维持 30 m in。
(OD260 /OD280 = 1. 8～2. 1) 。棉花的基因组较大 , 要获得较强的杂交信号 ,样品 DNA 量在 30μg左 右为宜 。本实验采用改良 CTAB 法 [ 10 ]提取 DNA , 延长样品在 55℃提取液中水浴时间至 3 h,提取 的棉花基因组 DNA 量大 ,完整性好 ,如图 3。提 取多个样品需通过电泳或紫外分光光度计来保证 各样品之间的 DNA 含量基本相同 ,使杂交信号强 度一致 ,有可比性 。
使用 DNA 回收试剂盒进行回收 ,回收产物中 会携带一定量的凝胶小颗粒 。如果不纯化就直接 进行标记 ,这些凝胶小颗粒就会吸附探针并且结
4期
周长发等 :地高辛随机引物法标记探针的 Southern杂交技术优化
125
合到杂交膜上 ,显色后形成小黑点或小黑块样的 背景 (如图 1) ,影响杂交结果观察 。因此必须进 一步纯化回收产物或使用 0. 22 μm 的醋酸纤维 素膜预先将杂交液过滤 ,去除标记探针中的凝胶 小颗粒 ,可极大地降低背景值 ,获得较好的杂交 结果 。
Technolog ica l Im provem en t of Southern Blot Using D igox igen in 2labeled Probes w ith Random 2pr im ed M ethod
ZHOU Zhang2fa1, 2 , ZHANG Rui1 , ZHANG X iao2 , LUO Shu2p ing2 , GUO San2dui1
Southern 杂交是分析基因结构或检测 DNA 中是否含有特定序列的有效技术之一 , 1975年由 Southern E M 首创 [ 1 ] ,取其姓氏而命名 。该方法 是对转基因植株进行分子生物学鉴定的经典方 法 ,可在 DNA 水平上检测外源基因是否转入并整 合到植物染色体上 。 Southern杂交中探针有同位 素标记或非同位素标记 ,其中非同位素标记系统 主要有地高辛标记系统和生物素标记系统 。地高 辛标记系统与生物素标记系统相比 ,地高辛一般 不存在生物体中 ,因而消除了内源性背景 。随着 化学发光底物的运用与不断的改进 ,地高辛标记 系统灵敏度不断增强 ,甚至超过放射性同位素标 记系统 [ 2, 3 ] ,因而大多数实验室已将此项技术运
2 结果与分析
2. 1 探针的纯化及标记效率检测 采用随机引物法标记探针 ,探针模板的纯度
和含量直接影响标记探针的纯度和标记效率 。在 琼脂糖凝胶电泳回收单一目的条带时 ,一般回收 的探针量为 10 ng～3 μg。本实验发现探针量在 300～500 ng时 ,标记的探针浓度适宜 ,杂交时能 较好地控制标记探针加入量 。探针量过低或过 高 ,可导致标记效率过低或过高 ,均不利于控制杂 交时标记探针的加入量 。
(1. 中国农业科学院生物技术研究所 , 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程 , 北京 100081; 2. 新疆农业大学农学院 , 乌鲁木齐 830052)
摘 要 :为检测转基因抗虫棉中的 B t C ry1A 基因的表达 ,采用地高辛随机引物法标记探针 、化学发光检测的 Southern杂交技术 ,通过纯化探针 、使用最适探针浓度 、优化真空转印 、杂交及免疫检测方法等一系列优化过 程 ,最终得到背景低 、信号强的 Southern杂交结果 。 关键词 :地高辛 ;化学发光法检测 ;转基因作物 中图分类号 : Q781 文献标识码 : A 文章编号 : 100820864 (2009) 0420123206
收稿日期 : 2009204229;修回日期 : 2009206230 基金项目 :国家转基因生物新品种培育科技重大专项 (2008ZX080052004)资助 。 作者简介 :周长发 ,硕士研究生 ,主要研究方向为植物基因工程 。 E2mail: zhou. chang. fa@163. com。通讯作者 :郭三堆 ,研究员 ,主要
Abstract: Southern blot using digoxigenin (D IG) 2labeled p robes w ith random 2p rimed method and chem ilum inescent detection was used to detect B t C ry1A gene of transgenic insect2resistant cotton. A serial of p rocedure was modified by purifying the D IG2labeled p robes, using op timum p robes concentration, imp roving the p rocess of vacuum transferring, hybridization and immunoassay. Finally, we achieved good Southern blot result w ith low background and high sensi2 tivity. Key words: digoxigenin; chem ilum inescent detection; transgenic p lant
1. 4 方法 1. 4. 1 探针标记 以质粒 pG4AB 为模板 , BT12 F和 B T12R 为引物 PCR 扩增约 1. 2 kb的 B t基因 片段 ,琼脂糖电泳回收目的片段 ,采用随机引物法 标记 B t探针 。 1. 4. 2 棉花基因组 DNA 的提取 采用改良的 CTAB 法 [ 10 ]进行提取 ,略加改动 。 1. 4. 3 样品酶切及电泳 400 μL 酶切体系中含 30 μg 棉 花 DNA、300 U 限 制 性 内 切 酶 、40 μL 10 ×buffer,加 ddH2 O 补至 400μL ,酶切 16 h后取 4μL 电泳 ,观察棉花 DNA 是否酶切彻底 。然后 加 1 /10倍体积的 3 mol/L 的乙酸钠 , 0. 6～1倍体 积预冷的异丙醇 ,混匀 , 12 000 g离心 10 m in,沉 淀用 35 μL ddH2 O 溶 解 , 加 5 μL 10 ×loading
buffer轻轻 混 匀 , 65℃水 浴 10 m in, 迅 速 至 冰 上 2～5 m in。将 DNA 上样到 0. 8%凝胶孔中 , 40 V 电泳 12 h。 1. 4. 4 转膜 切大小合适的带正电荷尼龙膜 ,将 膜浸入 ddH2 O 中至完全浸湿 ,然后转入碱性转移 液中 ( 0. 4 mol/L NaOH , 1 mol/L NaCl) 至 少 5 m in,切去一角做方位标记 。将凝胶浸泡在碱性转 移缓冲液中 ,变性 30 m in,室温下轻轻震荡 。
用在转基因植物 [ 4, 5 ] 、动物 [ 6, 7 ]及分子标记 [ 8 ]等研 究方面 。
因为外源基因在转基因植物基因组中的排布 形式和载体骨架的整合方式与外源基因的遗传稳 定性和生物安全性密切相关 ,而 Southern杂交能 够分析 T2DNA 和载体骨架的不同区段在转基因 生物基因组中的整合与排列方式 ,以及多拷贝外 源基因在转基因生物基因组的整合及遗传行 为 [ 9 ] ,所以我国从转基因生物的安全出发 ,要求 转基因生物安全性评价报告中要包括外源基因的 Southern杂交结果 。但 Southern 杂交步骤繁琐 , 许多适宜国内实验室的细节 、注意事项并未在地 高辛标记探针的 Southern杂交试剂盒说明书中详
中国农业科技导报 , 2009, 11 (4) : 123 - 128 Journal of Agricultural Science and Technology
地高辛随机引物法标记探针的 Southern杂交技术优化
周长发 1, 2 , 张 锐 1 , 张 晓 1 , 罗淑萍 2 , 郭三堆 1
( 1. B iotechnology Research Institute, National Key Facility of Crop GΒιβλιοθήκη Baidune Resources and Genetic Imp rovement, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081; 2. Xinjiang Agricultural University, College of Agriculture, U rumqi 830052, China)
1 材料与方法
1. 1 材料 不同品种的 B t抗虫棉 。
1. 2 主要仪器 HYBA ID 杂交炉 (英国 ) ; 785型真空转印仪 、
电泳仪 、电泳槽 、凝胶成像系统 (B io2Rad 公司 ) , 紫外交联仪 CL 21000 U ltraviolet Ccrosslinker (美国 UVP公司 ) 。
洗液 : 2 ×SSC; 琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒 (北 京天根生物公司 ) ; 限制性内切酶 (美国 Promega 公司 ) ; D IG H igh Prime DNA Labeling and Detec2 tion Starter kitⅡ (罗氏公司 ) ; Hybond2N + (带正 电荷 ) 尼龙膜 (英国 Am ersham Pharm acia biotech 公司 ) 。质 粒 pG4AB , 本 实 验 室 保 存 ; X 光 片 , ( Kodark公司 ) ; 正向引物 B T12F: 5′2ATGGACTG2 CAGGCCATACAACTGC23′; 反 向 引 物 BT12R: 5′2 GCGGA GGGCAA GTTA GAA GA GGTTCCA TA GGCG2 3′,由上海生工工程公司合成 。
转膜结束后 ,将尼龙膜取下 ,用 2 ×SSC浸洗 两次 ,每次 5 m in,将膜洗至中性 ,并除去膜上的杂 质及琼脂糖碎片 。 1. 4. 5 固定 (此步骤选用 ) 将湿润的尼龙膜置 于干燥的滤纸上 ,在紫外交联仪中将转有 DNA 的 一面向上 ,以 1. 2 J / cm2交联 ,或者 120℃烘烤 0. 5 h或 80℃烘烤 2 h。尼龙膜暂不杂交时 ,可在 4℃ 下保存备用 (存放时间不宜超过半年 ) 。 1. 4. 6 杂交及显影 杂交及显影过程均按照罗 氏地高辛检测试剂盒的操作手册进行 ,略有改动 。
从事棉花基因工程研究 。 E2mail: gsdui@mail. caas. net. cn
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中国农业科技导报
11卷
细阐述 ,致使许多实验室获得的杂交结果并不能 令人满意 。因此本研究以 6 个不同的 B t抗虫棉 品种为材料 ,参考前人方法 ,并结合大量的实践经 验 ,优化了地高辛标记探针的 Southern杂交方法 。
图 1 使用未纯化的探针进行 Southern杂交 F ig. 1 Southern blotting w ith unpurified p robe. M: DNA marker; 1:线性化的阳性质粒 ; 2 ～6: B t抗虫棉 DNA; 7:非转基因棉花 DNA. M: DNA marker; 1: Positive linearized p lasm id; 2 ～6: B t
将经碱性转移液浸泡的 W aterman 3 mm 滤纸 置于真空转印仪的多孔屏之上 ,然后将膜放到滤 纸上 ,再将中部裁成方孔的塑料衬垫置于膜和多 空屏上 ,方孔的每一边略比膜窄 5 mm ,按下密封 框 ,最后将凝胶放到膜上 ,倒入碱转液 ,液体要没 过凝胶 。开启真空泵 ,调节进气阀 ,使真空度维持 在 2 in. Hg (约 50 mm 水柱 ) ,真空转印 90 m in 后 ,再将真空度调至 5 in. Hg维持 30 m in。
(OD260 /OD280 = 1. 8～2. 1) 。棉花的基因组较大 , 要获得较强的杂交信号 ,样品 DNA 量在 30μg左 右为宜 。本实验采用改良 CTAB 法 [ 10 ]提取 DNA , 延长样品在 55℃提取液中水浴时间至 3 h,提取 的棉花基因组 DNA 量大 ,完整性好 ,如图 3。提 取多个样品需通过电泳或紫外分光光度计来保证 各样品之间的 DNA 含量基本相同 ,使杂交信号强 度一致 ,有可比性 。
使用 DNA 回收试剂盒进行回收 ,回收产物中 会携带一定量的凝胶小颗粒 。如果不纯化就直接 进行标记 ,这些凝胶小颗粒就会吸附探针并且结
4期
周长发等 :地高辛随机引物法标记探针的 Southern杂交技术优化
125
合到杂交膜上 ,显色后形成小黑点或小黑块样的 背景 (如图 1) ,影响杂交结果观察 。因此必须进 一步纯化回收产物或使用 0. 22 μm 的醋酸纤维 素膜预先将杂交液过滤 ,去除标记探针中的凝胶 小颗粒 ,可极大地降低背景值 ,获得较好的杂交 结果 。
Technolog ica l Im provem en t of Southern Blot Using D igox igen in 2labeled Probes w ith Random 2pr im ed M ethod
ZHOU Zhang2fa1, 2 , ZHANG Rui1 , ZHANG X iao2 , LUO Shu2p ing2 , GUO San2dui1
Southern 杂交是分析基因结构或检测 DNA 中是否含有特定序列的有效技术之一 , 1975年由 Southern E M 首创 [ 1 ] ,取其姓氏而命名 。该方法 是对转基因植株进行分子生物学鉴定的经典方 法 ,可在 DNA 水平上检测外源基因是否转入并整 合到植物染色体上 。 Southern杂交中探针有同位 素标记或非同位素标记 ,其中非同位素标记系统 主要有地高辛标记系统和生物素标记系统 。地高 辛标记系统与生物素标记系统相比 ,地高辛一般 不存在生物体中 ,因而消除了内源性背景 。随着 化学发光底物的运用与不断的改进 ,地高辛标记 系统灵敏度不断增强 ,甚至超过放射性同位素标 记系统 [ 2, 3 ] ,因而大多数实验室已将此项技术运
2 结果与分析
2. 1 探针的纯化及标记效率检测 采用随机引物法标记探针 ,探针模板的纯度
和含量直接影响标记探针的纯度和标记效率 。在 琼脂糖凝胶电泳回收单一目的条带时 ,一般回收 的探针量为 10 ng～3 μg。本实验发现探针量在 300～500 ng时 ,标记的探针浓度适宜 ,杂交时能 较好地控制标记探针加入量 。探针量过低或过 高 ,可导致标记效率过低或过高 ,均不利于控制杂 交时标记探针的加入量 。
(1. 中国农业科学院生物技术研究所 , 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程 , 北京 100081; 2. 新疆农业大学农学院 , 乌鲁木齐 830052)
摘 要 :为检测转基因抗虫棉中的 B t C ry1A 基因的表达 ,采用地高辛随机引物法标记探针 、化学发光检测的 Southern杂交技术 ,通过纯化探针 、使用最适探针浓度 、优化真空转印 、杂交及免疫检测方法等一系列优化过 程 ,最终得到背景低 、信号强的 Southern杂交结果 。 关键词 :地高辛 ;化学发光法检测 ;转基因作物 中图分类号 : Q781 文献标识码 : A 文章编号 : 100820864 (2009) 0420123206
收稿日期 : 2009204229;修回日期 : 2009206230 基金项目 :国家转基因生物新品种培育科技重大专项 (2008ZX080052004)资助 。 作者简介 :周长发 ,硕士研究生 ,主要研究方向为植物基因工程 。 E2mail: zhou. chang. fa@163. com。通讯作者 :郭三堆 ,研究员 ,主要
Abstract: Southern blot using digoxigenin (D IG) 2labeled p robes w ith random 2p rimed method and chem ilum inescent detection was used to detect B t C ry1A gene of transgenic insect2resistant cotton. A serial of p rocedure was modified by purifying the D IG2labeled p robes, using op timum p robes concentration, imp roving the p rocess of vacuum transferring, hybridization and immunoassay. Finally, we achieved good Southern blot result w ith low background and high sensi2 tivity. Key words: digoxigenin; chem ilum inescent detection; transgenic p lant
1. 4 方法 1. 4. 1 探针标记 以质粒 pG4AB 为模板 , BT12 F和 B T12R 为引物 PCR 扩增约 1. 2 kb的 B t基因 片段 ,琼脂糖电泳回收目的片段 ,采用随机引物法 标记 B t探针 。 1. 4. 2 棉花基因组 DNA 的提取 采用改良的 CTAB 法 [ 10 ]进行提取 ,略加改动 。 1. 4. 3 样品酶切及电泳 400 μL 酶切体系中含 30 μg 棉 花 DNA、300 U 限 制 性 内 切 酶 、40 μL 10 ×buffer,加 ddH2 O 补至 400μL ,酶切 16 h后取 4μL 电泳 ,观察棉花 DNA 是否酶切彻底 。然后 加 1 /10倍体积的 3 mol/L 的乙酸钠 , 0. 6～1倍体 积预冷的异丙醇 ,混匀 , 12 000 g离心 10 m in,沉 淀用 35 μL ddH2 O 溶 解 , 加 5 μL 10 ×loading
buffer轻轻 混 匀 , 65℃水 浴 10 m in, 迅 速 至 冰 上 2～5 m in。将 DNA 上样到 0. 8%凝胶孔中 , 40 V 电泳 12 h。 1. 4. 4 转膜 切大小合适的带正电荷尼龙膜 ,将 膜浸入 ddH2 O 中至完全浸湿 ,然后转入碱性转移 液中 ( 0. 4 mol/L NaOH , 1 mol/L NaCl) 至 少 5 m in,切去一角做方位标记 。将凝胶浸泡在碱性转 移缓冲液中 ,变性 30 m in,室温下轻轻震荡 。
用在转基因植物 [ 4, 5 ] 、动物 [ 6, 7 ]及分子标记 [ 8 ]等研 究方面 。
因为外源基因在转基因植物基因组中的排布 形式和载体骨架的整合方式与外源基因的遗传稳 定性和生物安全性密切相关 ,而 Southern杂交能 够分析 T2DNA 和载体骨架的不同区段在转基因 生物基因组中的整合与排列方式 ,以及多拷贝外 源基因在转基因生物基因组的整合及遗传行 为 [ 9 ] ,所以我国从转基因生物的安全出发 ,要求 转基因生物安全性评价报告中要包括外源基因的 Southern杂交结果 。但 Southern 杂交步骤繁琐 , 许多适宜国内实验室的细节 、注意事项并未在地 高辛标记探针的 Southern杂交试剂盒说明书中详
中国农业科技导报 , 2009, 11 (4) : 123 - 128 Journal of Agricultural Science and Technology
地高辛随机引物法标记探针的 Southern杂交技术优化
周长发 1, 2 , 张 锐 1 , 张 晓 1 , 罗淑萍 2 , 郭三堆 1
( 1. B iotechnology Research Institute, National Key Facility of Crop GΒιβλιοθήκη Baidune Resources and Genetic Imp rovement, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081; 2. Xinjiang Agricultural University, College of Agriculture, U rumqi 830052, China)
1 材料与方法
1. 1 材料 不同品种的 B t抗虫棉 。
1. 2 主要仪器 HYBA ID 杂交炉 (英国 ) ; 785型真空转印仪 、
电泳仪 、电泳槽 、凝胶成像系统 (B io2Rad 公司 ) , 紫外交联仪 CL 21000 U ltraviolet Ccrosslinker (美国 UVP公司 ) 。