免疫组化操作规程(王华)

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免疫组化操作流程

免疫组化操作流程免疫组化是一种常用的实验方法，用于检测细胞或组织中是否存在其中一种抗原或蛋白质，并进一步定位其在细胞或组织中的分布情况。

下面是免疫组化的一般操作流程：1.样本制备：a.细胞培养：对于体外培养的细胞，将其定植在培养皿中，使其附着在载玻片上。

b.组织切片：将组织固定、石蜡包埋后，用切片机将其切割成小片。

2.抗原修复：a.细胞：用4%的甲醛或冰醋酸将细胞固定，然后用PBS（磷酸缓冲盐溶液）进行洗涤。

b. 组织：将石蜡包埋的组织切片用xylene去除石蜡，并通过一系列浓度递减的酒精进行洗涤。

3.抗体选择和制备：a.选择合适的一抗体与待检测的目标蛋白或抗原有特异性结合。

b.对于小分子抗原，可以直接用抗体进行染色。

对于较大的蛋白质抗原，需要通过特殊方法将抗体标记。

4.抗体染色：a.细胞：将细胞孵育在含有一抗体的PBS中，并进行特定时间的孵育，然后通过洗涤去除未结合的抗体。

b.组织：将抗体加到待检的组织切片上，经过适当的孵育时间，然后通过洗涤去除未结合的抗体。

5.反应显色：a.一抗染色：根据抗体的结合情况，选择适合的检测方法，如发光、颜色显现等。

b.二抗染色：对于无法直接检测的一抗染色结果，需要加入二抗，二抗可以与一抗特定的Fc部分结合，形成复合物。

二抗通常被标记为酶，可以与底物反应产生颜色或发光。

6.显微镜观察：a.细胞：将染好的细胞载玻片通常先底片固定，然后在显微镜下观察并拍照。

b.组织：将染好的组织切片在载玻片上，然后将其加入显微镜下观察，并通过摄影或记录图像。

7.数据分析和结果解读：a.根据具体的研究目的，对显微镜下观察到的结果进行统计和分析。

b.根据染色的结果和显微镜下观察到的细胞或组织分布情况，对目标蛋白或抗原的表达进行解读。

总结：免疫组化是一种重要的实验方法，可用于检测和定位细胞或组织中的目标蛋白或抗原。

操作流程包括样本制备、抗原修复、抗体选择和制备、抗体染色、反应显色、显微镜观察、数据分析和结果解读。

免疫组化操作规程及操作流程

免疫组化操作规程一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。

它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。

二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。

三、试剂配制1. 0.01 M PBS(pH 7.34 )：9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB 加双蒸水至1000 ml；1000 ml0.2M PB (pH 7.4)＝5.93 g NaH 2 PO 4 ·2H 2 O＋58.02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 双蒸水或＝190 ml A + 810 ml B（A. 0.2 M NaH 2 PO 4 ·2H 2 O：15.6 g in 500 ml ddH 2 O；B. 0.2M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O：71.632 g in 1000 ml dH 2 O）。

2. Citrate Buffered Saline（0.01 M 柠檬酸缓冲液，PH6.0）：28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O（A.Citrate acid（柠檬酸）：10.5 g 加双蒸水至1000 ml；B.Citrate sodium（柠檬酸钠）：29.41 g 加双蒸水至1000 ml）。

3. 细胞通透液：由终浓度分别为0.3%双氧水和0.3%Triton X-100 混合而成。

配制方法是先用微波加热的36 ml PBS，再接着加120 ul TritonX-100，并加热一会儿，冷却至临用前加0.4 ml 30％H 2 O 2 。

免疫组化操作步骤

免疫组化操作步骤
免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测和鉴定生物样本中的特定分子。

下面我会给出大致的免疫组化操作步骤，供你参考。

1.样本处理：将生物组织或细胞样本获取并处理成合适的形式，如切片或细胞悬液。

2.预处理：对于组织样本，可以使用甲醛等固定剂或冰冻保存。

对于细胞样本，也可以用1%的乙醇醋酸钠或甲醛冷冻保存。

3.抗原结构暴露：对于组织样本，可以使用抗原恢复液如缓冲盐水或热诱导抗原恢复等来暴露抗原结构。

对于细胞样本，可以用洗涤缓冲液洗涤，以去除细胞外蛋白质，并暴露出内部抗原。

4.阻断非特异性结合：使用非特异性结合物（如牛血清白蛋白、大肠杆菌蛋白等）进行阻断，以减少非特异性的背景信号。

5.抗体结合：加入目标抗体，与待测分子特异结合。

6.洗涤：洗涤掉未与抗体结合的废液，减少背景信号。

7.二抗结合：加入辣根过氧化物酶标记的二抗，与目标抗体结合，形成目标抗体-二抗复合物。

8.再次洗涤：冲洗掉未与二抗结合的废液，减少背景信号。

9.底物添加：加入染色底物，辣根过氧化物酶催化产生可见信号。

10.反应停止：停止底物活性，如加入酸性溶液。

11.显微镜观察：将样本放置在玻璃载玻片上，使用显微镜观察并记录结果。

12.图像分析：使用光学显微镜或荧光显微镜等设备获取图像，使用图像分析软件进行定量分析。

需要注意的是，实际操作中会根据具体的实验目的和技术要求进行适当的修改和调整。

免疫组化在科学研究和临床诊断中都有广泛应用，可以用于检测肿瘤标志物、病原体、免疫相关分子等，对于疾病诊断和治疗具有重要意义。

免疫组化法实验操作步骤

免疫组化法实验操作步骤步骤一：取材固定1.将需要处理的组织或细胞样本，如切片或离心沉淀等，放置在含有适当浓度的固定试剂（如4%的中性缓冲甲醛）中，使其固定。

2.这一步的目的是保持蛋白质的结构和形态，使其对后续步骤的抗体反应更加稳定。

步骤二：脱水和包埋1.将样本从固定试剂中洗涤，并逐渐转移到乙醇溶液中，以脱水。

2.将样本转移到适当浓度的透明剂（如甲基丙烯酸甲酯）中，使其透明化。

3.最后，将样本包埋在合适的固化剂（如尼龙、蜡、树脂等）中，以便后续的切片操作。

步骤三：切片和烘干1.使用组织切片机将样本以适当的厚度切成切片。

2.将切片放置在加热平台上，烘干以去除切片中的水分。

步骤四：抗体处理1.使用适当的抗体稀释液将抗体与切片接触。

抗体可为一抗或二抗，具体选择取决于实验需求。

2.将切片放置在含有抗体的湿润孵育盒中，使其与抗体反应。

孵育温度和时间取决于抗体的要求，一般在4℃下孵育过夜。

步骤五：洗涤1.将切片取出，并置于洗涤缓冲液中，用于去除未结合的抗体。

2.反复洗涤3-4次，每次至少5分钟，确保切片完全清洗。

步骤六：标记1.添加适当浓度的二抗，如辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，与已经结合的一抗反应。

2.孵育切片与二抗共反应，孵育温度和时间根据试剂的要求进行。

步骤七：显色和染色1.使用合适的显色剂将切片进行显色。

常见的显色剂有DAB（二氨基联苯氧化物）和VIP（有机磷染料）等。

2.彩色染色可根据实验需求进行，可以使用核染料如伊红、快速伊红等对细胞核进行染色。

步骤八：石蜡去除和封片1.将切片浸入去石蜡溶液中，去除石蜡。

2.使用适当稀释的巴豆胶溶液将切片封闭，确保切片在显微镜下观察时保持湿润。

步骤九：显微镜观察1.将封片放置在显微镜载物台上，使用适当放大倍率的显微镜观察切片。

2.观察切片的染色情况、抗体标记的结果等，记录并进行分析。

这些是一般的免疫组化法实验操作步骤，根据具体实验需求和试剂要求，可能会有一些细微的差异和额外的步骤。

免疫组化操作程序

免疫组化化学步法操作程序操作方法一、脱蜡1.将组织切片至于玻片加上，65°C烘箱烘烤30min，是石蜡完全熔融。

2.将烘烤充分的切片迅速置入二甲苯中，浸泡10min；取出切片沥干，置入第二缸二甲苯中，浸泡10min；取出切片沥干，置入第三缸二甲苯中，浸泡10min。

3.从二甲苯中取出切片，尽量沥干二甲苯，置入无水乙醇中，浸泡3min；取出，置入第二缸无水乙醇中，浸泡3min；取出切片，再依次置入90%、80%、70%酒精中梯度水化，各浸泡3min。

二、抗原修复（以EDTA为例）1.用流水冲洗切片1-2min，洗净切片表面的酒精；取出切片，用蒸馏水润洗切片表面2-3次，每次3-5min。

2.将切片置入已经在电饭煲（沸水浴）中预热充分的EDTA中，持续水浴煮沸20min，再将电饭煲切换至保温档保温10min。

3.取出修复盒，使其自然冷却至室温。

三、封闭1.取出切片，将切片至于玻片架上，用蒸馏水润洗表面的EDTA3次，每次3min。

2.用PH7.2的PBS缓冲液浸泡组织3次，每次3-5min。

3.将切片从玻片架上取出，用手甩去玻片上PBS缓冲液，并用吸水纸吸取组织外围的缓冲液（注意擦拭方式，以防抹掉玻片上的组织）。

4.将切片置于湿盒上，滴加5%的BSA，37°C培养箱孵育30-40min（或4°C冰箱孵育过夜）。

四、一抗孵育1.取出切片，将切片至于玻片架上，用蒸馏水润洗表面的BSA 3次，每次3min。

2.用PH7.2的PBS缓冲液浸泡组织3次，每次3-5min。

（步骤1. 2 可不做，可直接擦拭干净BSA滴加稀释好的一抗）3.按照一定的稀释比例，用抗体稀释液稀释抗体。

4.将切片从玻片架上取出，用手甩去玻片上PBS缓冲液，并用吸水纸吸取组织外围的缓冲液（注意擦拭方式，以防抹掉玻片上的组织）。

5.将切片置于湿盒上，滴加一抗50μl，37°C培养箱孵育60min（或4°C冰箱孵育过夜）。

免疫组化操作流程

1.脱蜡复水：
（1）石蜡切片浸泡在二甲苯中2次（分别置入两个装有二甲苯的染缸），每次10min；
（2）无水乙醇、95%、85%、75%、50%乙醇、纯水中依次放置5min；
（3）PBS缓冲液中浸泡5min。

2.抗原修复：
（1）加入H2O2，湿盒中孵育10min，PBS浸泡冲洗3次，每次5min；
（2）放入0.01M枸橼酸缓冲液中，微波炉大火加热至沸腾（保持8min）；
（3）待修复液温度降至室温，PBS冲洗2次，每次5min。

3.免疫反应：
（1）滤纸擦去多余的PBS，低价PBS稀释的10%正常山羊血清，室温下湿盒封闭30-60min；
（2）孵育结束后去除封闭液，滴加一抗工作液，4度孵育过夜；
（3）移去一抗工作液后，用PBS冲洗2次，每次10min，擦去切片周围多余液体；
（4）滴加二抗工作液，室温湿盒孵育30min，弃去二抗后PBS洗2次，每次10min。

4.化学染色：
（1）擦去切片上多余PBS，滴加新鲜配置的DAB工作液，湿盒孵育，显微镜检测染色程度；
（2）染色结束后PBS洗去DAB染液3次，每次5min；
（3）去除残留液体，苏木素复染25min；
（4）复染结束后，清水洗去，1%盐酸酒精中风化数秒，再次水洗。

5.脱水封片：
（1）依次将切片放入50%、75%、85%、95%乙醇和无水乙醇中，各放置5min；
（2）二甲苯中透明化处理2次，每次10min；
（3）脱水处理后，擦去周围液体，滴加几滴中性树胶，盖上盖玻片，用镊子钝端轻敲盖玻片以除去气泡。

免疫组化操作规程及操作流程

免疫组化操作规程及操作流程免疫组化技术是一种常用的细胞和组织学研究方法，广泛应用于病理学、生物学、药理学等领域。

下面将详细介绍免疫组化操作规程及操作流程。

一、实验前准备1.准备实验所需的试剂和试验设备，包括抗体、缓冲液、加标物、显色剂等。

2.检查免疫组化试剂的有效期，确保试剂的质量。

二、标本处理1.收集组织标本，如活检样本或动物组织。

2.快速处理标本，迅速取出，并选择适当的处理方法，如固定、包埋等。

3.处理过程中要避免标本的冻融、干燥等。

三、抗原回复1.对于经过固定的组织标本，使用抗原回复方法来恢复组织标本中的抗原活性。

2.选择适当的抗原回复方法，如热处理、酶解等。

四、非特异性结合阻断1.使用非特异性抗血清或蛋白质来阻断非特异性结合位点。

2.使非特异结合抗体活性降低，减少假阳性结果。

五、抗体处理2.优化抗体浓度，确保抗体与标本中的抗原结合。

3.对于特定抗体，可以进行荧光标记或酶标记等。

六、免疫组织染色1.用适当的缓冲液稀释抗体，并将其应用于组织标本上。

2.根据实验需求选择适当的孵育时间和温度。

3.利用显色剂或荧光显像剂对标本进行染色。

七、显微镜观察与分析1.将染色后的标本放置在显微镜下观察，并选择适当的增强荧光信号方法。

2.结合相关的正对照和负对照进行结果分析，确定一些蛋白质在组织中的表达情况。

3.分析结果并记录数据。

八、结果分析与报告1.根据观察结果，分析样本中目标抗原的表达情况。

2.比较不同样本之间的差异，得出结论并撰写实验报告。

九、实验后处理1.清洗使用过的实验工具和材料，避免交叉污染。

2.妥善处理废弃物和化学品，根据实验室内相应的安全操作规范进行处理。

免疫组化原理和步骤

免疫组化原理及步骤免疫组化操作规程一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学,就是指带显色剂标记得特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应与组织化学得呈色反应,对相应抗原进行定性、定位、定量测定得一项新技术。

它把免疫反应得特异性、组织化学得可见性巧妙地结合起来,借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)得显像与放大作用,在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。

二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器与通风橱等、三、试剂配制1、0。

01M PBS(ｐH 7.34 ):9.０g ＮａCl + ５0 mｌ０.2 M PB加双蒸水至１0０0ml;１000 mｌ0。

２M PB(ｐH7、4)＝5。

93 ｇＮaH２ＰＯ4 ·2Ｈ2 O+５8。

０2 g Na ２HPO 4 ·１2Ｈ 2 O in １000 ｍl双蒸水或=190ml A +810 ml B(A、０、2ＭＮaH 2 ＰO 4 ·2H ２O:15。

6 ｇｉn 500ml ddH 2 O;Ｂ。

０、2ＭNa 2 ＨPＯ 4 ·12H 2 O:７1、６32ｇin 1000 ｍl ｄH 2 O)。

2. Ｃｉｔrate Buｆfered Saliｎe(０。

01 M 柠檬酸缓冲液,PＨ6.０):28 ml A + 72 mｌB + ２00 mｌｄdＨ２Ｏ(Ａ。

Cｉtｒate aciｄ(柠檬酸):10.５g 加双蒸水至1０00ml;Ｂ。

C ｉtrate sodｉum(柠檬酸钠):29。

41 g 加双蒸水至1000 ml)、３、细胞通透液:由终浓度分别为0.3％双氧水与0、３%Trｉton X－100 混合而成。

配制方法就是先用微波加热得36ｍｌPBS,再接着加120 ｕｌＴritonＸ－10０,并加热一儿,冷却至临用前加0。

４ｍl 30％H 2 O 2 。

免疫组化操作规程

引言概述在免疫组化实验中，操作规程的制定和遵守对于获得稳定和准确的实验结果至关重要。

本文旨在介绍免疫组化操作规程的基本要点，以及在这些要点下的详细步骤和注意事项，以帮助研究人员在实验过程中取得良好的成果。

正文内容1.样本处理1.1采集样本1.1.1准备合适的样本收集工具1.1.2样本收集前的准备工作1.1.3样本收集技巧1.2样本保存与运输1.2.1样本保存条件1.2.2样本运输前的准备工作1.2.3样本运输技巧2.标本处理2.1标本固定2.1.1选择合适的固定剂2.1.2固定时间和温度的控制2.1.3固定过程中的操作技巧2.2组织切片制备2.2.1切片前准备工作2.2.2切片仪的选择和使用2.2.3切片制备的关键步骤3.免疫反应3.1抗原解蔽3.1.1解蔽试剂的选择和使用3.1.2解蔽时间和温度的控制3.1.3解蔽过程中的注意事项3.2抗体处理3.2.1抗体稀释比例的确定3.2.2抗体染色的时间和温度的控制3.2.3抗体处理过程的操作技巧3.3染色方法3.3.1直接染色法的步骤和注意事项3.3.2间接染色法的步骤和注意事项3.3.3特殊染色方法的选择和使用4.影像分析4.1显微镜检查4.1.1显微镜选择和调节4.1.2显微镜检查的技巧和注意事项4.2图像获取4.2.1数码相机的选择和设置4.2.2图像获取的技巧和注意事项4.3图像分析4.3.1图像处理软件的选择和使用4.3.2图像分析方法的选择和运用5.结果解释与报告5.1数据统计与分析5.1.1实验数据的整理与统计5.1.2数据分析的方法与工具5.2结果解释5.2.1实验结果的评估与解释5.2.2结果可能存在的误差和异常情况的识别与解决5.3报告撰写5.3.1报告结构和格式的要求5.3.2结果描述和讨论的撰写方法5.3.3参考文献的引用和列表的编写总结免疫组化操作规程在实验过程中起着至关重要的作用，本文详细介绍了样本处理、标本处理、免疫反应、影像分析以及结果解释与报告的相关内容。

免疫组化操作规程

免疫组化操作规程免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测和定位特定蛋白质、抗原或标记物在细胞或组织中的表达和分布情况。

它被广泛应用于病理学、生物学和医学研究中。

以下是一份免疫组化操作规程的示例，供参考。

一、实验前准备1.准备所需材料：组织切片、抗体、缓冲液等。

2.检查试剂和设备是否正常，确保实验所需材料的质量和有效性。

3.清洗工作台和实验器具，确保无细菌和异物。

4.根据实验需要，制定实验计划和操作流程，合理安排实验时间。

二、标本处理1.取出组织切片，将其置于洗涤缓冲液中浸泡，去除可能存在的阻碍抗体结合的物质。

2.如果组织切片需要去除蜡质包埋，可在60°C恒温水浴中使其溶解。

3.将样本置于蛋白酶解液中，进行抗原修复，以使抗原暴露。

三、抗体操作1.根据实验目的和样本特性选择合适的一抗和二抗。

2.确定一抗和二抗的工作浓度，一般根据厂家推荐进行稀释。

3. 将抗体加入到含有牛血清白蛋白和Triton X-100的缓冲液中，制成一抗溶液。

4.将一抗溶液加入组织切片上，使其充分覆盖，孵育时间根据抗体性质而定。

5.用洗涤缓冲液进行洗涤，去除未结合的抗体。

6.加入二抗，孵育一段时间以进行特异性结合。

7.再次用洗涤缓冲液进行洗涤。

四、染色和显微镜观察1.加入显色底物，使目标分子显示出颜色或荧光。

2.使用显微镜观察样本，以获得目标蛋白质的表达和分布信息。

3.根据需要进行图像获取和数据分析。

五、清洗和保存1.清洗实验用具和工作台，防止污染和交叉污染。

2.保存样本和显微镜图像的数据，方便后续分析和检索。

3.处理和处置废弃物，遵循相关安全和环保规定。

注意事项：1.实验操作时应穿戴实验服和手套，采取必要的安全措施，尽量避免直接接触有害试剂。

2.操作过程中严格按照冷链保存抗体，并避免其受到高温和臭氧等破坏因素。

3.各操作步骤中的温度、时间等参数应根据具体实验需要进行优化调整。

4.实验结果的解释需要结合正常组织和阴性对照进行比较和分析。

免疫组化操作规程

免疫组化操作规程
《免疫组化操作规程》
免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的技术，其操作规程的严谨性和标准化对于获得准确可靠的结果至关重要。

下面是一份免疫组化操作规程供参考：
1. 样本处理：将组织标本固定在适当的条件下，然后进行蜡包埋并切片。

注意保护好标本的完整性和质量。

2. 抗原修复：对标本进行适当的热处理或酶处理，以修复由于固定等步骤导致的抗原构象变化。

3. 抗体选择：选择适当的一抗和二抗，确保一抗的特异性和敏感性，二抗的来源和标记物的稳定性。

4. 标本处理：将切片标本进行脱脂、脱水和透明化处理，确保标本的透明度和形态保持完好。

5. 抗体染色：将标本与一抗和二抗分别反应，通过荧光标记或酶标记来检测靶标记的位置和强度。

6. 阅读结果：采用专业显微镜观察标本的染色结果，进行定量分析或者定性分析。

7. 结果验证：通过对照组和阳性对照进行染色结果的验证，确
保结果的准确性。

8. 结果分析：根据染色结果和临床信息进行综合分析，作出科学可靠的结论。

以上是一份免疫组化操作规程的基本内容，但在实际操作中还需要根据具体的实验室条件和要求进行进一步的细化和规范化。

希望这份规程能为从事免疫组化工作的科研人员和临床检验人员提供一些帮助。

免疫组化操作规程

二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。

三、试剂配制1. 0.01 M PBS(pH 7.34 )：9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB 加双蒸水至1000 ml；1000 ml 0.2M PB (pH 7.4)＝5.93 g NaH 2 PO 4 ·2H 2 O＋58.02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 双蒸水或＝190 ml A + 810 ml B（A. 0.2 M NaH 2 PO 4 ·2H 2 O：15.6 g in 500 ml ddH 2 O；B. 0.2M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O：71.632 g in 1000 ml dH 2 O）。

2. Citrate Buffered Saline（0.01 M 柠檬酸缓冲液，PH6.0）：28 ml A + 72 mlB + 200 mlddH 2 O（A.Citrate acid（柠檬酸）：10.5 g 加双蒸水至1000 ml；B.Citrate sodium（柠檬酸钠）：29.41 g 加双蒸水至1000 ml）。

3. 细胞通透液：由终浓度分别为0.3%双氧水和0.3%Triton X-100 混合而成。

配制方法是先用微波加热的36 ml PBS，再接着加120 ul TritonX-100，并加热一会儿，冷却至临用前加0.4 ml 30％H 2 O 2 。

免疫组化操作流程

免疫组化操作流程（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2. 水浴箱（二）、试剂1. PBS缓冲液（pH7.2―7.4）2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,pH 6.0,1000ml 3．0.5mol/L EDTA缓冲液（pH 8.0）4. 1mol/L的TBS缓冲液（pH 8.0）5. 酶消化液：a. 0.1%胰蛋白酶 b.0.4%胃蛋白酶液6. 3%甲醇―H2O2溶液7. 风裱剂：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH 9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS(PBS)配制8．TBS/PBS pH 9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本; pH 7.0-7.4适合光学纤维标本（三）、操作流程1、脱蜡和水化脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。

a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后再浸泡10分钟b 无水乙醇中浸泡五分钟c 95%乙醇中浸泡五分钟d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：A 抗原热修复a 高压热修复在沸水中加入EDTA(pH 8.0)或0.01mmol/L枸橼酸钠缓冲溶液（pH 6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。

将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。

10分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。

此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。

b 沸热修复电炉或水浴锅加热0.01枸橼酸钠缓冲液（pH 6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10-15分钟。

c 微波炉加热在微波炉里加热0.01枸橼酸钠缓冲液（pH 6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。

适用的抗原：Bcl-2.Bax.AR.PR.C-fos.x-jum.z-kit.c-myc.E-cadherin.ChromograninA.Cyclin.ER.Heatshock.Protein.HPV.Ki-67.MDMZ.P53.P34.P15.P-glycoprotein.PKC.PCNA.ras.Rb.等B 酶消化方法在抗原酶消化修复中，常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。

免疫组化法实验操作步骤

免疫组化法实验操作步骤免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)是一种利用抗体与组织中的抗原特异性结合的技术。

它是一种重要的研究方法，可以用于检测和定位组织中的特定蛋白质和其他生化分子。

以下是免疫组织化学实验的一般操作步骤：1.样本处理：a.固定：将待检测的组织样本进行固定处理，以保持其形态结构并保留组织内的抗原。

b.切片：将固定的组织样本切成非常薄的切片（通常为3-5微米厚），并将其放置在载玻片上。

2.抗原解蓝（抗原恢复）：a.对于不同类型的组织样本，选择适当的抗原解蓝方法。

b.抗原解蓝可以通过加热、酶解或其他方法来恢复组织样本中的抗原。

3.阻断非特异性结合：a. 使用一种非特异性的蛋白质来阻断载玻片上未特异性结合的位点，例如牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)或小鼠免疫球蛋白(Mouse IgG)。

b.加入适当浓度的阻断剂，并孵育片玻片上的切片，以阻断非特异性结合位点。

4.主抗体孵育：a.加入含有特定抗原的主抗体溶液，其可以与组织样本中特定的抗原结合。

b.孵育片玻片上的切片，使主抗体与待检测的抗原结合。

5.洗涤：a.用缓冲液或PBS等洗涤溶液洗涤载玻片上的切片，以去除未结合的主抗体。

6.二抗孵育：b.孵育片玻片上的切片，使辅助抗体与主抗体结合。

7.洗涤：a.再次用缓冲液或PBS洗涤载玻片上的切片，以去除未结合的辅助抗体。

8.信号放大：a.可根据需要，使用染色剂或底物来增强或显色识别待检测抗原的结合位置。

b.例如，使用荧光染料或酶底物，通过显微镜观察或光镜观察，可使抗原可视化。

9.洗涤：a.最后一次用缓冲液或PBS洗涤载玻片上的切片，以去除未结合的染色剂或底物。

10.封片：a.加入适当的封片剂，如富含丙酮的溶液，将载玻片上的切片封装起来，以保护切片和保存染色结果。

免疫组织化学是一种复杂的实验技术，需要仔细的操作和精确的控制条件才能得到准确的结果。

免疫组化操作规程及操作流程

免疫组化操作规程及操作流程免疫组化（immunohistochemistry，简称IHC）是一种利用抗体-抗原反应来检测组织中特定蛋白质表达的方法。

它广泛应用于医学研究和临床诊断中，常用于检测肿瘤标志物、免疫细胞浸润和病毒感染等。

I.免疫组化操作规程1.样本处理a.组织固定：将组织标本进行固定，一般使用10%中性缓冲福尔马林进行固定，固定时间一般为24-48小时。

b.去脂化：对于脂肪较多的组织，需要将其进行去脂处理，可使用二甲苯或其他去脂剂进行处理，处理时间一般为20-30分钟。

2.抗原恢复a.热诱导抗原恢复：将固定的组织样本放入蒸汽气锅中，用缓冲液浸泡标本，加热至高压下，进行抗原恢复处理。

具体温度和时间根据样本类型和抗体要求而定。

b.酶诱导抗原恢复：对于抗原蛋白固定后被交联、无法热诱导恢复的样本，可使用酶解剂（如胰蛋白酶）进行抗原恢复。

3.阻断非特异结合a.使用非特异结合阻断剂：在进行免疫染色之前，需要将非特异结合位点进行阻断，可使用蛋白质阻断剂，如牛血清蛋白（BSA）或鱼凝胶蛋白（FSG）等，在阻断液中孵育样本。

4.抗体反应a.一抗孵育：将目标抗体（一抗）稀释后，滴加于待检样本上，进行孵育，一般时间为1-2小时。

b.二抗孵育：选择免疫印迹试剂盒中对应一抗的二抗，将其稀释后，滴加于待检样本上，进行孵育，一般时间为30-60分钟。

5.染色和显色a.底物酶标：使用底物和酶的复合物，进行染色和显色反应。

常用的底物有DAB（二氨基苯），TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）等，反应时间一般为5-10分钟。

b.荧光染色：若使用荧光标记的二抗，需进行相应波长的激发光照射，观察荧光信号。

6.降解和清理a.用超纯水洗涤：使用超纯水进行标本洗涤，彻底清除底物和底物残留物。

b.孵育升级脱位溶液：将样本浸泡在脱位溶液中，使特异结合的抗体与抗原分离。

c.用盖玻片封装：涂上透明胶和玻片，使其固定在盖玻片上，并封住。

免疫组化标准操作规程

免疫组化标准操作规程
一、适用范围
适用于实验室从事免疫组化实验的实验技术人员和研究生。

（基于基础操作的流程化程序。

）
二、操作规程
1）石蜡切片，常规脱蜡至水；
2）0.3%或3%H2O2去离子水（无色液体）孵育10-30分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性；
3）蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟；
4）候选步骤：采用抗原修复-微波（建议30分钟内4次中火）、高压、酶修复方法。

自然冷却，再用3分钟×3次；
5）血清封闭：室温15-30分钟，尽可能与二抗来源一致。

倾去，勿洗；
6）滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育2至3小时或4℃过夜（最好复温）。

PBS 冲洗，3分钟×5次；
7）滴加生物素标记的二抗，室温或37℃孵育30分钟到1小时；
8）PBS 冲洗，3分钟×5次；
9）滴加SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室温或 37℃孵育30分钟到1小时；
10）PBS冲洗，3分钟×5次；
11）显色剂显色（DAB等）；
12）自来水充分冲洗；
13）可进行复染，脱水，透明；
14）选择适当的封片剂封片。

注意事项：本法仅适用于SP法，其它方法请参考相关说明书。

免疫组化操作步骤

免疫组化操作步骤免疫组化操作步骤一免疫组化（法）操作步骤：1．切片常规脱蜡至水。

如需抗原修复，可在此步后进行2. 缓冲液洗 32 次。

3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色 , 将切片放在中孵育 10-15 分钟。

4. 缓冲液洗 52 次。

5. 滴加V ，在室温下孵育5 分钟以封闭非特异性的背景染色。

（注：孵育不要超过 10 分钟，否则会导致特异性染色降低。

如果一抗的稀释液中含有 5 － 10% 正常羊血清，这一步可以省略。

）6. 缓冲液洗 52 次。

7. 滴加一抗工作液37 ℃孵育 1 － 2 小时。

（具体孵育时间和温度由试验者最终决定）8. 缓冲液洗 52 次。

9 ．滴加 ( 增强子 ) , 在室温下孵育 20 分钟。

10 ．缓冲液洗 52 次。

11 ．滴加 ( 酶标二抗 ) ，在室温下孵育 30 分钟。

（注：对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。

）12 ．缓冲液洗 52 次。

13 ．向 1 ( 或 ) 中滴加 1-2 滴（或） , 混匀后滴加到切片上，孵育 3 － 15 分钟。

（具体时间由染色深浅决定。

）14 ．自来水充分冲洗 , 复染，脱水 , 透明 , 封片。

二．免疫组化 ( 三步法 ) 操作步骤：（ 1 ）、石蜡切片脱蜡至水。

（ 2 ）、 3 2 O 2 室温孵育 5-10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。

（ 3 ）、蒸馏水冲洗，浸泡 5 分钟 x2 （如需抗原修复，可在此步后进行）。

（ 4 ）、 5-10% 正常山羊血清（稀释）封闭，室温孵育 10 分钟，倾去血清，勿洗。

滴加一抗工作液，37 ℃孵育 1-2 小时或4 ℃过夜。

（ 5 ）、冲洗， 5 分钟 x3 次。

（ 6 ）、滴加适量生物素标记二抗工作液，37 ℃孵育 10-30 分钟。

（ 7 ）、冲洗， 5 分钟 x3 次。

（8 ）、滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液，37 ℃孵育 10-30 分钟。

妇幼保健院免疫组化操作规程

妇幼保健院免疫组化操作规程
(1)每一批次的免疫组化染色必须设阳性对照，可利用组织中的内对照。

(2)必须建立本实验室每种免疫组化染色的操作规程，并及时更新。

(3)更换抗体后，需要有用阳性和阴性组织进行有效性验证，并有相应的文字记录和染色切片档案，相关档案保留2年。

(4)免疫组化染色过程中产生的有毒液体(如DAB)应专门回收，严禁随处倾倒。

(5)病理医师必须熟悉各种抗体染色结果，阳性信号表达部位、其诊断应用范围，以期做到正确的结果判读。

(6)单纯的免疫组化染色结果不能作为最终诊断，必须由病理医师结合形态学综合判断。