亮氨酸对原代培养大鼠骨骼肌细胞葡萄糖摄取及蛋白激酶B表达的影响
重症监护病房获得性虚弱和骨骼肌减少的分子机制
重症监护病房获得性虚弱和骨骼肌减少的分子机制摘要骨骼肌是一个适应性很强的器官，在分解代谢条件下，如危重病，其数量会下降。
衰老伴随着肌肉的逐渐丧失，尤其是体力活动减少时。
重症监护病房获得性无力是危重病人常见且高度严重的神经肌肉并发症。
它是危重病的后果，其特征是全身炎症反应，导致代谢应激，导致多器官功能障碍的发展。
肌肉功能障碍是这种综合征的重要组成部分，分解代谢的程度与病情严重程度相对应。
危重病人正在老龄化，因此，我们面临着另一个负面影响--骨骼肌减少--与年龄相关的骨骼肌质量和功能下降。
随着时间的推移，低度炎症逐渐积累，抑制蛋白质合成，恶化合成代谢抵抗，增加胰岛素抵抗。
累积的后果是肌肉恢复和肌肉质量逐渐下降。
上述两种情况的临床表现是骨骼肌无力，伴有大分子损伤，共同的机制是线粒体功能障碍。
1.重症监护病房获得性虚弱（ICUAW）导致危重病引起的骨骼肌萎缩，具有重要的临床意义，严重影响康复，增加发病率和死亡率。
ICUAW有时被称为危重型多发性神经病。
当神经受累占优势时被称为危重型多发性神经病（CIP），或肌肉受累至关重要的危重型肌病（C IM）。
它表现为肌肉无力，发展迅速，可检测肌肉萎缩。
我们通常会看到对称性肢体无力，这种情况在四肢近端（肩、髋）更为明显。
横膈膜和肋间肌也会受到影响，导致中断人工肺通气（未能撤回机械通气）和长期残疾，称为呼吸机引起的横膈膜功能障碍。
它的发病率在25-31％之间，程度取决于疾病本身，也取决于患者的治疗。
糖皮质激素治疗、长期镇静、神经肌肉阻滞剂、制动和人工肺通气会加重肌肉萎缩，见于比较典型的ARDS、新冠肺炎患者。
在使用人工肺通气的呼吸功能不全患者中，25-75％的患者存在严重的ICUAW。
炎症因子可引起运动神经元轴突肿胀，导致“失神经支配”或神经失用症。
肌肉快速丢失发生在败血症状态下，以应对微生物的侵袭（PAMPs，病原体相关分子通路）或与受损器官释放的alarmins 协同作用（DAMPs，损伤相关分子通路），从而导致应激代谢的激活。
大学细胞生物学考试练习题及答案731
大学细胞生物学考试练习题及答案71.[单选题]在洋葱表皮细胞临时制片的实验中，为了将细胞内除细胞骨架以外的蛋白质溶解，采用（ ）对洋葱内表皮进行处理。
A)tritonX-100B)M-缓冲液C)考马斯亮兰D)戊二醛答案:A解析:2.[单选题]以下( )感觉不是由G蛋白偶联型受体介导的A)听觉B)味觉C)视觉D)嗅觉答案:A解析:3.[单选题]核仁组织者位于中期染色体的（ ）A)主缢痕B)随体C)着丝粒D)次缢痕答案:D解析:4.[单选题]线粒体通过（ ）参与细胞凋亡A)释放细胞色素CB)释放Ach EC)ATP合成酶D)SOD答案:A解析:5.[单选题]下列信号转导途径的受体不在细胞表面的是( )A)离子通道受体途径B)G 蛋白偶联受体途径C)酶联受体途径解析:6.[单选题]若要了解分泌蛋白在内质网上合成后的运输途径，可以使用（ ）标记追踪。
A)3H胸腺嘧啶B)3H亮氨酸C)3H尿嘧啶D)3H赖氨酸答案:B解析:7.[单选题]中心粒和鞭毛的基体结构是( )A)都是9×3+0的结构B)前者是9×3+0，后者是9×2+2C)都是9×2+2的结构D)前者是9×2+2，后者是9×3+0答案:A解析:8.[单选题]下列穿膜运输方式中，介导被动运输的是 （ ）A)葡萄糖易化扩散B)Na+驱动的葡萄糖转运C)钠钾泵D)H+泵答案:A解析:9.[单选题]细胞内钙的储备库是（ ）。
A)细胞质B)内质网C)高尔基体D)溶酶体答案:B解析:10.[单选题]一般来讲，脂肪酸链的不饱和程度越高，膜的流动性 （ ）A)越大B)越小C)不变D)以上都不对答案:A11.[单选题]负责从内质网到高尔基体物质运输的是（ ）。
A)网格蛋白有被小泡B)COPⅡ有被小泡C)COPⅠ有被小泡D)胞内液泡答案:B解析:A项，网格蛋白有被小泡主要负责蛋白质从高尔基体TGN向质膜和胞内体及溶酶体运输；C项，COPⅠ有被小泡负责将内质网逃逸蛋白质从高尔基体返回内质网等。
机能增进补剂HMB的补充效用及机制研究
机能增进补剂HMB的补充效用及机制研究张庆【摘要】亮氨酸代谢产物β-羟基-β-甲基丁酸(beta-hydroxy-beta-methylbu-tyrate,HMB)作为一种机能增进补剂被广泛运用,通过补充HMB来提高骨骼肌肌肉量,增强肌肉有氧能力,提高运动成绩,防治肌肉减少症(sarcopenia),降低血液低密度胆固醇和总胆固醇含量,增强免疫系统功能等.HMB作为一种机能增进补剂被广泛运用,特别是对于健美运动员和力量型运动员来说,他们通过补充HMB来使骨骼肌增大,提高运动成绩.虽然大量的研究已经证实HMB在运动训练和临床康复条件下的有效性,但是也存在许多相互矛盾的结论.因此,本文首先进一步对HMB的研究进行分析,检验补充HMB的有效性,以及解释已有文献中存在的矛盾,并对训练年限、肌肉的代谢状态以及最理想的HMB剂量等多种调节变量进行分析.其次,对HMB 起作用的可能机制进行了广泛的讨论,并展望未来的研究方向.【期刊名称】《南京体育学院学报（自然科学版）》【年(卷),期】2019(002)004【总页数】9页(P50-58)【关键词】HMB;β-羟基-β-甲基丁酸;运动训练;改善肌肉功能【作者】张庆【作者单位】苏州大学体育学院,江苏苏州215021【正文语种】中文【中图分类】G80-05支链氨基酸(branched chain amino acids, BCAAs)包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸，占肌肉蛋白质总量的三分之一。
其中亮氨酸具有广泛的生理作用，在蛋白质代谢、维持葡萄糖含量稳定、对胰岛素的调节以及运动后恢复中发挥重要作用[1-3]。
亮氨酸抗蛋白质分解的特性已被人认知，虽然其机制还未完全阐明，人们认为亮氨酸的代谢产物α-酮异已酸(α- ketoisocaproic acid，α-KIC)可能在这一过程中发挥作用。
因为亮氨酸在摄入后转氨基生成KIC，继而减少了肌肉分解。
但是，亮氨酸发挥抗蛋白质分解的作用具有剂量依赖性，有研究就表明补充3 g BCAAs没有明显的提高身体机能的作用[4, 5]。
PQQ对巨噬细胞炎症抑制及机制的初步研究
PQQ对巨噬细胞炎症抑制及机制的初步研究刘海霞;蔡秀丽;金冬;张广芹;温传俊【摘要】To investigate the effects of pyrroloquinoline quinone(PQQ)on the expression of inflammatory factors in LPS-induced of macrophages. Cultured RAW264.7 cells,BMDM cells and THP-1 cells were divided into the control and PQQ-treated groups,respectively.MTT method was used to detect the cell proliferation.The expression of each inflamma-tory factor at mRNA and protein levels was detected by RT-qPCR and Western Blot analysis. PQQ pretreatment caused a significant decrease in the expression of inflammatory factors,the expression of P-P65 protein and consequently an increase in the expression of Nrf2 protein. PQQ pretreatment reduces the intracellular inflammatory response,which may attribute to an increase in the expression of Nrf2 and resultant inhibition of the expression of NF-κB.%探讨吡咯喹啉醌(PQQ)对LPS诱导的巨噬细胞炎症因子基因表达的影响及机制.培养RAW264.7细胞、BMDM细胞和THP-1细胞,分为对照组和实验处理组,用MTT方法检测PQQ对细胞增殖的影响,并分别用RT-qPCR和Western Blot 检测各炎症因子的基因及蛋白表达情况.PQQ预处理能使LPS诱导的炎症因子表达量下降,并使P-P65蛋白表达下降,Nrf2蛋白表达增加.PQQ预处理降低细胞内炎症反应,这一过程可能通过增加Nrf2表达和抑制NF-κB表达而发挥作用.【期刊名称】《南京师大学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(040)003【总页数】6页(P133-137,143)【关键词】PQQ;LPS;炎症因子;Nrf2;NF-κB【作者】刘海霞;蔡秀丽;金冬;张广芹;温传俊【作者单位】南京师范大学生命科学学院,分子细胞生物学研究所,江苏南京210023;南京师范大学生命科学学院,分子细胞生物学研究所,江苏南京210023;南京师范大学生命科学学院,分子细胞生物学研究所,江苏南京210023;南京师范大学生命科学学院,分子细胞生物学研究所,江苏南京210023;南京师范大学生命科学学院,分子细胞生物学研究所,江苏南京210023【正文语种】中文【中图分类】Q28吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinine,PQQ)是一种带负电荷的、水溶性的复合物,具有氧化还原作用的醌类[1],并具有清除自由基的作用[2]. 在生物体内可发挥多种生物学作用,如促进动物的生长发育、细胞增殖、保护神经细胞并促进其生长因子的分泌[3]. 最近有研究发现,PQQ抑制类风湿性关节炎和神经胶质细胞的炎症[4],由此推测,PQQ对LPS诱导的炎症反应也有相同的作用. 炎症反应是一种保护免疫系统的应激反应,过度强烈的炎症反应会导致全身炎症反应综合征[5]. 巨噬细胞是一类广泛分布于全身组织中的免疫细胞,活化后可产生多种炎症因子,其中脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是最主要的病原相关分子[6]. 因此如何抑制LPS诱导产生的炎症具有重要的临床意义. 本实验以LPS诱导的巨噬细胞为研究对象,观察研究了PQQ对其炎症反应的抑制作用,并初步探讨了其作用机制.1.1 实验材料胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)和高糖DMEM、AMEM培养基购自Gibco生物公司;100 U/mL青霉素(Penicillin)、100 U/mL链霉素(Streptomycin)和胰蛋白酶购自维森特公司;抗体均购自CST公司;反转录试剂盒和RT-qPCR试剂盒均购自Takara公司;兔抗人GAPDH多克隆抗体购自巴傲得公司;MTS购自Promega 公司;小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)、人急性单核细胞白血病单核细胞株(THP-1)、小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow derived macrophages,BMDM)为原代分离细胞.1.2 实验方法1.2.1 RAW264.7细胞培养将液氮中的RAW264.7细胞株取出,在42 ℃水浴锅中快速晃动至融化. 在超净工作台中吸取细胞悬液到含有适量DMEM完全培养液(含有10% FBS、DMEM、双抗),十字交叉法混匀细胞,置37 ℃、5% CO2培养箱中培养. 待约8 h后,弃培养基,PBS洗去未贴壁细胞,加入新鲜培养液. 当细胞密度达到80%左右,胰酶消化传代.1.2.2 THP-1细胞培养将液氮中的THP-1细胞株取出,在42 ℃水浴锅中快速晃动至融化. 在超净工作台中吸取细胞悬液到离心管中,放入离心机中1 000 r/min离心3 min,在超净工作台中弃去上清,加入1 mL含10%胎牛血清、青霉素和链霉素的RPMI 1640完全培养基,混匀细胞,将其加入含有7 mL培养基的10 cm皿中,混匀细胞,置37 ℃、5% CO2培养箱中培养. 此后每天添加2 mL培养液. 当细胞密度达到90%左右,离心弃去培养液,加入新鲜培养基混匀,按1∶3进行传代培养.1.2.3 BMDM细胞的获取和培养(1)收集L929细胞培养上清的方法:AMEM培养基(含10% FBS)于37 ℃、5%的CO2孵箱中培养L929细胞4 d,收集细胞上清,最后利用滤器(0. 22 μmol/L)过滤后备用.(2)分离小鼠骨髓:首先将周龄8 w～10 w的C57BL/6小鼠颈椎脱臼处死,放置在75%的乙醇消毒5 min,放入超净工作台,暴露和分离小鼠股骨及胫骨,并放在含有冰的PBS的10 cm皿中,将小鼠肌肉组织切除,剪掉关节面暴露骨髓腔,用注射器吸取AMEM(10% FBS)冲洗骨髓腔,1 000 r/min离心5 min后收集骨髓.(3)L929细胞培养上清诱导分化巨噬细胞:将L929细胞上清与含AMDM(10% FBS)1∶4比例充分混匀,然后加入离心管吹打收集的小鼠骨髓使其成为单细胞悬液,最后将细胞悬液铺于细胞培养皿中,十字交叉混匀,放置37 ℃、5% CO2孵箱中培养,培养过程中的第3 d(不洗)、第5 d更换新鲜完全培养基,第7 d获得成熟的BMDM[8].1.2.4 MTT检测细胞增殖取对数生长期的细胞接种于96孔板中,分6组实验. 每组设5个复孔,置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养过夜. 培养24 h,弃去培养液,PBS清洗一遍,每孔加入100 μL DMEM完全培养液和20μL MTS/PMS(20∶3)混合液,继续培养4 h,在酶标仪上于490 nm处测定各孔的光吸收值(OD值).1.2.5 RNA提取以及RT-qPCR分析利用Trizol试剂按照说明书提取RNA,用DEPC水溶解并用NanoDrop分光光度仪测定合格后,按照Takara反转录试剂盒说明书反转录得到cDNA,并检测mRNA 的表达水平.1.2.6 蛋白提取以及Western blot分析吸去培养基,用1×PBS洗2次,加入含有1 mmol/L PMSF和cocktail的RIPA裂解液置冰上裂解细胞30 min,每隔5 min摇晃一次,充分裂解细胞,收集于1.5 mL EP管中,12 000 r/min离心10 min,将上清转移至新的1.5 mL EP管,加入5×Sample Buffer充分混匀,95 ℃煮样10 min. 10%、12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶恒压80 V电泳,等marker在分离胶微散开,将电压改为120 V. 恒流330 mA,90 min转移到PVDF膜上,用5%脱脂牛奶封闭膜120 min,一抗4 ℃孵育过夜,37 ℃孵育相应二抗1 h～2 h,利用ECL显色并用化学发光成像系统显示目的条带.1.2.7 统计学处理采用Image J软件对Western blot结果进行灰度分析,采用Origin 8.0软件对实验数据进行统计学分析并作图,组间差异用单因素方差分析进行比较,检验P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著.2.1 PQQ预处理对LPS诱导RAW264.7细胞的生长作用各组加药处理24 h,MTT检测细胞增殖情况,如图1所示. 实验中,加入10 μmol/L PQQ对RAW264.7生长有一定促进作用,这说明PQQ对细胞生长无害;只加入LPS组,24 h后细胞活力显著低于对照组(P<0.05);而加入一定浓度PQQ预处理1 h后再加入LPS刺激24 h,在PQQ浓度为1 μmol/L、10 μmol/L、30 μmol/L时细胞活力均极显著地高于LPS单独处理组(P<0.01),提示PQQ预处理对LPS诱发的细胞生长抑制有一定的缓解作用.2.2 PQQ预处理对LPS诱导THP-1细胞炎症因子基因表达的影响利用Q-PCR检测THP-1细胞中炎症因子的表达. 如图2所示,在空白对照组,THP-1细胞中IL-6、TNF-α、IL-1β mRNA表达水平较低,为1 μg/m. LPS刺激24 h 后,IL-6、TNF-α、IL-1β mRNA 表达水平均显著增加;而在PQQ预处理1 h后再加入LPS刺激24 h,当PQQ为1 μmol/L、10 μmol/L、30 μmol/L和90μmol/L时,分别使LPS诱导的IL-1β mRNA 、TNF-α和IL-6表达水平明显下降,提示PQQ可显著抑制LPS诱导的IL-1β、TNF-α和IL-6 mRNA表达量的增加.2.3 PQQ对LPS诱导THP-1、BMDM细胞NF-κB p65蛋白表达的影响在THP-1细胞中利用Western Blot检测细胞中NF-κB p65蛋白的表达. 如图4 A、B所示,在空白对照组和只有PQQ组中,THP-1细胞中P-P65表达水平较低,加入200 ng/mL LPS刺激30 min后,P-P65表达水平均极显著增加;而在PQQ预处理1 h后加入LPS刺激30 min,10 μmol/L和50 μmol/L的PQQ均可阻断LPS 诱导的P-P65表达增加,其中以PQQ为10 μmol/L时作用更明显.在BMDM细胞中利用Western Blot检测细胞中NF-κB p65蛋白的表达. 如图3C、D所示,在空白对照组和PQQ组,BMDM细胞中P-P65表达水平较低,加入200 ng/mL LPS刺激30 min后,P-P65表达水平均极显著增加;而在50 μmol/L PQQ预处理1 h后加入200 ng/mL LPS刺激30 min后,P-P65表达与LPS组相比极显著下降.2.4 PQQ预处理对LPS诱导THP-1、RAW264.7细胞Nrf2蛋白表达的影响Nrf2,CNC(cap'n'collar)家族成员,包括碱性亮氨酸拉链区域,Nrf2连接于相解毒/抗氧化酶和相关应激反应蛋白启动区的抗氧化反应元件部位,参与这些基因的调控. 有研究表明,Nrf2可以抵抗炎症刺激,抑制细胞组织受到炎症损伤. 所以接下来检测了PQQ作用与LPS诱导的巨噬细胞里Nrf2的蛋白表达情况. 如图4A、B所示,只加入10μM PQQ组与空白对照组相比,Nrf2的表达显著增加,LPS组其表达量也比空白对照组极显著增加. 而加入PQQ预处理1 h、加入LPS刺激24 h后,PQQ浓度依赖地引起LPS刺激诱导的Nrf2表达量增加. 如图4C、D所示,只加入20μmol/L PQQ组与空白对照组相比,Nrf2的表达极显著增加,LPS组其表达量也比空白对照组极显著增加. 而加入PQQ预处理1 h、加入LPS刺激24 h后,当PQQ 浓度为10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L时,Nrf2表达量比LPS组极显著增加. 由此可见,加LPS能促进细胞Nrf2的表达,而PQQ预处理可以进一步促进LPS诱导的Nrf2的表达.革兰氏阴性菌常引起感染性休克,内毒素激活宿主的免疫系统,产生大量的细胞因子和内源性介质,作用于机体器官,导致组织细胞代谢紊乱,并出现功能性紊乱,最后甚至引起器官衰竭. 巨噬细胞是体内免疫重要细胞,在体内免疫反应中起重要的作用,它通过激活机体的免疫系统,释放细胞因子[9],参与炎症反应. 转录因子NF-κB是炎症的关键调节剂,被激活后可以诱导多种基因的表达,从而产生多种细胞因子参与炎症反应,也可抑制ARE依赖性基因的转录. ARE可与Nrf2结合,从而启动目标基因转录. 在生理条件下,NF-κB是无活性的,并通过绑定其抑制激酶,核因子κB激酶亚基β(IKK-β)蛋白的抑制剂在细胞质中螯合. 在病理条件如氧化应激、细菌内毒素和细胞因子,NF-κB可以被激活[10]. Nrf2,CNC(cap'n'collar)家族成员,包括碱性亮氨酸拉链区域[11],Nrf2连接于相解毒/抗氧化酶和相关应激反应蛋白启动区的抗氧化反应元件部位,参与这些基因的调控. 有研究表明,Nrf2可以抵抗炎症刺激,抑制细胞组织受到炎症损伤[12-13]. 此外,在小鼠原代培养的星形胶质细胞中,NF-κB的活性和促炎细胞因子的表达在Nrf2敲除星形胶质细胞中比在野生型星形胶质细胞中显著更多[14]. 因此功能Nrf2系统是重要的调节神经炎症响应氧化应激通过激活NF-κB和大脑中的下游促炎细胞因子[14]. 由此看出Nrf2在炎症调节中与NF-κB有着密切的联系. 所以本实验检测了PQQ作用与LPS诱导的巨噬细胞中NF-κB和Nrf2的蛋白表达情况. 实验结果表明,PQQ可以抑制THP-1细胞炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β的释放,说明PQQ具有抗炎效应与抑制炎性细胞因子产生有关. PQQ可以降低LPS诱导的THP-1细胞的NF-κB表达,表明PQQ可通过抑制LPS 诱导的THP-1细胞NF-κB p65蛋白的表达,而减少炎症因子的大量释放. PQQ还可以增加LPS诱导的THP-1细胞Nrf2的表达. 说明PQQ可以通过增加Nrf2表达抵抗炎症刺激,抑制细胞组织受到损伤. 但PQQ是否通过Nrf2作用于NF-κB,还需要进一步探索.【相关文献】[1] ZHANG Y H,FEUSTEL P J,KIMELBERG H K,et al. Neuroprotection by pyrroloquinoline quinone(PQQ)in reversible middle cerebral artery occlusion in the adult rat[J]. Brain research,2006,1 094(1):200.[2] GALLOP P M,HENSON E,PAZ M A,et al. Acid-promoted tautomeric lactonization and oxidation-reduction of pyrroloquinoline quinone(PQQ)[J]. Biochemical and biophysical research communications,1989,163(2):755-763.[3] MATSUSHITA K,TOYAMA H,YAMADA M,et al. Quinoproteins:structure,function,andbiotechnological applications[J]. Applied microbiology and biotechnology,2002,58(1):13-22.[4] LIU Z,SUN C,TAO R,et al. Pyrroloquinoline quinone decelerates rheumatoid arthritis progression by inhibiting inflammatory responses and joint destruction via modulating NF-κB and MAPK pathways[J]. Inflammation,2016,39(1):248.[5] MARKWART R,CONDOTTA S A,REQUARDT R P,et al. Immunosuppression afterseps is:systemic inflammation and sepsis induce a loss of naïve T-Cells but no enduring cell-autonomous defects in T-Cell function[J]. Plos One,2014,9(12):e115094.[6] AMIOT F,FITTING C,TRACEY K J,et al. Lipopolysaccharide-induced cytokine cascade and lethality in LT alpha/TNF alpha[J]. Molecular medicine,1997,3(12):864-875.[7] LEE A K,SUNG S H,KIM Y C,et al. Inhibition of lipopolysaccharide-inducible nitric oxide synthase,TNF-alpha and COX-2 expression by sauchinone effects on I-kappaBalpha phosphorylation,C/EBP and AP-1 activation[J]. British journal ofpharmacology,2003,139(1):11.[8] WEISCHENFELDT J,PORSE B. Bone Marrow-Derived Macrophages(BMM):isolation and applications[J]. Cold spring harbor protocols,2008(12):5 080.[9] RITTIRSCH D,FLIERL M A,WARD P A. Harmful molecular mechanisms in sepsis[J]. Nature reviews immunology,2008,8(10):776-787.[10] CHEN F,CASTRANOVA V,SHI X,et al. New insights into the role of nuclear factor-κB,a ubiquitous transcription factor in the initiation of diseases[J]. Clinicalchemistry,1999,45(1):7-17.[11] LEE J M,JOHNSON J A. An important role of Nrf2-ARE pathway in the cellular defense mechanism[J]. Journal of biochemistry and molecular biology,2004,37(2):139. [12] ARISAWA T,TAHARA T,SHIBATA T,et al. The relationship between Helicobacter pylori infection and promoter polymorphism of the Nrf2 gene in chronic gastritis[J]. International journal of molecular medicine,2007,19(19):143-148.[13] MA Q. Multiorgan autoimmune inflammation,enhanced lymphoproliferation,and impaired homeostasis of reactive oxygen species in mice lacking the antioxidant-activated transcription factor Nrf2[J]. American journal of pathology,2006,168(6):1 960.[14] ZHANG L,WANG H. Targeting the NF-E2-related factor 2 pathway:a novel strategy for traumatic brain injury[J]. Molecular neurobiology,2017:1-3. doi:10.1007/S12035-017-0456-Z.。
基于甲状腺疾病危险因素筛查的预警模型及计算机系统开发
该项目思路：先进行甲状腺疾病及危险因素筛查，将筛查结果利用统计分析软件进行数据分析，建立风险因素预警模型，然后进一步在人群中进行模型验证，验证后，做计算机软件系统开发，做成一个甲状腺疾病风险评估的软件系统，可以在深圳地区及国内进行技术推广应用，实现甲状腺疾病的快速的个体化的预测和预防，帮助广大市民预防甲状腺疾病的发生，并促使早期治疗。
具有重大的社会意义与现实意义。
把项目结果-即预警模型做成一个计算机软件，然后再做成一个网络平台，人们可以在网上把资料输入，自动得到风险评估结果，及初步诊断。
题目也许改为“基于危险因素筛查的甲状腺疾病预警模型及计算机系统开发与云服务宁洁 16:55:19这个是课题申报，麻烦你帮我写计算机开发及云服务平台这一部分基于危险因素筛查的甲状腺疾病预警模型及计算机系统开发一、立项依据甲状腺疾病是甲状腺功能、形态、组织结构等的病理性改变导致的一组疾病的总称。
临床最为常见的甲状腺疾病主要有甲状腺功能亢进、甲状腺功能减低、单纯性甲状腺肿、自身免疫性甲状腺炎、甲状腺腺瘤、甲状腺癌等。
随着全民食盐加碘政策（Universal salt iodination, USI）的实施，缺碘性甲状腺肿作为一种地方病已得到了有效控制。
但另一方面，由于各种原因导致的甲状腺疾病近年来出现高发的趋势。
2009年3月-2010年8月，中国首次对包括北京、上海等10个中东部城市1.5万多名社区居民的甲状腺疾病流行病学调查结果表明，甲减的患病率已从3.8%升高至6.5%，且每6名女性中就有1例甲减患者，甲状腺结节患病率亦高达18.6%。
沿海有城市报道，医院门诊的甲状腺疾病患病率高达30%以上。
而甲状腺癌这一恶性肿瘤的患病率呈现全球性升高的趋势。
美国癌症协会2013年公布的数据表明，甲状腺癌已经占到女性癌症中第6位。
北京最新公布的居民健康状况数据表明，2013年北京市甲状腺癌发病率为15.74/10万，比2003年(3.19/10万)上升393.42%，年平均增长16.92%，已成为北京市增长最快的恶性肿瘤。
动物细胞培养技术
还含有一些供贴附型细胞在培养皿表面贴附和铺展的生长基质成份，
如纤粘连蛋白、层粘连蛋白等；
种类：牛、人、马、兔、猪、羊血清，最常用的是胎牛血清与新生牛
血清；
血清的使用浓度一般为5％～20％，常用浓度为10％；
使用前必须经过鉴定，只有无菌、无支原体、无内毒素、无溶血或低
HEPES 对细胞无毒性，能防止pH迅速变动，其最大优点是在进行活细胞
观察时能维持较恒定的pH。
4、 气体
❖ 气体：需要O2、CO2
O2
（95%空气、5% CO2）
：参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增
殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。
❖低于大气压的氧压适于细胞株生长；
❖高氧压（高达95%）适于器官培养，但对于胚胎
从原代培养的细胞继续转接培养称继代培养.
4、细胞系(cell line)：由原代细胞培养后经初步纯化，
获得的以一种细胞为主、能在体外长期生存的不均一
的细胞群体，一般为有限细胞系。
5、细胞株(cell strain)：细胞系经过克隆或其他方法
获得、由单细胞形成的单一类型的细胞群体。
有限细胞系(infinited cell line)：不能连续培养的
溶血、蛋白质及必需营养素达到一定标准以上的血清才能使用。
➢
水解乳蛋白和胶原
➢ 另外两种较好的天然培养基成分；
➢ 水解乳蛋白：乳白蛋白经蛋白酶和肽酶水解的产
物，呈淡黄色粉末状，富含氨基酸；
➢ 胶原：从动物真皮中提取的，具改善细胞表面特
性促使其附着生长的作用。
❖人工合成培养基
➢ 平衡盐溶液（Balanced salt solution，BSS）：
基础医学院《生物化学与分子生物学》考试试卷(930)
基础医学院《生物化学与分子生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、A型题（41分，每题1分）1. 参与血液凝固的维生素是（）。
A．维生素KB．维生素BC．维生素CD．维生素A答案：A解析：项，维生素族维生素主要以辅酶的形式参与酶的组成，在代谢中起作用。
项，维生素具有防治坏血病的功能，又称抗坏血酸。
项，维生素K具有促进凝血的功能，又称凝血维生素。
项，维生素又名视黄醇，是构成视觉细胞内感光物质的成分，具有视觉功能。
2. 蛋白质生物合成中每生成一个肽键消耗的高能磷酸键数为（）。
A． 1个B． 3个C． 2个D． 4个答案：D解析：在肽链延长阶段中，每生成一个肽键需从2分子GTP水解获能（进位和移位各l个）。
此外，氨基酸活化形成氨基酰tRN要消耗2个高能磷酸键，因此每生成l个肽键需消耗4个高能磷酸键。
3. 丙酮酸脱氢酶复合体中不包括（）。
A．生物素B．辅酶AC． NAD＋D． TPP答案：A解析：三项，丙酮酸脱氢酶复合体是糖有氧氧化的7个关键酶之一，由丙酮酸脱氢酶E1、二氢硫辛酰胺转乙酰酶E2和二氢硫辛酰胺脱氢酶E3组成，参与的辅酶有硫胺素焦磷酸酯TPP、硫辛酸、F、N＋和o（辅酶）。
项，生物素是丙酮酸羧化酶（糖异生的关键酶）的辅酶。
4. 合成脂肪酸所需的乙酰CoA由（）。
A．胞质的乙酰肉碱提供B．线粒体合成并转化为柠檬酸转运到胞质C．胞质直接提供D．线粒体合成，以乙酰CoA的形式转运到胞质答案：B解析：细胞内乙酰o全部在线粒体内产生，不能直接透过线粒体进入胞质，它首先要与草酰乙酸缩合为柠檬酸，经载体转入胞质，再经裂解酶催化裂解为乙酰o（及草酰乙酰）方可供为脂肪酸合成。
5. Rb基因是（）。
A．病毒癌基因B．基因编码产物是生长因子C．细胞癌基因D．抑癌基因答案：D解析：Rb基因是最早发现的抑癌基因。
卡格列净对Dahl盐敏感大鼠心肌代谢及心功能的影响演示课件
汇报人：XXX
2024-01-09
CONTENTS
• 引言 • 材料与方法 • 结果 • 讨论 • 结论
01
引言
研究背景
高血压和糖尿病是全球范围内的重大公共卫生问题，对人类健康造成严重威胁。卡格列净是一种新型的钠-葡萄糖协同转运蛋 白2（SGLT2）抑制剂，具有降低血糖和减轻体重的作用，但关于其对心血管系统的影响仍存在争议。
本研究的局限性与展望
实验药物剂量选择
本研究中卡格列净的剂量选择可能存在局限性，未来研究 可以尝试不同剂量对Dahl盐敏感大鼠心肌代谢及心功能的
影响。
实验动物模型
本研究使用的Dahl盐敏感大鼠模型可能不能完全模拟人类 疾病情况，未来研究可以尝试其他更接近人类的动物模型
。
实验指标选择
本研究中只检测了部分心肌代谢和心功能相关指标，未来 研究可以进一步完善指标体系，更全面地评估卡格列净的
卡格列净对Dahl盐敏感大鼠心功能的影响
改善心功能
卡格列净能够改善Dahl盐敏感大鼠心功能，提高心输出 量和心脏指数，降低左心室肥厚和舒张期末内径。
01
抑制心肌肥厚
卡格列净能够抑制Dahl盐敏感大鼠心肌 肥厚过程，减轻心肌细胞体积和重量， 改善心肌重塑。
02敏感大鼠心 衰症状，降低呼吸困难和肺水肿发生 率，延长生存时间。
04
讨论
卡格列净改善心肌代谢的可能机制
抑制糖酵解和糖异生
卡格列净作为钠-葡萄糖共转运蛋白2抑制剂，能够抑制糖酵解和糖 异生过程，从而降低心肌糖代谢，减少心肌能量消耗。
促进脂肪酸氧化
卡格列净可能通过调节脂肪酸氧化酶的活性，促进脂肪酸在心肌中 的氧化代谢，改善心肌能量代谢。
膳食补充亮氨酸对血糖的影响及一种作用机制
膳食补充亮氨酸对血糖的影响及一种作用机制作者：闫阳杨帆来源：《卷宗》2016年第06期摘要：奶制品、黑木耳和大蒜中亮氨酸含量丰富，膳食中补充亮氨酸或者亮氨酸缺乏对脂肪代谢产生影响的作用机制涉及到酶、基因表达和中枢神经系统的调节，且存在明显的差异。
本研究旨在探讨膳食补充亮氨酸和大鼠血糖浓度之间的关联性和一种可能机制，寻找预防和治疗Ⅱ型糖尿病的潜在靶点。
本研究将健康雄性大鼠均分成三组（亮氨酸低剂量组、亮氨酸高剂量组、对照组），用不同浓度的亮氨酸溶液灌胃。
通过对不同时期大鼠血糖浓度的检测，可以发现不同浓度亮氨酸溶液对大鼠糖耐量的影响；通过ELISA法可以分别检测出血液中胰岛素、胰高血糖素的表达量变化。
进而推断亮氨酸发挥作用的一种可能机制。
关键词：亮氨酸；血糖；糖耐量；激素表达1 研究背景和目的随着人类生活水平普遍提高，糖尿病的发病率及患病人数增长迅速。
饮食中存在一些能控制体重、改善血糖及脂代谢的有益物质，其中亮氨酸与糖尿病的关系正受到广泛关注。
许多国内外的报道都表明：机体摄入等热量的高碳水化合物与高蛋白的食物相比，后者可以减少脂肪的蓄积，从而控制血糖血脂的水平。
我们猜测这可能与蛋白质中的亮氨酸的含量和摄入有关。
本题目主要意义在于研究亮氨酸的摄入与血糖浓度之间是否有关联，同时研究其可能的作用机制。
2 主要内容1、大量的体内和体外试验研究表明，亮氨酸可以调节哺乳动物的脂肪代谢，主要表现在降低脂肪合成，促进脂肪分解。
而添加亮氨酸或者亮氨酸缺乏对脂肪代谢产生影响的作用机制涉及到酶、基因表达和中枢神经系统的调节，且存在明显的差异。
从而可以看出亮氨酸可能对机体血糖浓度的控制有相关联的地方。
亮氨酸属必需氨基酸，为婴儿正常生长及成人维持正常氮平衡所必需。
该品作为营养增补剂，配制氨基酸输液，植物生长促进剂。
按我国GB 2760-86规定，该品可用作香料。
2、血糖浓度能维持相对恒定是由于机体内存在一整套高效率的调节机制，精细地控制着血糖的来源与去路，使之达到动态平衡，是糖类、脂肪、氨基酸代谢协调的结果。
三年高考生物真题汇总《体液调节》
三年高考生物真题汇总《体液调节》1.（2021·6浙江月选考）下列关于人体性激素的叙述，错误的是（）A.雌激素可抑制女性皮下脂肪的积聚B.睾酮是维持男性第二性征的重要条件 C.雌激素可促进配泡的生长和卵子的成熟D.睾酮不足会影响男性的机体代谢率【答案】A【解析】A教材知识：雌激素引发女性第二性征，包括乳腺的生长、皮下脂肪的积聚（特别是在臀部和乳房）等。
2．（2021·1月浙江选考）胰岛素和胰高血糖素是调节血糖水平的重要激素。
下列叙述错误的是（）A．胰岛素促进组织细胞利用葡萄糖B．胰高血糖素促进肝糖原分解C．胰岛素和胰高血糖素在血糖水平调节上相互对抗D．血糖水平正常时，胰岛不分泌胰岛素和胰高血糖素【答案】D【分析】在机体的血糖调节中，胰岛素是已知的唯一能降低血糖浓度的激素，其作用是加速组织细胞摄取、利用、储存葡萄糖，还能抑制肝糖元的分解和非糖物质的转化，从而降低血糖水平；胰高血糖素能促进肝糖元分解和非糖物质的转化，从而升高血糖水平。
【详解】A、胰岛素能促进肝细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等组织细胞加速摄取、利用和储存葡萄糖，A正确；B、胰高血糖素能促进肝糖元分解和非糖物质转化成葡萄糖，促使葡萄糖释放进血液中，使血糖升高，B正确；C、胰岛素具有降低血糖浓度的作用，胰高血糖素具有升高血糖浓度的作用，二者在血糖水平调节上相互对抗，C正确；D、血糖水平正常时，胰岛仍会分泌一定量的胰岛素和胰高血糖素，使机体内二者浓度维持相对稳定状态，D错误。
故选D。
3．（2021·河北高考真题）血糖浓度升高时，机体启动三条调节途径：①血糖直接作用于胰岛B细胞；②血糖作用于下丘脑，通过兴奋迷走神经（参与内脏活动的调节）支配胰岛B细胞；③兴奋的迷走神经促进相关胃肠激素释放，这些激素作用于胰岛B细胞。
下列叙述错误的是（）A．①和②均增强了胰岛B细胞的分泌活动B．②和③均体现了神经细胞与内分泌细胞间的信息交流C．①和③调节胰岛素水平的方式均为体液调节D．血糖平衡的调节存在负反馈调节机制【答案】C【分析】分析题干，血糖浓度升高时的三条调节途径，第一条是体液调节，后两条都是神经体液调节。
PERK介导的内质网应激参与血管紧张素Ⅱ诱导心肌肥大的机制
PERK介导的内质网应激参与血管紧张素Ⅱ诱导心肌肥大的机制吕振嵘;王晓礽n;李玉珍;王琛;刘秀华【摘要】目的:研究蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)介导的内质网应激(ERS)反应在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导心肌细胞肥大中的作用.方法:在AngⅡ诱导原代培养的乳大鼠心肌细胞肥大模型上,采用[3H]-亮氨酸掺入、心肌细胞表面积测定等评估心肌细胞肥大程度;以实时定量PCR、RT-PCR和Western blotting检测ERS标志性分子葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、钙网蛋白(CRT)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、真核细胞翻译起始因子2α(eIF2α)和C/EBP同源蛋白(CHOP)mRNA和蛋白表达变化.结果:与正常对照组比较,AngⅡ组CRT mRNA和蛋白表达分别高146.4%和125.3%(P<0.05),GRP78 mRNA和蛋白的表达分别高84.0%和77.6% (P<0.05),PERK mRNA和蛋白表达分别高165.4%和132.1%(P<0.05),eIF2α mRNA和蛋白表达分别高110.9%和46.5%(P<0.05),CHOP mRNA和蛋白表达分别高117.7%和63.3%(P<0.05).结论:PERK介导的内质网应激反应参与了AngⅡ诱导的心肌细胞肥大.%AIM: To investigate the role of protein kinase R - like endoplasmic reticulum kinase ( PERK ) -mediated endoplasmic reticulum stress ( ERS ) in angiotensin II ( Ang II ) — induced myocardial hypertrophy. METHODS : In the hypertrophy model of Ang II — induced cardiomyocytes isolated from neonatal Sprague — Dawley rats, the methods of morphological observation, [ 3 H ] - leucine incorporation and surface area measurement were employed to assess the cardiomyocyte hypertrophy. Real -time PCR, RT-PCR and Western blotting were used to detected the expression of glucose — regulated protein 78 ( GRP78 ),calreticulin ( CRT ), PERK, eukaryotic initiation factor 2α ( eIF2α ) and C/EBP homologous protein ( CHOP ) at mRNA and protein levels. RESULTS: Compared with control group, Ang II - treated cardiomyocytes showed that the mRNA and protein expression of CRT increased by 146. 4% and 125. 3% , respectively ( P < 0. 05 ). The mRNA and protein expression of GRP78 increased by 84. 0% and 77. 6% , respectively ( P <0. 05 ). The mRNA and protein expression of PERK increased by 165. 4% and 132. 1% , respectively ( P < 0. 05 ). The mRNA and protein expression of eIF2α was increased by 110. 9% and 46. 5% , respectively ( P <0. 05 ). The mRNA and protein expression of CHOP also increased by 117. 7% and 63. 3% , respectively ( P <0. 05 ). CONCLUSION: PERK - mediated ERS response is involved in Ang II — induced cardiomyocyte hypertrophy.【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2012(028)007【总页数】7页(P1153-1159)【关键词】心肌肥大;内质网应激;蛋白激酶R样内质网激酶【作者】吕振嵘;王晓礽n;李玉珍;王琛;刘秀华【作者单位】山东大学医学院病理生理教研室,山东,济南,250012;中国人民解放军总医院病理生理研究室,北京,100853;中国人民解放军总医院病理生理研究室,北京,100853;中国人民解放军总医院病理生理研究室,北京,100853;中国人民解放军总医院病理生理研究室,北京,100853【正文语种】中文【中图分类】R363.1△通讯作者Tel*************;E-mail:*********************.cn▲并列第1作者心肌肥大是由缺血、机械牵张、激素和细胞因子等因素引起的心肌细胞代偿性反应，心肌肥大失代偿可导致扩张性心肌病、心力衰竭和猝死，严重危及人类生命。
亮氨酸tRNA及亮氨酰-tRNA合成酶结构和功能的研究的开题报告
亮氨酸tRNA及亮氨酰-tRNA合成酶结构和功能的
研究的开题报告
题目：亮氨酸tRNA及亮氨酰-tRNA合成酶结构和功能的研究
背景：
亮氨酸是一种重要的氨基酸，它是蛋白质生物合成中不可缺少的成
分之一。
在生物体内，亮氨酸是由亮氨酸合成酶催化合成并与tRNA结合形成亮氨酰-tRNA，从而参与到蛋白质生物合成中。
亮氨酸合成酶是一个高度保守的酶，在细菌、真菌、动物和植物中都有相应的同源物质。
这
种酶结构较为复杂，涉及到多种酶学和生物化学机制，是细胞内十分重
要的一个酶。
研究内容：
本项目旨在通过分析亮氨酸tRNA及亮氨酰-tRNA合成酶的结构和功能，揭示其在蛋白质生物合成中的作用机制和生理生化活动。
针对亮氨
酸合成酶的结构、反应机理和催化能力，开展深入研究，主要任务包括：
1.对亮氨酸tRNA及亮氨酰-tRNA合成酶的结构进行分析，利用X射线晶体学技术解析酶的三位结构，并通过计算机辅助分析等方式，深入
探究酶的功能和反应机理。
2.通过建立亮氨酸tRNA及亮氨酰-tRNA合成酶的表达体系，进行对比实验，验证结构分析结果并探讨酶反应机理与酶催化能力等生物化学
特性。
3.探索亮氨酸合成酶在蛋白质生物合成中的作用机制，包括其在转
录后修饰、翻译等生物化学过程中的作用，以及其在细胞增殖及分化中
的生理作用等方面。
研究意义：
本项目的开展可以深入探讨亮氨酸合成酶的结构和功能，揭示其在蛋白质生物合成中的作用机制和生理生化活动，对于生物化学、分子生物学、生物技术等领域都有着重要的理论意义和应用价值，同时，对于理解细胞内生化反应的调控机理以及治疗生物医学领域中的疾病和癌症等方面也具有重要的参考价值。
亮氨酸对奶牛乳腺上皮细胞内乳脂合成相关基因和蛋白表达的影响
亮氨酸对奶牛乳腺上皮细胞内乳脂合成相关基因和蛋白表达的影响赵艳丽;陈璐;史彬林;郭晓宇;闫素梅【摘要】本试验旨在研究亮氨酸(Leu)对泌乳奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)内乳脂合成相关基因和蛋白表达的影响,以探讨Leu对乳脂合成的影响机理.将第3代BMECs随机分为6个处理,每个处理6个重复.6个处理培养液中Leu浓度分别为0.45、0.90、1.80、2.70、3.60和7.20 mmol/L,37℃、5%CO2培养48 h后测定BMECs内甘油三酯(TG)的含量及乳脂合成相关基因和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)与固醇调节元件结合蛋白(SREBP1)蛋白的相对表达量.结果显示:Leu浓度对BMECs内TG含量无显著影响(P>0.05).适宜浓度的Leu显著促进脂肪酸合成酶(FASN)和乙酰辅酶A羧化酶A(ACACA)基因的表达(P<0.05),FASN 基因的相对表达量以1.80~2.70 mmol/L Leu处理、ACACA基因的相对表达量以1.80~7.20 mmol/L Leu处理较高.Leu浓度显著影响BMECs内SREBP1基因及蛋白表达(P<0.05),以1.80 mmol/L Leu的促进效果最好.虽然Leu显著抑制BMECs内脂肪酸结合蛋白3(FABP3)、脂蛋白脂酶(LPL)、乙酰甘油磷酸脂酰转移酶6(AGPAT6)、线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAM)和嗜乳脂蛋白亚家族1成员1(BTN1A1)基因的表达(P<0.05),但只有高浓度(3.60~7.20 mmol/L)的Leu抑制作用较大.综合来看,Leu浓度影响BMECs乳脂合成相关基因及PPARγ和SREBP1蛋白的表达.Leu浓度为1.80~2.70 mmol/L时,对脂肪酸从头合成相关基因及调控因子SREBP1蛋白表达的促进效果较好,对TG合成及脂滴形成相关基因表达的抑制作用较小.%The objects of this study were to study the effects of leucine ( Leu) on expression of genes and pro-teins related with milk fat synthesis in bovine mammary epithelial cells ( BMECs) , in order toinvestigate the mechenism of Leu regulating milk fat synthesis. The third generation of BMECs were divided into six treat-ments with six replicates per treatment, and cultured in culture mediums with 0.45, 0.90, 1.80, 2.70, 3.60 and 7.20 mmol/L Leu, respectively. The triglyceride ( TG) content, the relative expression levels of genes re-lated with milk fat synthesis, as well as the protein relative expression levels of peroxisome proliferator-activa-ted receptor-γ( PPARγ) and sterol regulat ory element binding protein 1 ( SREBP1) in BMECs after 48 h incu-bation at 37 ℃ and 5% CO2 were detected. The results showed that the Leu concentration had no significant effect on TG content in BMECs ( P>0.05) . The optimal Leu concentration significantly up-regulated the gene expression of fatty acid synthase (FASN) and acetyl-CoA carboxylase A (ACACA) in BMECs (P<0.05). The higher gene relative expression level of FASN was observed in 1.80 to 2.70mmol/L Leu treatments, and the higher gene relative expression level of ACACA was observed in 1.80 to 7.20 mmol/L Leu treatments. Leu concentration significantly increased the gene and protein expression of SREBP1 in BMECs ( P<0.05) , and the best promoting effect was observed in 1. 80 mmol/L Leu treatment. Although Leu significantly inhibited the gene expression of fatty acid-binding protein 3 (FABP3), lipoprotein lipase (LPL), 1-acylglycerol-3-phos-phate O-acyltransferase 6 ( AGPAT6) , mitochondria glycerol-3-phosphate acyltrandferase ( GPAM) and buty-rophilin subfamily 1 member A1 (BTN1A1)in BMECs (P<0.05), the higher inhibiting effect was only ob-served in high Leu concentration (3.60 to 7.20 mmol/L) treatments. Taken together, Leu concentration has a significanteffect on the expression of genes related with milk fat synthesis and protein expression of PPARγand SREBP1 in BMECs. The 1.80 to 2.70mmol/L Leu has a better promoting effect on de novo fatty acid synthe-sis genes and SREBP1 protein expression, as well as little inhibiting effect on the expression of genes involved in TG synthesis and lipid droplet formation.【期刊名称】《动物营养学报》【年(卷),期】2017(029)004【总页数】8页(P1319-1326)【关键词】奶牛;乳腺上皮细胞;亮氨酸;乳脂【作者】赵艳丽;陈璐;史彬林;郭晓宇;闫素梅【作者单位】内蒙古农业大学动物科学学院,呼和浩特 010018;内蒙古农业大学动物科学学院,呼和浩特 010018;内蒙古农业大学动物科学学院,呼和浩特 010018;内蒙古农业大学动物科学学院,呼和浩特 010018;内蒙古农业大学动物科学学院,呼和浩特 010018【正文语种】中文【中图分类】S827牛奶总固形物中乳脂含量高达27%，是构成牛奶的重要物质基础，也是衡量乳品质的重要指标。
MAPK在葡萄糖及AngⅡ致血管平滑肌细胞增殖反应中的作用(1)解读
MAPK在葡萄糖及AngⅡ致血管平滑肌细胞增殖反应中的作用(1)】目的：研究丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号途径在葡萄糖（GS）和/或血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)介导大鼠动脉平滑肌细胞促增殖中的作用及其可能的调控机制. 方法：实验以平滑肌细胞蛋白合成速率和蛋白含量为平滑肌细胞增殖的指标，以平滑肌细胞3Ｈ亮氨酸掺入率表示细胞蛋白质合成速率，通过3H胸苷(3HTdR)反映平滑肌细胞DNA的代谢及细胞增殖情况；并通过给予PD098059及高浓度葡萄糖(HG)预处理，观察它们对细胞蛋白合成、DNA代谢及细胞增殖的影响. 结果：① AngⅡ(10-7 mol/L)处理平滑肌细胞，3Ｈ胸苷掺入率明显增高；HG (25×10-3 mol/L)处理平滑肌细胞，3Ｈ胸苷掺入率明显增高；AngⅡ＋HG处理平滑肌细胞3Ｈ胸苷掺入率显著增高. ② AngⅡ增加3Ｈ胸苷掺入的作用可明显被PD098059所抑制；AngⅡ＋HG增高3Ｈ胸苷掺入的作用也可被PD098059所抑制. ③ AngⅡ(10-7 mol/L)处理平滑肌细胞，3Ｈ亮氨酸掺入率明显增高；HG (25×10-3 mol/L)处理平滑肌细胞，3Ｈ亮氨酸掺入率增加；AngⅡ＋HG处理平滑肌细胞3Ｈ亮氨酸掺入率显著增加. ④ AngⅡ增加3Ｈ亮氨酸掺入的作用可部分被PD098059所抑制；AngⅡ＋HG增加3Ｈ亮氨酸掺入的作用可显著被PD098059所抑制. 结论：应用MAPK的特异性抑制剂PD098059抑制血管平滑肌细胞的增殖，证明MAPK激活在GS和/或AngⅡ导致平滑肌细胞增殖反应中有重作用.【关键词】丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)；细胞外信号调节MAP激酶类(ERKs)；血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)；高糖；肌，平滑，血管/细胞学；增殖反应0引言引起高血压及动脉粥样硬化的发病机制十分复杂，其中主的病理改变之一就是血管滑肌细胞增生、肥大，继而造成血管壁弹性下降、管腔变窄. 已证实高葡萄糖及血管紧张素Ⅱ均对血管平滑肌细胞（VSMC）增殖及DNA合成有促进作用，引起VSMC增殖是PKC途径，并与MAPK信号途径的激活有关［1-3］. 本研究通过应用MAPK信号转导途径的特异性阻滞剂PD098059对体外培养的SD大鼠颈动脉平滑肌细胞增殖的影响，进一步探讨MAPK信号途径在心血管疾病中的作用机制，为心血管疾病防治提供依据.1材料和方法1.1材料SD大鼠由等二军医大学实验动物中心提供；ＰD098059和血管紧张素Ⅱ购自Sigma公司；3Ｈ胸苷、3Ｈ亮氨酸、小牛血清、高浓度葡萄糖、DMEM培养基及其他实验用品由长海医院中心实验室提供．［3H］液闪计数检测由长海医院中心实验室完成.1.2SD大鼠颈动脉血管平滑肌细胞培养选用6周龄230 g SD大鼠1只，按参考文献［4］的方法分离颈动脉平滑肌组织，贴壁法原代细胞培养和传代细胞培养VSMC，细胞鉴定后于第4 wk开始传代，第6~8代的细胞用于实验.1.33Ｈ胸苷掺入法测定VSMC的DNA合成量按参考文献［4］的方法改进. 制备4×108 cell/L悬液分别接种于24孔培养板，孵育24 h贴壁后换无血清DMEM培养液24 h，每孔分别加入PD098059(5×10-5 mol/L)预处理30~45 min，给予HG(25×10-3 mol/L)和/或AngⅡ(10-7 mol/L)孵育30 min后，每孔加入 3Ｈ胸苷孵育12 h，弃去培养基，PBS冲洗两次，给予胰蛋白酶消化，加入冷PBS液终止反应为细胞悬液，用自动细胞收集仪经微孔滤膜收集细胞，滤膜烘干后置闪烁瓶中，加入闪烁液后，在闪烁计数仪上测定［3H］的放谢性强度，结果以cpm表示. HG和/或AngⅡ组给予相应的双蒸水预处理，其他均与处理组相同；对照组在预处理及给予AngⅡ时均为双蒸水，其他与处理组相同. （每组3个样本，2 wk后重复实验1次，各组n=6）.1.43Ｈ亮氨酸掺入法测定细胞蛋白合成代谢实验方法及各种处理同1.3，只是用3Ｈ亮氨酸代替3Ｈ胸苷.统计学方法: 结果以x±s表示,统计学用χ2 检验，P<0.05表示差异有显著性意义.2结果2.1GS和/或AngⅡ对SD大鼠颈动脉VSMC的DNA合成速率的影响在无血清培养液中，AngⅡ剂量依赖性增加SD大鼠VSMC的3Ｈ胸苷掺入；GS浓度依赖性增加SD大鼠VSMC的3Ｈ胸苷掺入. 以10-7 mol/L作为AngⅡ的标准实验浓度；以25×10-3 mol/L作为GS的标准实验浓度. AngⅡ处理VSMC可使3Ｈ胸苷掺入明显增加（增加183.0%），该作用可被PD098059明显抑制（PD098059预处理组比AngⅡ处理组降低35.0%,增加被抑制52.3%,表1）. HG处理可使3Ｈ胸苷掺入明显增加（增加53.0%）；HG AngⅡ处理可使3Ｈ胸苷掺入显著增加（增加239.0%），该作用可被PD098059显著抑制（PD098059预处理组比HG AngⅡ处理组降低55.0%,抑制79.0%,表1）.作者：张严高，秦永文，吴弘，王文清，文军慧，李闻捷【关键词】丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)；细胞外信号调节MAP激酶本篇论文是由3COME文档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站的，论文版权属原作者，请不用于商业用途或者抄袭，仅供参考学习之用，否者后果自负，如果此文侵犯您的合法权益，请联系我们。
氨基酸调控细胞自噬的分子机制
氨基酸调控细胞自噬的分子机制宋志文; 金成龙; 严会超; 王修启【期刊名称】《《动物营养学报》》【年(卷),期】2019(031)010【总页数】8页(P4494-4501)【关键词】氨基酸; 细胞; 自噬; 分子机制【作者】宋志文; 金成龙; 严会超; 王修启【作者单位】华南农业大学动物科学学院广东省动物营养调控重点实验室国家生猪种业工程技术研究中心广州 510642【正文语种】中文【中图分类】S811.3自噬是当前生命科学领域研究的热点及难点。
在正常生理状态下，自噬可以保持在一个相对稳定的水平，从而调节蛋白质周转代谢的平衡。
研究表明，诸多因素都会诱导细胞发生强烈的自噬反应，如营养缺乏、环境应激以及运动刺激等[1-4]。
氨基酸作为蛋白质合成的基本单位，为动物细胞代谢和体组织生长发育所必需。
当氨基酸不足时，则会诱导自噬等一系列不良反应[5]，但不同氨基酸缺乏或供给与自噬的调控关系尚不完全清楚。
1 自噬概述营养缺乏可以导致细胞分解代谢途径的激活，这种激活途径是一个保守的过程，在许多细胞生长发育过程中都发挥着极其重要的作用[6-8]。
自噬是细胞受到外部环境刺激时的一种应激反应[9]，其标志是微管相关蛋白质1轻链3(microtubule-associated protein l light chain 3，LC3-Ⅰ)转化成微管相关蛋白质2轻链3(microtubule-associated protein 2 light chain 3，LC3-Ⅱ)。
因此，LC3也被认为是自噬膜形成和自噬起始的标志物[10-11]。
在哺乳动物中，有关细胞自噬的研究已十分深入，自噬对细胞代谢水平的维持、着床前胚胎的发育、新生儿的存活和器官的发生都是至关重要的[12]；同时，自噬也被证明与许多疾病和癌症的发生及预防有着密切的关系[13-15]。
自噬有3种不同的类型，包括宏观自噬、微观自噬以及分子伴侣介导的自噬[16]，虽然它们都会因营养缺乏而被激活，但它们在底物特异性、膜来源和向溶酶体传送的方式等方面都有所不同[17-18]。
不平衡氨基酸的研究进展
不平衡氨基酸的研究进展金玉坤【摘要】肿瘤组织比机体能更有效地夺取氨基酸,目前临床各种氨基酸液均促进肿瘤生长,利用不平衡氨基酸,可达到抑制肿瘤生长的同时又改善机体的营养状况.大剂量精氨酸能抑制肿瘤生长;亮氨酸能增强去缬氨酸的抑瘤效应,并且能改善宿主的营养状况;蛋氨酸缺乏,将对抗肿瘤药物起着"增效剂"的作用;去缬氨酸的不平衡氨基酸抑瘤效果最为显著;谷氨酰胺浓度下降则肿瘤生长受抑制;谷氨酰胺与天冬酰胺其拮抗剂由于阻碍核酸代谢而被试用于抑制癌的增殖.针对不同类型的肿瘤制定相应的不平衡氨基酸,能更有效地抑制肿瘤生长,并改善机体营养.【期刊名称】《医学综述》【年(卷),期】2010(016)011【总页数】3页(P1647-1649)【关键词】不平衡氨基酸;肿瘤;营养;抗癌治疗【作者】金玉坤【作者单位】天津市职工医院内科,天津,300050【正文语种】中文【中图分类】R735.7肿瘤患者常因伴有营养不良,导致体力下降,免疫力低下,乃至代谢紊乱,产生各种并发症,加速患者的死亡。
因此,营养支持对肿瘤患者非常重要。
营养支持虽然能改变肿瘤患者的营养状况,但亦能促进肿瘤的生长。
在营养支持促进肿瘤生长的诸多因素中,主要与氨基酸制剂的组成密切相关[1]。
利用氨基酸平衡障碍原理,人为地改变氨基酸液的常规剂量,制成某种氨基酸过量或减少乃至缺失的不平衡氨基酸,可导致肿瘤细胞内蛋白质代谢紊乱、合成障碍,从而达到既能抑制肿瘤生长,又能改善患者营养状况的目的[2]。
1 肿瘤氨基酸的代谢陆伟等[3]曾对人肝癌细胞系 SMMC-7721体外培养,观察培养液氨基酸成分的动态变化,结果发现肝癌细胞体外增殖过程对谷氨酰胺、苏氨酸、牛磺酸、精氨酸的消耗明显增加。
精氨酸在大多数研究中被认为具有抑制瘤细胞增殖、降低转移和复发率的作用,Wheatley等[4]的研究结果提示,精氨酸在体内通过调节免疫机制而具有一定的抗肿瘤作用。
血浆氨基酸池被认为是肿瘤氨基酸主要来源,从而导致了机体氨基酸代谢紊乱,肿瘤因此被称为“氮的陷阱”。
能量代谢障碍与阿尔茨海默病_张炙萍
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中国老年学杂志 2007年 9 月第 27卷
神经元能量代谢 底物 。 在老 化和 AD过程 中氧 化损 伤使 中间 代谢的两个酶活性受 抑制 :谷氨酰胺合成酶和甘油醛 -3-磷酸脱 氢酶 。 前者在平均 70岁的老 年人比 年青 (平均 29岁 )成 人减 少 45%。 AD脑比正 常老 年人 再减少 40%。 谷 氨酰 胺合 成酶 失活的后果是氨中毒 、氨应激促 进老化 和 AD的 神经元 退行性 变 , 因该酶消耗进入脑内的 98%的氨 , 与此 相关的 α-酮 戊二酸 脱氢酶活性 减少 50%以 上 , 细 胞色 素 氧化 酶 减 少 25%以 上 。 由于甘油醛 -3-磷酸脱氢酶活 性降低 , 而 促进磷 酸戊 糖途径 , 但 这 一途 径并 不 产生 ATP, 从 而使 神 经元 处于 低 代谢 状 态 〔11〕。 能量代谢障碍 被认 为与 线粒 体相 关 酶系 的缺 陷有 关 。 Bubber 等对确诊 AD患者脑 标本中 三羧 酸循 环重 要酶 的活 性进 行了 测量 , 结果 发现 , 与对照 组相比 , AD患者脑 内 PDHC的 活性下 降了 41%, 异柠檬酸脱氢 酶 (isocitratedehydrogenase)的 活性下 降了 27%, KGDHC的 活性 下降 了 57%, 而 琥珀 酸脱 氢酶 和苹 果酸脱氢酶的活性 , 分别上升了 44%和 54%, 三羧酸循 环其他 酶的活性无变化 〔12〕。 线粒体电子传递 链包括 5 个不同 的蛋白 质复合 体 :复合 体 Ⅰ (NADH:辅 酶 Q氧 化还 原酶 ), 复 合 体 Ⅱ (琥珀酸盐辅酶 Q氧化还原酶 ), 复合体 Ⅲ (细胞色素 C氧化还 原酶 ), 复合体 Ⅳ (细胞色素 C氧化酶 ), 复合体 Ⅴ (ATP合酶 )。 线粒体电子传递链中 一个或多个 酶活性 的丧失 或是 ATP合酶 活性的下降均可使脑 能量储备减少 。 Kish等自 1992年起进行了 9项独立研究 , 结果 均表明 AD 患者脑内 CO的活性普遍轻 度降低 (5项研 究中 P<0.05)〔13〕。 在 AD受累脑区中 , 扣带前回是 最早发生 和能量 代谢障 碍程度 最高的脑区 。 Valla等通过 检测 AD患 者和健 康人 脑扣带 前回 (23区 )中 CO的活性 , 作为衡 量胞内 能量代谢 强度 的指标 , 结 果发现 , 与对照组相比 , AD患 者扣带 前回六 层细胞 中 CO的活 性均下降 , 而其 邻近 的 运动 皮层 却无 显 著改 变 〔14〕。 Bosetti等 分析了 AD患者血小板 、运动皮层和海马内分离的线粒体中 CO 和 F(1)F(0)-ATP酶的活 性 , 结果显 示 , 与对 照组相 比 , AD患 者血小板内 CO活性下降了 30%, 海马 内 CO活性下 降了 35% ～ 40%, 运动皮层内酶活性未改 变 。 对照 组和 AD患者 脑组织 和血小板内 F(1)F(0)-ATP酶水解活性无差 异 , 而且 两组样本 血小板线粒体中 ATP合 成效率 也相 同 〔15〕。 以 上结果 说明 CO 是能量代谢障 碍的 靶 点之 一 , 无 论是 在脑 相 关区 域还 是 血小 板 , 而 CO活性的下降使组织更 容易受到 兴奋性 毒性和 低氧的 影响 。 细胞色素 C氧化酶 (复合体 Ⅲ )和 ATP合 酶 (复合体 Ⅴ )是 线粒体电子传递链中的重要酶 系 。 Kim等检 测了 AD患者脑区 内复合体 Ⅲ核心蛋白 和复合体 Ⅴ的 β 链的蛋白水平 , 结果发现 AD患者颞叶皮层 内复合体 Ⅲ 核心蛋白 1 的水平 显著下 降 〔16〕。 线粒体呼吸链酶活 性的 下降使 细胞 呼吸受 损 , 能量 生成减 少 , 还可引起活性氧 (reactiveoxygenspecies, ROS)的产生和神经细 胞的凋亡 。
C-Met
c-met是一种由c-met原癌基因编码的蛋白产物，为肝细胞生长因子受体，具有酪氨酸激酶活性，与多种癌基因产物和调节蛋白相关，参与细胞信息传导、细胞骨架重排的调控，是细胞增殖、分化和运动的重要因素。
目前认为，c-met与多种癌的发生和转移密切相关，研究表明，许多肿瘤病人在其肿瘤的发生和转移过程中均有c-met过度表达和基因扩增。
本文就c-met在大肠肿瘤中的作用作一综述。
1 c-met基因的结构和功能1984年Cooper在研究人骨肉瘤Hos细胞系时，克隆出了一个具有转化活性的片段，定名为c-met ［1］。
c-met位于人类7号染色体长臂（7q31）。
c-met基因大小约110kb，包括21个外显子。
启动子区域有许多调控序列，如IL-6和HGF等［2］。
在不同组织和细胞系中c-met的转录产物有多种。
如9.0、7.0、6.0、5和3.5的mRNA，这可能是由于转录的启始位点及剪切的方式不同造成的。
各种转录产物的功能尚不清楚，但某些转录产物只在特定的癌组织中出现，因此，这些转录产物可能与特定组织的癌变有关。
9.0kb转录产物较普遍存在，是编码正常膜受体的转录产物。
其前体蛋白分子量为140KD，经糖基化作用产生170KD的糖蛋白。
进而切割成5 0KD的α亚基和145kD的β亚基，两个亚基以二硫键相连形成190kD的成熟受体蛋白。
成熟的受体蛋白位于细胞膜上。
β亚基有胞外区、跨膜区和胞内区。
α亚基只有胞外部分，借助于二硫键附于β亚基上。
α亚基和β亚基的胞外区是配体识别部位，而胞内部分具有酪氨酸激酶活性。
c-met受体的配体是肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF），也称为离散因子（scatter facˉtor）。
由于c-met在不同细胞、不同分化阶段作用的底物不同，使其在特定的条件下表现出多种功能:（1）促进肝细胞、内皮细胞和黑色素细胞的分裂;（2）引起上皮细胞的分散，在胚胎发育过程中控制细胞的移动;（3）诱导细胞形态变化［3］。
FAA的在机体中作用及其作用机制
• 首先，Gln上皮细胞的再生提供能源和氮源， 肠粘膜上皮细胞对Gln的利用超过其它任何氨 基酸，应激时更为明显。
• 其次，Gln间接刺激了肠道营养作用的激素分 泌，正常肠遭的结构和功能的维持需一定的胃 肠道激素的作用。
• 第三，GSH在Gln的营养中也起一定作用。仔 猪在断奶后，肠道的组织结构会发生明显的变 化，表现为小肠上皮细胞吸附大分子能力下降， 以及小肠上皮细胞合成消化酶的功能及吸收氨 基酸和葡萄糖的功能丧失。
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（2）BCAA与外周疲劳
• 引起运动性疲劳的外周机制很多, 但细胞及细胞器结 构的完整及功能的良好与运动能力有着密切的关系。 线粒体结构及功能的良好是能量代谢的重要前提, 而 生物膜的流动性变化将影响线粒体的电子传递和氧化 磷酸化的进行。
• 补充 BCAA可明显降低大鼠急性运动后骨骼肌线粒体 膜黏度系数, 增加线粒体膜的流动性, 保护线粒体膜的 脂双层的稳定性, 保证线粒体的生物功能的正常发挥, 起到减轻运动性疲劳, 提高运动能力的作用。其研究 同时也表明 BCAA 能抑制游泳大鼠血乳酸浓度、LDH 活性及骨骼肌 LPO 的升高幅度。补充 BCAA 能显著 降低长时间运动后血浆CK 和 LDH 活性, 表明 BCAA 补充能减少耐力运动引起的肌细胞破坏, 从而延缓运 动性疲劳。
激素分泌而影响机体蛋白质代谢。 • 4.我国学者认为外源性补充BCAA可以增加血清BCAA
的水平, 运动使骨骼肌摄取 3H-Leu 显著增加,更深入 研究认为Leu的代谢产物β-羟-β-甲基丁酸( HMB) 具 有调节蛋白质代谢的作用。
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2.3.2BCAA与运动疲劳
• 大量研究表明,运动性中枢疲劳与机体某 些氨基酸的代谢有密切关系, 其研究多集 中在BCAA 的补充方面;外周疲劳的研究 多与物质代谢、细胞结构的完整及功能 有密切关系。
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营养学报2011年第33卷第1期 1亮氨酸对原代培养大鼠骨骼肌细胞葡萄糖摄取及蛋白激酶B表达的影响刘锐，郝丽萍，李想，马俊，刘皓，杨雪锋（华中科技大学同济医学院营养与食品卫生学系，武汉 430030） 【摘 要】目的以原代培养的大鼠骨骼肌细胞为研究对象，观察亮氨酸对骨骼肌细胞及渥曼青霉素 (wortmannin) 处理后葡萄糖摄取能力及胰岛素信号通路关键分子蛋白激酶B (AKT) 表达的影响，从而为探讨亮氨酸与胰岛素抵抗的关系和相关机制提供依据。
方法组织块法培养大鼠原代骨骼肌细胞，不同浓度的亮氨酸（0, 0.4, 2.0, 4.0, 8.0mmol/L）作用80min或45min，酶法测定基础状态下和胰岛素刺激下葡萄糖摄取能力，确定亮氨酸作用的最佳浓度和作用时间；在此基础上，应用PI-3K抑制剂wortmannin作用30min，测定葡萄糖摄取能力，Western blot检测AKT及磷酸化AKT 表达水平。
结果胰岛素刺激状态下，2mmol/L亮氨酸作用45min骨骼肌细胞葡萄糖摄取能力达最大；2mmol/L亮氨酸干预可改善wortmannin对胰岛素刺激下骨骼肌细胞葡萄糖摄取的抑制作用，显著增强胰岛素信号传导关键分子pSer473 AKT的表达。
结论亮氨酸可改善骨骼肌细胞胰岛素抵抗。
这种作用不完全依赖于PI-3K胰岛素信号传导通路，并且可能与其增强AKT磷酸化水平有关。
[营养学报，2011，33（1）：1－4,9]关键词：亮氨酸；葡萄糖摄取；蛋白激酶B；渥曼青霉素中图分类号： R151.2 文献标识码：A 文章编号：0512-7955（2011）01-0001-05EFFECT OF LEUCINE ON GLUCOSE UPTAKE AND AKT EXPRESSION IN PRIMARY CULTURED SKELETAL MUSCLE CELLS OF RATSLIU Rui，HAO Li-ping，LI Xiang，MA Jun，LIU Hao，YANG Xue-feng (Department of Nutrition and food Health, Tongji Medical College, Hua Zhong University of Science and Technology, Wu Han 430030, China) 【Abstract】Objective To examine the effects of leucine on glucose uptake and AKT (PKB, protein kinase B) expression in normal and wortmannin treated primary cultured skeletal muscle cells of rats. Method Exposure to different doses of leucine (0, 0.4, 2, 4, 8 mmol/L) with or without insulin (100 nmol/L) for 80 min or 45min, 2-deoxyglucose uptake of skeletal muscle cells was determined by nonradioisotope enzymatic microplate assay. Cells were pretreated with or without wortmannin for 30 min, then incubated with 2 mmol/L leucine or/and insulin for 45 min. Western blot was used to detect AKT and phosphoAKT (Ser473) expression. Results Glucose uptake of primary cultured skeletal muscle cell reached maximum when exposed to 2mmol/L leucine for 45 min. Leucine allowed insulin to activate AKT and improved glucose uptake when PI-3K was blocked. Conclusion Leucine can promote glucose uptake in normal and wortmannin-treated skeletal muscle cells. The underlying mechanism is partly independent on PI-3K insulin signaling and associated with the phosphory- lation of AKT. [ACTA NUTRIMENTA SINICA, 2011, 33(1)：1－4,9]Key words：leucine；glucose uptake； AKT； wortmannin近年来，大量的研究表明亮氨酸不仅仅是一种必需氨基酸，而且是一种重要的营养信号分子，参与了如调节蛋白质合成过程中翻译的启动、胰岛素信号传导、能量代谢等多种重要的生物学过程[1]。
尤其是亮氨酸在改善胰岛素抵抗方面的作用受到了越来越多的关注。
最新的研究[2-3]表明：亮氨酸可显著改善高脂膳食引起的高血糖, 改善脂肪细胞的胰岛素抵抗。
临床上，对于肥胖、2型糖尿病患者高亮氨酸膳食可以降低餐后血糖和胰岛素水平，并有利于稳定血糖水平和改善胰岛收稿日期 2010-07-05基金项目国家自然科学基金（No. 30800907）；湖北省卫生厅人才基金（No. QJX2008-52）；武汉市科技攻关计划项目(No. 200852199599)作者简介刘锐（1985 －），女，硕士研究生, E-mail：amicable123@； 通讯作者：杨雪锋2 Acta Nutrimenta Sinica,Feb.,2011, V ol.33 No.1 素抵抗[4]。
但由于研究对象的差异，研究设计的不同，目前的研究结论不尽一致。
本实验重在探讨亮氨酸对原代培养大鼠骨骼肌细胞及渥曼青霉素（wortmannin）处理后葡萄糖摄取的影响，同时检测胰岛素信号分子AKT蛋白表达水平及磷酸化水平，为研究亮氨酸与胰岛素抵抗的关系和相关机制提供理论依据。
1 材 料 与 方 法1.1主要试剂三乙醇胺（triethanolamine hydrochloride, TEA）、刃天青、2-脱氧葡萄糖(2-deoxyglucose,2DG)、葡萄糖6磷酸脱氢酶、己糖激酶、三磷酸腺苷(adenosine 5’-triphosphate disodium- salt,ATP)、黄递酶、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(β-nicotineamide adenine dinucleotide phosphate，β-NADP+)、牛血清白蛋白(BSA)、 wortmannin（美国Sigma公司）；DMEM/F12培养基（美国Gibco公司）；96孔酶标板、培养皿（日本Costar公司）；亮氨酸（日本 Wako公司）；兔抗phospho-AKT(Ser473)多克隆抗体，鼠抗β- actin、兔抗AKT-2（美国Cell Signaling 公司）。
1.2方法1.2.1 细胞培养：取出生4～5d的SD乳鼠，采用组织块培养法将骨骼肌组织剪碎约1mm×1mm×1mm后均匀接种于培养皿中，用含10%胎牛血清的F12/DMEM（1:1）培养基培养。
第10日待大量的肌管形成，固定细胞，电镜下观察其形态并鉴定。
1.2.2 葡萄糖摄取能力的测定：(1)亮氨酸处理 将原代培养骨骼肌细胞消化后以每孔4×103密度接种在96孔酶标板上，待肌管形成后吸弃培养基用克-林二氏重碳酸盐缓冲液(Krebs-Ringer bicarbonate, KRBB)缓冲液（pH7.4）洗3遍。
加入不同浓度的亮氨酸(0，0.4，2，4，8 mmol/L)和（或）胰岛素作用80 min或45 min，测定葡萄糖摄取能力，确定亮氨酸作用剂量和时间。
(2) wortmannin处理 根据上述实验结果最终确定亮氨酸作用剂量为2 mmol/L，作用时间为45 min。
实验组加入wortmannin(100 nmol/L)预处理 30 min，对照组加入等量的KRBB缓冲液。
作用结束后，加入 2 mmol/L的亮氨酸和（或）胰岛素 (100 nmol/L)作用45 min，测定葡萄糖摄取能力。
(3)葡萄糖摄取的测定：参照Norio Yamamoto的方法[5]，采用比放射性同位素标记方法灵敏度更高的酶促级联放大反应。
主要原理如下：骨骼肌细胞摄取的2-脱氧葡萄糖在外源性己糖激酶催化下生成2-脱氧葡萄糖-6-磷酸(2-deoxyglu- cose-6-phosphate，2DG6P)；通过以刃天青为底物的级联酶促放大体系反应，生成可自发荧光的间苯二酚，荧光检测。
具体步骤：细胞以含1 mmol/L 2DG的改良的KRBB缓冲液50 μl作用30 min后，加入25 μl 0.1 mol/L 的NaOH，反复冻融细胞，85℃孵育40 min以消除内源性的NAD(P)H, NAD(P)+，终止后加入25 μl 0.1 mol/L HCL中和NaOH；每孔加入25 μl 0.15 mol TEA，150 μl酶促反应溶液（50 mmol TEA，50 mmol KCl, 0.5 mmol MgCl2, 0.02% BSA, 0.67 mmol ATP， 12 μmol NADP+，25 μmol 刃天青，5.5 μmol/min·ml 己糖激酶, 16 μmol/min·ml 葡萄糖6磷酸脱氢酶 1 mol/min·ml 黄递酶）37℃作用90 min。
激发波590 nm，发射波530 nm读取各孔的吸光度，通过荧光强度反映葡萄糖摄取能力。
1.2.3 AKT-2及pSer473 AKT-2蛋白表达水平的检测：细胞培养及亮氨酸浓度和孵育时间同上，用磷酸化蛋白裂解液裂解细胞后提取全细胞蛋白。
经蛋白质定量，25 μl样品电泳分离。
加入一抗（稀释度：小鼠抗β-actin单克隆抗体1:1000；兔抗AKT单克隆抗体1:1000；兔抗pSer473 AKT多克隆抗体1:2000）室温孵育2h；加入辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）标记抗小鼠IgG抗体、HRP标记抗兔IgG抗体（稀释度均为1:3000）室温孵育1h。