巨噬细胞培养

腹腔巨噬细胞的获取和培养
1.实验目的：
掌握腹腔巨噬细胞的获取方法及其培养技术
2.实验原理：
利用巨噬细胞具有趋化运动，吞噬，分泌和参与免疫调节的功能，向成熟大鼠腹腔内注射煮沸灭菌的4%的硫代乙酸钠，使血液中的单核细胞趋化至腹腔，即巨噬细胞。

硫代乙酸钠刺激后4日腹腔内巨噬细胞数量较多且其他细胞成分少（如淋巴细胞）。

3.实验器材及材料：
（1）成年大鼠
（2）手术器械：解剖剪，解剖镊和止血钳
（3）其他用品：注射器，培养皿和吸管，酒精及酒精棉球等
（4）清洗液：HBSS和不含Ca和Mg的HBSS。

（5）培养液：DMEM（加10%血清）
（6）细胞计数板和计数器
4.实验步骤：
（1）取细胞4d前，动物腹膜腔内注射5-10ml 4%硫代乙酸钠。

（2）乙醚麻醉后，拉颈处死动物，经颈总动脉放血。

将动物仰置，
剪去腹壁皮毛，用70%酒精消毒。

（3）沿正中线剪开腹壁，将5-10mlHBSS注入腹膜腔，用吸管反复冲洗腹膜腔的细胞。

（4）吸出腹膜腔的细胞悬液，离心（1000r/min,10min）。

（5）用培养液混悬沉淀细胞，将细胞悬液加入培养皿中，培养2h. （6）吸去培养液，用不含Ca2+和Mg2+的HBSS清洗2次，去除漂浮的细胞，得到附着于培养皿底部的巨噬细胞。

（7）采用刮取法或酶消化法取出贴壁的巨噬细胞，离心（1000r/min,10min）。

用培养液混悬细胞，将细胞调整至1-3X106个/ml,继续培养或直接用于实验研究。

5.实验结果分析：
（1）除巨噬细胞外，自腹膜腔洗出的细胞还含有淋巴细胞等。

由于淋巴细胞不贴壁，培养2h后用HBSS清洗，可除去淋巴细胞和其他悬浮细胞。

最终获得95%以上是巨噬细胞。

（利用巨噬细胞贴壁能力较其他细胞强）。

（2）巨噬细胞大小约50μm,一般不分裂，在培养条件下可存活1-3周。

直接从腹腔取得的巨噬细胞为静止性的，呈圆形，伪足不明显。

经硫代乙酸钠刺激可获得大量的炎症性巨噬细胞，培养2h后，细胞多呈梭形并伸出伪足，即“有头有尾”，具有较强的变形运动和吞噬能力。

6.实验讨论及注意事项：
(1)HBSS液应从4℃冰箱中取出，可抑制细胞快速代谢，保持活力。

(2)沿腹白线剪开腹腔皮肤至剑突时，应小心剪到肝脏而造成血细胞的污染。

(3)发现有腹壁小血管出血时，应及时用止血钳止血，以免污染腹膜腔。

(4)去腹膜腔巨噬细胞时，吸管不要接触腹壁，以免引起间皮细胞和成纤维细胞的污染。

（5）细胞重悬时，吹打要保持一定的速度，滴管要深入液面以下且吸的时候滴管口应仍然保持在液面下，这样才能使细胞充分混匀且不会有气泡产生。

但同时也需注意吹打次数，过分吹打也会影响细胞活力。

（6）移入培养皿中培养时应逐滴滴入不同部位，最后靠其表面张力形成一个液面，该做法可避免直接加入细胞悬液时所造成的细胞在培养皿中分布不均匀。

（7）移入培养皿中培养时切记所有操作均不要将自己的手胳膊从培养皿上方经过。