巨噬细胞培养
巨噬细胞的培养方法
巨噬细胞的培养方法
巨噬细胞的培养方法如下：
1. 获取巨噬细胞：常用的来源包括小鼠、人类等。
可以通过小鼠或者人类的骨髓、外周血或者器官（例如脾脏、肺）中分离巨噬细胞。
2. 细胞培养基的准备：常用的细胞培养基包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）等。
细胞培养基需要加入适量的无菌胎牛血清（FBS）或者人工合成的替代物，例如脂质体。
3. 细胞的分离：将获得的组织样本经过适当的处理，例如组织碎片化、酶消化等，使细胞释放出来。
4. 细胞的培养：将分离得到的巨噬细胞悬浮于细胞培养基中，通过离心将巨噬细胞沉淀在培养皿的底部。
5. 进一步培养：将巨噬细胞培养在37C的恒温培养箱中，提供合适的氧气和二氧化碳浓度，适当转移和补充新鲜的培养基。
6. 细胞的检测和分离：通过显微镜观察巨噬细胞的形态和数量，也可以使用流式细胞仪等方法对细胞进行检测和分析。
这些是常规的巨噬细胞培养方法，具体操作细节可能根据实验目的和细胞来源的不同而有所变化。
巨噬细胞培养
腹腔巨噬细胞的获取和培养1.实验目的：掌握腹腔巨噬细胞的获取方法及其培养技术2.实验原理：利用巨噬细胞具有趋化运动，吞噬，分泌和参与免疫调节的功能，向成熟大鼠腹腔内注射煮沸灭菌的4%的硫代乙酸钠，使血液中的单核细胞趋化至腹腔，即巨噬细胞。
硫代乙酸钠刺激后4日腹腔内巨噬细胞数量较多且其他细胞成分少（如淋巴细胞）。
3.实验器材及材料：（1）成年大鼠（2）手术器械：解剖剪，解剖镊和止血钳（3）其他用品：注射器，培养皿和吸管，酒精及酒精棉球等（4）清洗液：HBSS和不含Ca和Mg的HBSS。
（5）培养液：DMEM（加10%血清）（6）细胞计数板和计数器4.实验步骤：（1）取细胞4d前，动物腹膜腔内注射5-10ml 4%硫代乙酸钠。
（2）乙醚麻醉后，拉颈处死动物，经颈总动脉放血。
将动物仰置，剪去腹壁皮毛，用70%酒精消毒。
（3）沿正中线剪开腹壁，将5-10mlHBSS注入腹膜腔，用吸管反复冲洗腹膜腔的细胞。
（4）吸出腹膜腔的细胞悬液，离心（1000r/min,10min）。
（5）用培养液混悬沉淀细胞，将细胞悬液加入培养皿中，培养2h. （6）吸去培养液，用不含Ca2+和Mg2+的HBSS清洗2次，去除漂浮的细胞，得到附着于培养皿底部的巨噬细胞。
（7）采用刮取法或酶消化法取出贴壁的巨噬细胞，离心（1000r/min,10min）。
用培养液混悬细胞，将细胞调整至1-3X106个/ml,继续培养或直接用于实验研究。
5.实验结果分析：（1）除巨噬细胞外，自腹膜腔洗出的细胞还含有淋巴细胞等。
由于淋巴细胞不贴壁，培养2h后用HBSS清洗，可除去淋巴细胞和其他悬浮细胞。
最终获得95%以上是巨噬细胞。
（利用巨噬细胞贴壁能力较其他细胞强）。
（2）巨噬细胞大小约50μm,一般不分裂，在培养条件下可存活1-3周。
直接从腹腔取得的巨噬细胞为静止性的，呈圆形，伪足不明显。
经硫代乙酸钠刺激可获得大量的炎症性巨噬细胞，培养2h后，细胞多呈梭形并伸出伪足，即“有头有尾”，具有较强的变形运动和吞噬能力。
人巨噬细胞体外培养的形态
人巨噬细胞体外培养的形态人巨噬细胞是一类非常重要的免疫细胞，它们在人体内起着清除病原微生物和废弃细胞的重要作用。
虽然在体内的功能已经得到了广泛的研究，但人巨噬细胞的体外培养形态却是一个相对较少被关注的领域。
人巨噬细胞的体外培养需要一定的条件和培养基。
在细胞培养实验室中，我们通常使用培养皿来进行细胞培养，这样可以提供一个适合细胞生长的环境。
在培养皿中，人巨噬细胞呈现出悬浮生长的状态，细胞的形态呈现多样化，有些细胞呈现出圆形或椭圆形，有些则呈现出星形或分枝状。
人巨噬细胞的形态特点也与其功能密切相关。
在体外培养中，我们可以观察到人巨噬细胞的吞噬能力。
当人巨噬细胞遇到病原微生物或废弃细胞时，它们会通过伸展出细胞伪足将其包裹并吞噬进细胞内部，完成吞噬过程后，细胞的形态会发生明显的变化，呈现出更大和更圆的形态。
除了吞噬能力，人巨噬细胞还具有分泌细胞因子的能力。
在体外培养中，我们可以观察到人巨噬细胞释放细胞因子的过程。
细胞因子是一类具有调节和介导免疫反应的蛋白质，它们可以促进炎症反应和免疫细胞的活化。
当人巨噬细胞受到刺激时，它们会释放细胞因子，这些细胞因子可以引起周围细胞的炎症反应，并吸引其他免疫细胞参与到炎症反应中来。
在人巨噬细胞的体外培养过程中，我们还可以观察到细胞的增殖和分化现象。
人巨噬细胞可以通过细胞分裂的方式增殖，从而维持其在体外培养中的数量。
此外，人巨噬细胞还可以分化为不同的亚型，如经典型和替代型巨噬细胞，这些亚型在免疫反应中具有不同的功能和调控机制。
总的来说，人巨噬细胞的体外培养形态丰富多样，反映了其在免疫反应中的复杂功能和调控机制。
通过对人巨噬细胞的体外培养研究，我们可以更深入地了解其生物学特性和免疫功能，为免疫治疗和疾病治疗提供理论和实践基础。
高糖培养巨噬细胞的原理
高糖培养巨噬细胞的原理
高糖培养巨噬细胞是一种常用的细胞培养方法，通过提供高浓度的葡萄糖供细胞代谢，促进细胞增殖和生长。
巨噬细胞是免疫系统中的一类重要的吞噬细胞，具有清除病原体、参与免疫调节等功能。
为了保证巨噬细胞在体外培养过程中的正常功能和活性，常需提供适宜的培养条件。
高糖培养巨噬细胞的原理主要有以下几点：
1.能量供应：巨噬细胞代谢过程中需要大量的能量，葡萄糖是主要供能物质之一。
通过提供高浓度的葡萄糖，可以满足细胞能量需求，促进细胞的生长和增殖。
2.代谢产物：高糖培养环境下，细胞可以更充分地代谢葡萄糖，产生较多的代谢产物，如乳酸和丙酮酸等。
这些代谢产物有助于调节细胞内环境，维持细胞的正常生理状态。
3.防止细胞凋亡：在高糖环境下，细胞能够更好地维持细胞内的渗透平衡，防止细胞因渗透压差异而引发细胞凋亡。
需要注意的是，在高糖培养巨噬细胞时，应根据不同的细胞类型和研究目的，调整葡萄糖浓度和培养时间，以达到最佳的细胞生长和功能表达效果。
巨噬细胞培养方法
巨噬细胞培养方法
实验材料及实验步骤
实验原理
1 正常情况下，动物腹腔中及腹腔的浆膜表面都有一定数量的巨噬细胞。
为取得更多的巨噬细胞，向动物腹腔中注射刺激剂（硫代乙酸钠），促进机体产生大量巨噬细胞，通过腹腔灌洗获取细胞。
2巨噬细胞的黏附能力明显强于其它类型的细胞。
利用巨噬细胞与其它细胞发生黏附的时间差或者贴壁能力的不同，可以从成分混杂的细胞悬液中分离出纯度较高的巨噬细胞。
实验材料
1 材料来源成年大鼠
2 手术器械解剖剪、解剖镊和止血钳
3 清洗液HBSS和不含Ca2+、Mg2+的HBSS
4 培养液DMEM,
操作步骤
1 大鼠腹膜腔注射10ml 4%硫代乙酸钠
2 4天后拉颈处死，颈动脉放血，医用碘酒、75%乙醇消毒
3 剪开腹壁，用10ml含Ca2+、M g2+ HBSS注入腹膜腔，用吸管反复冲洗腹膜腔的细胞
4 取细胞悬液离心1000r/min,离心10min
5 用DMEM混悬细胞，接种于培养皿内培养半小时
6 用不含Ca2+、Mg2+的HBSS清洗2次，除去漂浮的细胞得到附着于培养皿底壁的巨噬细胞
7 加入培养液继续培养。
GNB14170 HBSS缓冲液成分表
GNB14025 HBSS缓冲液成分表。
巨噬细胞培养
3.刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。
4.泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g：浓硫酸200ml：蒸馏水1000ml）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。
3. 胶帽，离心管帽烘干后只能在2％氢氧化钠溶液中浸泡6-12小时（切记时间不能过长），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。
4. 胶头可用75％酒精浸泡5分钟，然后紫外照射后使用即可。
5.塑料培养瓶，培养板，冻存管：
6.其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸气消毒，可用70％酒精浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子，放在超净台台面上，直接暴露在紫外线下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用2—3周时间洗除残留的氧化乙烯。用20000—100000rad的r射线消毒塑料制品效果最好。
为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆，可在纸包装后，用密写墨水作好标记。其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水，在包装纸上作一记号，平时这种墨水不带痕迹，一经高温，即出现字迹，从而可以判定它们是否消毒。密写墨水的配制：氯化钻(CoC12·6H2o)2g，30％盐酸10m1，蒸馏水88m1。
注意事项：
1.严格执行高压锅的操作规程：高压消毒时，先检查锅内是否有蒸馏水，以防高压时烧干，水不能过多因为其将使空气流畅受阻，会降低高压消毒效果。检查安全阀是否通畅，以防高压时爆炸。
1.小鼠颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡3分钟，取出小鼠，置于无菌纸上，腹面朝上；
2.用镊子提起小鼠下腹部皮肤，剪开一小口，撕开皮肤，完全暴露腹膜；
巨噬细胞的培养方法
巨噬细胞的培养方法
巨噬细胞，嘿，这可是个有趣的小家伙呢！要培养它们呀，那可得有点小技巧。
首先呢，咱得给它们准备一个舒服的“家”，就像咱给自己找个舒服的床一样。
这就需要合适的培养基啦。
培养基就像是巨噬细胞的食物和房子的结合体，得有各种营养成分，让它们能吃得饱饱的，茁壮成长。
然后呢，就是细胞来源啦。
可以从动物体内提取，就好像从一个大宝藏里挖出这些小家伙们。
这可得小心点，别把它们弄伤啦。
温度也是很重要的呀！不能太冷也不能太热，得让它们感觉像在春天的暖阳下一样惬意。
不然它们可不乐意好好生长呢。
还有啊，培养的环境得干净卫生，不能有乱七八糟的细菌啊啥的来捣乱。
这就好比我们的家要干干净净的，不然住着多不舒服呀。
在培养的过程中，要时刻关注它们的状态。
看看它们是不是长得欢实呀，有没有啥不对劲的地方。
这就跟咱照顾小宠物似的，得时刻留意着。
有时候，它们可能会闹点小脾气，长得不那么顺利。
这时候可别着急，得慢慢找原因，是营养不够啦，还是环境不合适啦。
就像咱要是不舒服了，也得找找是吃坏肚子啦还是着凉啦。
培养巨噬细胞可不是一蹴而就的事儿，得有耐心，就像种小花儿一样，得精心呵护。
等它们长大了，那可就是咱的小宝贝啦，可以用来做各种实验，帮助我们了解更多关于身体的奥秘呢！
想想看，通过我们的努力，让这些小小的巨噬细胞在我们的培养下变得强大，是不是很有成就感呢？这就好像看着自己的孩子一点点长大一样开心呀！所以呀，大家可别小瞧了这培养巨噬细胞的过程，这里面的学问可大着呢！咱得认真对待，才能让它们发挥出最大的作用呀！你说是不是呢？。
人巨噬细胞体外培养的形态
人巨噬细胞体外培养的形态
人巨噬细胞是一类重要的免疫细胞，它们在体内起着清除病原
体和细胞垃圾的作用。
在体外培养条件下，人巨噬细胞通常呈现出
多种形态。
首先，人巨噬细胞在培养基中通常呈现为悬浮状态，呈圆形或
椭圆形。
这些细胞通常具有丰富的胞质，呈灰白色或淡黄色，细胞
质内含有丰富的溶酶体和吞噬体，这些细胞器是巨噬细胞进行吞噬
和降解病原体和细胞垃圾的重要结构。
其次，当人巨噬细胞受到刺激或吞噬病原体后，它们的形态会
发生改变。
巨噬细胞会通过伪足的延伸和细胞膜的变化将病原体包
裹并吞噬到细胞内部。
这时，巨噬细胞可能会呈现出更多的突起和
伪足，形态呈现出更加不规则的形状。
此外，在培养基中，人巨噬细胞还可能形成集群或聚集在一起。
这种集群形态有助于巨噬细胞之间的相互作用和信号传导，从而更
好地执行其免疫功能。
总的来说，人巨噬细胞在体外培养条件下呈现出悬浮的圆形或
椭圆形，具有丰富的胞质和溶酶体，当受到刺激时可能呈现出不规则形状，同时也可能形成集群。
这些形态特征反映了巨噬细胞在体外培养条件下的活跃状态和免疫功能。
巨噬细胞的分离、纯化与培养
一、从小鼠、豚鼠或家兔腹腔中分离巨噬细胞1．取6周左右的小鼠（或600克左右的豚鼠，或3公斤左右的家兔），剃去腹部的毛并消毒。
腹腔注射1ml（豚鼠20ml，家兔200ml）无菌的液体石蜡或巯基乙酸肉汤或4％淀粉肉汤。
3～4天以后收集腹腔细胞。
2．如要收集腹腔静置巨噬细胞，不注射刺激物，直接从这一步开始。
放血处死动物，以减少腹腔中的红细胞。
消毒腹部，沿腹中线注入3～4ml（豚鼠20～40ml，家兔50～70ml）冰中预冷的无菌PBS-H （含10U/ml肝素和10％小牛血清的PBS）。
轻轻按摩腹部5分钟。
3．以下均无菌操作。
剪开腹壁，用吸管吸出渗出液，再用同样容量的预冷PBS-H冲洗腹腔2～3次。
合并渗出液于离心管中，4℃离心250×g 10分钟，去上清液。
4．用预冷的RPMI-1640培养液洗涤细胞3次，每次4℃离心250×g 10分钟，去上清液。
用预冷的适量RPMI-1640培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞并决定细胞活力。
二、家兔肺泡巨噬细胞的分离和纯化1．取2～3公斤重的家兔，耳缘静脉注射10ml空气处死动物或注射2ml（含130mg）戊巴比妥麻醉动物。
仰卧固定，消毒胸部，剪开胸壁。
以下过程注意无菌操作。
小心从环状软骨下方剪下气管，分离心脏和血管，取出肺，剪去脂肪和结缔组织。
用无菌纱布小心擦净肺表面，称重。
2．分离肺泡巨噬细胞：用夹子夹住气管，使肺悬空。
向气管中注射40ml无菌的冷生理盐水，让生理盐水进入全部肺泡。
用镊子提起气管，从夹子下面剪断气管，将肺中的液体倒入离心管中。
再用同样方法，用40ml无菌冷生理盐水冲洗肺泡，合并浸出液，置4℃。
3．分离肺组织中的巨噬细胞：取出肺泡巨噬细胞后，剪去气管，将肺组织放在有冷RPMI-1640培养液的平皿中。
平皿置冰上，用吸满冷RPMI-1640培养液的20ml注射器接23号针头，一边灌注一边用针头梳离肺组织，直到肺组织与支气管树全部分离。
巨噬细胞焦亡 共培养
巨噬细胞焦亡共培养
巨噬细胞焦亡（Pyroptosis）是一种特殊的细胞死亡方式，主要特征包括细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞内容物的释放进而引发强烈的炎症反应。
这一过程主要由一种名为Gasdermin D（GSDMD）的蛋白所介导。
当细胞受到某些特定的刺激，如细菌感染时，细胞内会启动一系列信号转导过程，最终导致GSDMD的活化。
活化的GSDMD 会在细胞膜上形成孔洞，使得细胞内容物迅速释放，从而引发细胞焦亡。
共培养（Co-culture）则是指将两种或多种不同类型的细胞在同一培养环境中进行共同培养。
这种培养方式可以模拟体内细胞间的相互作用，从而更好地研究细胞的生物学行为。
例如，在免疫学研究中，巨噬细胞与其他免疫细胞的共培养可以帮助我们更好地理解这些细胞在免疫反应中的相互作用。
将巨噬细胞焦亡与共培养结合起来，可以研究在某些特定条件下，如细菌感染或炎症刺激下，巨噬细胞焦亡对其他共培养细胞的影响。
例如，当巨噬细胞发生焦亡并释放其内容物时，这些释放的物质可能会对其他细胞产生刺激或毒性作用，从而影响整个细胞群落的生物学行为。
总的来说，通过共培养的方式研究巨噬细胞焦亡可以帮助我们更深入地理解这一细胞死亡方式在生物体中的作用和影响，从而为相关疾病的治疗提供新的思路和方法。
巨噬细胞的实验原理是啥
巨噬细胞的实验原理是啥
巨噬细胞的实验原理是通过体外培养的方式，将目标细胞（如细菌、病毒或异物）与巨噬细胞接触，观察和分析巨噬细胞的生物学功能和作用。
巨噬细胞通常参与机体的免疫防御，通过吞噬、杀伤和降解外来病原体或异物，维持机体的内稳态和健康状态。
具体实验步骤可以包括以下内容：
1. 制备巨噬细胞：从实验动物或人体中获取巨噬细胞，通过培养基培养和增殖，使其获得足够的数量。
2. 培养实验细胞：将巨噬细胞放入培养皿中，提供合适的培养基和条件（如温度、湿度、适宜的营养物质），使其继续生长和分化。
3. 处理标的细胞：将待测的目标细胞（如细菌）加入到巨噬细胞培养皿中，使其与巨噬细胞接触。
4. 观察和分析：观察巨噬细胞对目标细胞的处理过程，可以通过显微镜观察和记录形态学变化，或者通过其他实验技术（如流式细胞术、PCR等）检测相关指标，如细胞增殖、细胞毒性、细胞吞噬能力等。
通过巨噬细胞实验，可以研究巨噬细胞与外源物质的相互作用过程、潜在细胞信
号通路和免疫机制等。
这些实验结果有助于理解巨噬细胞的生物学功能、疾病发生机制以及新药物和疫苗研发的方向。
人巨噬细胞培养方法
人巨噬细胞培养方法
人巨噬细胞是一种重要的免疫细胞，用于研究免疫和炎症反应的机制。
以下是一种常用的人巨噬细胞培养方法：
材料：
1. 人外周血单个核细胞（PBMC），来源可以是新鲜的外周血样本或者离心分离的PBMC。
2. 无血清RPMI 1640培养基，含有GlutaMAX、非必需氨基酸、钠硼砂缓冲液等。
3. 10% 热灭活胎牛血清（FBS）。
4. 非必需维生素溶液。
5. 100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 链霉素混合溶液。
步骤：
1. 将PBMC离心沉淀，并用PBS洗涤2次，以去除血浆。
2. 将PBS去除，加入无血清RPMI 1640培养基，使细胞悬浮。
3. 细胞计数，并用无血清RPMI 1640培养基将细胞浓度调整至合适的浓度（一般为1x10^6细胞/ml）。
4. 在无血清RPMI 1640培养基中加入10% FBS，以提供细胞生长所需的营养物质。
5. 在培养基中加入1% 非必需维生素溶液，以提供额外的维生素补充。
6. 加入100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 链霉素混合溶液，以防止细菌污染。
7. 将细胞悬浮液移入含有6孔或12孔培养板中的培养皿，并在37°C的培养箱中培养。
8. 培养细胞时，每隔2-3天更换一次培养基，以保持细胞的健康生长。
9. 在培养期间，可以根据需要添加不同的刺激剂（如细菌成分、细胞因子等）来激活细胞，并观察其对刺激的反应。
这是一种基本的人巨噬细胞培养方法，根据具体的实验需求和细胞类型的不同，培养条件可能会有所调整。
巨噬细胞培养
巨噬细胞培养（macrophage）主要分布于肺、脾、淋巴结、胸膜腔和腹膜腔等处。
巨噬细胞属免疫细胞，它们的主要作用是清除体内年轻损伤或凋亡的细胞，以及免疫复合物和病原体等抗原性异物。
巨噬细胞是讨论细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。
巨噬细胞简单获得，便于培养，并可举行纯化。
巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件相宜下可生活2～3周，多用做原代培养，难以长久生存。
主要包括腹膜腔巨噬细胞（peritoneal macrophage）和肺泡巨噬细胞（alveolar macrophage)两种细胞。
（一）腹膜腔巨噬细胞培养【材料】 1．组织来源死亡胎儿的腹膜。
2．培养用试剂清洗液为HBSS和不含Mg2+和Ca2+的CMF-Hanks液。
3．培养基配方和制备常用RPMI 1640，含有10%FBS,l00U/ml和100ug/ml。
也可用DMEM或MEM，含有10% FBS,15mmol/L HEPES,3.5g/L、584mg/L、IOOU/ml和100ug/ml。
4．试验器材止血钳、解剖剪和解剖镊。
【办法】 1．取材将5～10ml冲洗液注入腹膜腔内，用吸管反复冲洗腹膜腔的细胞。
2．分别细胞将腹膜腔的细胞悬液吸入离心管中，举行1000r/min离心10分钟，离心2次。
3．接种与培养用培养液重悬沉淀细胞，将细胞悬液加入培养皿内，培养2小时。
弃去培养液，用CMF-Hanks液清洗2次，除去飘荡的细胞，得到附着于培养皿底壁的巨噬细胞。
采纳酶消化或刮取的办法取出贴壁的，举行1000r/min离心10分钟。
用培养液混悬沉淀细胞，举行细胞计数，将细胞浓度调节为（1～3) x106/ml，进一步培养。
【结果】自腹膜腔洗出的细胞除巨噬细胞以外，还含有淋巴细胞等细胞。
终于获得的细胞中巨噬细胞占95％以上。
大小约50 um，存活1～3周，普通不分裂。
挺直从腹膜腔取得的巨噬细胞为静止性细胞，伪足不显然，呈圆形。
经硫代乙醇酸盐诱导可获得大量的炎性巨噬细胞，细胞有较强的运动和吞噬能力，多呈梭形。
培养巨噬细胞实验报告
一、实验目的1. 学习和掌握巨噬细胞的培养方法。
2. 观察巨噬细胞的形态变化，了解其生物学特性。
3. 掌握巨噬细胞的功能检测方法。
二、实验原理巨噬细胞是免疫系统中一类重要的细胞，具有吞噬、消化、呈递抗原等生物学功能。
在体外培养巨噬细胞，可以通过诱导单核细胞分化为巨噬细胞，进而研究其生物学特性及功能。
三、实验材料1. 实验动物：昆明小鼠。
2. 试剂：RPMI-1640培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、二甲基亚砜（DMSO）、佛波酯（PMA）、台盼蓝染液、结晶紫染液等。
3. 仪器：细胞培养箱、倒置显微镜、离心机、移液器、培养皿、培养瓶等。
四、实验方法1. 小鼠腹水制备：取昆明小鼠，无菌条件下，经腹腔注射5ml无菌生理盐水，轻柔腹部，使其在腹腔中分布均匀。
48小时后，无菌条件下抽取腹水，用台盼蓝染液检测细胞活力，确保细胞活力大于95%。
2. 单核细胞分离：将腹水以1000r/min离心5分钟，弃上清，加入RPMI-1640培养基重悬细胞，计数后按每毫升含1×10^6个细胞浓度接种于培养皿中。
3. 巨噬细胞诱导：在单核细胞培养液中加入10^-6mol/L PMA，37℃、5%CO2条件下培养24小时，诱导单核细胞分化为巨噬细胞。
4. 巨噬细胞培养：诱导后的细胞用RPMI-1640培养基洗涤2次，加入胎牛血清（含10%FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素）重悬细胞，按每毫升含1×10^6个细胞浓度接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2条件下培养。
5. 巨噬细胞形态观察：在倒置显微镜下观察巨噬细胞的形态变化，记录其吞噬功能。
6. 吞噬功能检测：将培养的巨噬细胞用RPMI-1640培养基洗涤2次，加入适量鸡红细胞（浓度约为1×10^6个/ml），37℃、5%CO2条件下培养30分钟。
收集细胞，用台盼蓝染液染色，显微镜下观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞的情况。
五、实验结果1. 巨噬细胞形态观察：诱导后的单核细胞形态发生变化，细胞体积增大，细胞器增多，表面出现伪足，表明巨噬细胞已经成功诱导。
巨噬细胞培养步骤
巨噬细胞培养步骤巨噬细胞可是免疫系统里的厉害角色呀！要培养它们，那可得仔细着点呢。
先得准备好合适的培养基，这就好比给巨噬细胞准备一个舒服的家。
这个家得有它们需要的各种营养成分，让它们能茁壮成长。
然后就是获取巨噬细胞的来源啦。
可以从动物的腹腔、血液等地方提取。
就像去果园里挑选最甜的果子一样，得找到最合适的那部分细胞。
把细胞小心翼翼地放到培养瓶里，这时候就得像照顾小婴儿一样精心啦。
温度要适宜，环境要干净，可不能有任何干扰它们生长的因素存在。
接下来就是耐心等待啦。
看着它们一点点地分裂、增殖，就像看着小树苗一点点长大变成大树。
这过程中得时刻关注着，看看它们有没有什么特殊的需求。
在培养的过程中，还得注意观察细胞的状态。
要是发现有不对劲的地方，就得赶紧想办法解决，不然它们可就长不好啦。
这就好比看到小树苗有点发黄，就得赶紧找找原因，是缺水了还是缺肥了。
培养巨噬细胞可不是一天两天就能完成的事儿，得有足够的耐心和细心。
就像盖房子，一砖一瓦都得用心去垒。
有时候想想，这培养细胞和我们生活中的好多事情都挺像的。
都需要用心去经营，去呵护，才能有好的结果。
你说是不是呢？等巨噬细胞培养好了，就可以拿去做各种实验啦，去探索更多关于免疫系统的奥秘。
这就像是我们辛苦学习了好久，终于可以去检验成果，去解决难题一样，让人充满期待。
总之，培养巨噬细胞可真是个精细活儿，每一步都不能马虎，每一个细节都得注意到。
只有这样，才能培养出健康、活跃的巨噬细胞，为科学研究做出贡献呀！。
巨噬细胞培养
巨噬细胞原代培养1、实验前三天，向每只小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤1ml（勿注入肠内）。
2、引颈杀死动物，手提鼠尾将全鼠浸入70%酒精中3～5秒。
3、置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，但勿伤及腹膜壁。
4、再用70%酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10mlEagle液注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动。
5、用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸取入针管内。
6、小心拔出针头，把液体注入离心管中，250g4℃离心10分钟，去上清，加10mlEagle培养基。
7、计数细胞，每只小鼠可产生20～30×105细胞，其中90%为巨噬细胞。
8、为获取3×105帖附细胞/平方厘米，需接种2.5×106/ml。
9、为纯化培养细胞，去除其它白细胞，接种数小时后，去除培养液，用Eagle液冲洗1～2次后，再加新Eagle培养液置37℃CO2温箱中培养.小鼠单核/巨噬细胞RAW 264.71.在ATCC对该细胞传代的描述中是采用细胞刮棒进行的。
我们的经验是，以0.25%胰酶+0.02%的EDTA作为消化液。
使用温至室温的消化液进行消化，消化时镜下观察，并用手掌轻拍细胞贴壁的瓶底，约3~5 min后，待约10%左右的细胞脱离瓶壁即可终止消化，弃去胰酶，以含10%FBS的DMEM培养基吹打细胞。
值得注意的是该细胞对机械损伤比较敏感，所以不要用吸管反复吹打细胞。
该细胞很难将瓶内所有细胞都吹下来，所以换瓶传代就行了。
看了楼主的描述，感觉是细胞难以耐受机械损伤而导致裂解了。
2.消化液：0.5％胰酶、0.2％EDTA，实验前加温到37度以50ml培养瓶为例：1、细胞贴壁生长，长满瓶底80％时，弃去培养液，加D-HANKS 漂洗两次；2. 加入含胰酶和EDTA的消化液1－2ml,消化37℃约2-5min，镜下可见细胞基本圆形回缩即中止消化，弃消化液加D-HANKS 漂洗两次；3.加入新培养液10ml复吹打混悬细胞，按需要分入新的培养瓶3.我得操作如下：实验前将DPBS及DMEM加温到37度使用Flask75培养瓶：1、细胞贴壁生长，长满瓶底70％时，弃去培养液，加DPBS(磷酸盐缓冲液)10ml漂洗一至两次；弃去2. 加入10mlDPBS,然后用scratcher轻轻刮即可，离心后去除DPBS.用DMEM培养液10ml复吹打混悬细胞3.分入新的培养瓶；4. 入37℃5％CO2孵箱，几小时后即可再贴壁。
巨噬细胞培养注意事项
巨噬细胞培养注意事项
1、细胞分离：尽量在封闭的环境下进行细胞分离，防止致病微生物的污染。
2、细胞培养：需要采用营养功能良好的细胞培养基，在适当的温度和湿度条件下进行培养。
3、杀菌：在培养细胞前，需要预先对培养基进行杀菌处理，以防止细菌的污染。
4、细胞离心：在细胞分离前，需要通过离心来去除细胞外的杂质和少量的红细胞沉淀。
5、细胞活性：在取细胞操作之后，需要定期检查细胞表型，以监测细胞的活性水平。
6、游离抗原：由于巨噬细胞是经过免疫调节的，因此在实验中，需要用特定的抗原，如核苷酸或蛋白质，以刺激其免疫功能完成实验目的。
巨噬细胞的原代培养
巨噬细胞属天然免疫细胞，具有趋化运动、吞噬、分泌和参与免疫调节等功能，是科学工作者研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。
巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。
巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周多用做原代培养，不易长期生存。
巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l 等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。
目前，单核巨噬细胞株也有，比如RAW264.7，但价格比较贵，且保存也不方便。
培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，目前以小鼠腹腔取材法最为实用，而目前获取小鼠巨噬细胞的方法有两种，一种是直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞，还有一种方法向动物腹腔中注射刺激物（如牛血清，淀粉，糖原，脂多糖，矿物油，PRMI1640培养液等），这样使机体产生大量巨噬细胞后再腹腔灌洗，但由于许多刺激物能激活巨噬细胞，而被激活的巨噬细胞大量吞噬刺激物，有此得到的巨噬细胞培养用于培养时，细胞中的刺激物不能很快被消化而残留在细胞中，影响细胞代谢，同时也不能很好的模拟体内环境，所以我们直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞。
我们选择6周龄的昆明小鼠是因为此年龄小鼠能产生最多的巨噬细胞。
2试验材料昆明种小鼠 10只体重约18g～25g（约6周龄）由广西医科大学动物实验中心提供公鸡 1只PRMI1640培养基新生小牛血清HEPESD-Hanks液青霉素链霉素3试验仪器无菌操作台手术刀解剖剪解剖镊止血钳 5m注射器注射针，试管、培养瓶（12），12孔培养板(12)等。
二氧化碳培养箱生物显微镜高速冷冻离心机4实验步骤4．1细胞培养液的制备及消毒制备方法:将RPMI1640干粉一袋，HEPES4. 77g加入800m1三蒸水中，充分溶解后缓慢加入碳酸氢钠并逐步添加三蒸水，使溶液的pH值处于7. 2-7. 4之间，容积为1000m1。
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1.培养瓶 离心管 注射型滤器（正压过滤器） 2.手术器材：镊子 手术剪 止血钳 注射器 针头 3.包装用品 支架：饭盒 包装纸 硫酸纸 棉线 准备：
1. 清洗： 刷洗，煮沸后加洗剂 冲洗，振荡冲洗15-20次 酸泡，烤干后泡24h 浸泡，去离子水2次，每次24h，新玻璃器材5%HCL
（37℃，5％CO2）培养 2-3 小时。
（6）除去培养液，用 Hanks 液冲洗培养孔 2-3 次，去除未贴壁细胞，
纯化巨噬细胞，再用RPMI1640液冲洗1-2次，再加入RPMI1640（10％
无支原体胎牛血清）培养液备用。
（7）细胞的传代培养
（8）普通光镜下细胞计数，鉴定，检测活性
小鼠腹腔巨噬细胞的鉴定 用酸性磷酸酶法鉴定巨噬细胞。 （1）取出有细胞贴壁的盖玻片放于载玻片上，用 HANK’S液冲洗 2-3 次，放入冰箱（4℃），30分钟后取出，在细胞贴壁细胞上滴加 10％中 性甲醛溶液数滴，放入冰箱（4℃）固定30 分钟。 （2）自来水漂洗5 分钟，把水沥干。 （3）在固定好的细胞上滴加酸性磷酸作用液数滴，37℃处理 30 分钟。 （4）自来水漂洗3-5 次。 （5）在细胞上滴加1％硫化铵3-5 分钟。 （6）自来水冲洗3-5 次，甩干。 （7）在细胞上滴加吉姆萨染色液染色15 分钟。 （8）自来水冲洗3-5 次去除多余染液，用磷酸盐缓冲液临时封片，镜 检。 玻璃器皿： 1.浸泡：洗涤剂中浸泡数小时，刷洗，5%HCL浸泡12h以上 2.刷洗：在洗剂中毛刷（软毛，轻用力，注意更换），充分冲洗，晾干 3.浸酸：6h以上，最好过夜 清洗液配方： 强 次 弱 重铬酸钾（g）:63 120 100 浓H2SO4(ml):1000 200 100 蒸馏水（ml）：200 1000 1000 4.冲洗：自来水（压力），瓶内盛满水，倒空10次以上，重蒸水浸洗2-3 次，烘干后包装 胶塞：水浸泡，2%NaOH煮沸10min,自来水冲洗晾干，1%稀HCL浸泡 30min,自来水，重蒸水冲洗3次，烘干备用 塑料：水泡，自来水冲洗（不刷洗），2%NaOH过夜，自来水冲洗， 1%稀HCL浸泡30min,自来水，重蒸水冲洗3次，烘干备用
2. 包装： 瓶管口，双层纸；盖玻片条；瓶塞；吸管，管底垫棉花，管头塞棉花； 饭盒：盒底垫纱布，瓶口向下，液体瓶插针头，盖纱布、盖子 滤菌器，双层滤纸
3. 消毒 高压蒸汽，紫外线，滤过消毒 化学消毒，酒精，新洁尔灭，过氧乙酸（无菌室），火焰消毒
2、 实验仪器： CO2培养箱：电源，温度，湿度，5%CO2 注意事项：
2. 天然培养基：胎儿牛血清 two small
3. 消化液：胰酶液，胶原酶液，0.3%EDTA,TE
4.青链霉素溶液：
10ml HANK’S 液中溶解 100 万单位硫酸链霉素配成硫酸链霉素溶液，
取出 8ml硫酸链霉素溶液溶解80 万单位的青霉素钠配成每毫升青霉素、
链霉素各10 万单位的母液。使用时，在 100ml 培养基中加母液 0.1ml，
big
10％多聚甲醛缓冲液：
多聚甲醛
4g
பைடு நூலகம்蒸馏水
50ml
在通风橱内加热使之解聚，完全溶解，冷却，用 0.2mol/L PB（pH7.4-
7.5）定容致100ml。
细胞培养过程
小鼠腹腔巨噬细胞的培养与纯化
（1）实验前三天，向小鼠腹腔内注入无菌RPMI1640 1ml（勿注入肠
内） ，以刺激腹腔产生大量的巨噬细胞。 1ml注射器
则培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为100 单位/ml。
5. 10%RPMI1640培养基
1640 培养基 90ml 中加入 10ml 胎牛血清混匀，置 4℃冰箱短期备用。
One big
6. 酸性磷酸酶作用液：
蒸馏水
90ml
0.2mol/L醋酸缓冲液（pH4.6） 12ml
5％硝酸铅
2ml
3.2％β-甘油磷酸钠
后，加入氯仿2.0ml，置于2-8℃保存。 使用时， 用蒸馏水稀释 10 倍，
经 116℃， 15 分钟灭菌。 使用前用7.5％NaHCO3调 pH至7.2-7.4。two
big
0.01M PBS（pH7.2-7.6）：
NaCl
8.5g
Na2HPO4
1.4g
NaH2PO4
0.2g
溶于 1000ml 蒸馏水中。Two big
下吸取入针管内，小心拔出针头，把液体注入离心管。 5ml
（4）1000 转离心10分钟后，去上清，加RPMI1640（含 100 单位/ml 青
链霉素，10％无支原体胎牛血清）培养基重新混匀。
（5）用RPMI1640（含 100 单位/ml 青链霉素，10％无支原体胎牛血
清）接种于有盖玻片的培养瓶中进行原代培养，放入 CO2 培养箱中
1. 定期紫外线，酒精消毒 2. CO2气压定期测试 3. 供气中断拧紧瓶盖 4. 定期加水，保持湿度 5. 培养瓶酒精消毒入箱 倒置显微镜 普通光学显微镜
24孔培养板
酸度计
蒸汽灭菌器
离心机
超净工作台
血球计数板
3、 药品及细胞用液：
药品：75%酒精，0.4%台盼蓝
1. 平衡盐溶液：
HANK’S 液：
甲液：NaCl
80.0g
KCl
4.0g
CaCl2
1.4g
MgSO4·7H2O
2.0g
乙液：Na2HPO4·12H2O 1.52g
KH2PO4
0.6g
葡萄糖
10.0g
丙液：1％酚红溶液
16ml
将甲、乙各种试剂按顺序分别溶于 450ml 蒸馏水中，之后将乙液缓缓加
入甲液中，边加边搅拌，再加入丙液，补蒸馏水至1000ml，用滤纸滤过
（2）三天后引颈处死小鼠，手提鼠尾将小鼠全浸入75%乙醇中 3-5 秒。
烧杯
（3）置小鼠于超净工作台中的灭菌托盘中，持镊撕开腹部皮肤，但勿
伤及腹膜壁，暴露出腹膜壁。用 75%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸 2-3ml
RPMI1640 液注入腹腔中，同时用手指从两侧压揉腹膜壁，使液体在腹
腔内流动。用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧。使腹腔中液体集中于针头
4ml
先将蒸馏水和醋酸缓冲液混合，随后分成大致相等的两份，一份中加醋
酸铅溶液，
另一份加甘油磷酸钠溶液，然后再将两者缓缓混合，边混匀边搅匀。若
pH﹥5.0，可加少许醋酸调节，临用前配置。配好后的作用液应透明无
絮状悬浮物和沉淀，否则严重影响实验结果。One big
7. 吉姆萨染液：
吉姆萨染料（粉末）
0.8g
甲醇
50ml
甘油
50ml
先将吉姆萨染料放入乳钵中，逐渐倒甘油研磨溶于甘油中，置于 56℃
水温箱内，
90-120 分钟，然后加入甲醇，摇匀后放置数天，过滤后或不过滤即可使
用。此染液放置室温阴暗处，时间越长越好。使用染液可临时配置：姬
姆萨染液 1ml，加 1/15mol/L 磷酸盐缓冲液10ml 混匀，即可使用。One