巨噬细胞培养
巨噬细胞的培养方法
巨噬细胞的培养方法
巨噬细胞的培养方法如下：
1. 获取巨噬细胞：常用的来源包括小鼠、人类等。
可以通过小鼠或者人类的骨髓、外周血或者器官（例如脾脏、肺）中分离巨噬细胞。
2. 细胞培养基的准备：常用的细胞培养基包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）等。
细胞培养基需要加入适量的无菌胎牛血清（FBS）或者人工合成的替代物，例如脂质体。
3. 细胞的分离：将获得的组织样本经过适当的处理，例如组织碎片化、酶消化等，使细胞释放出来。
4. 细胞的培养：将分离得到的巨噬细胞悬浮于细胞培养基中，通过离心将巨噬细胞沉淀在培养皿的底部。
5. 进一步培养：将巨噬细胞培养在37C的恒温培养箱中，提供合适的氧气和二氧化碳浓度，适当转移和补充新鲜的培养基。
6. 细胞的检测和分离：通过显微镜观察巨噬细胞的形态和数量，也可以使用流式细胞仪等方法对细胞进行检测和分析。
这些是常规的巨噬细胞培养方法，具体操作细节可能根据实验目的和细胞来源的不同而有所变化。
巨噬细胞培养
腹腔巨噬细胞的获取和培养1.实验目的：掌握腹腔巨噬细胞的获取方法及其培养技术2.实验原理：利用巨噬细胞具有趋化运动，吞噬，分泌和参与免疫调节的功能，向成熟大鼠腹腔内注射煮沸灭菌的4%的硫代乙酸钠，使血液中的单核细胞趋化至腹腔，即巨噬细胞。
硫代乙酸钠刺激后4日腹腔内巨噬细胞数量较多且其他细胞成分少（如淋巴细胞）。
3.实验器材及材料：（1）成年大鼠（2）手术器械：解剖剪，解剖镊和止血钳（3）其他用品：注射器，培养皿和吸管，酒精及酒精棉球等（4）清洗液：HBSS和不含Ca和Mg的HBSS。
（5）培养液：DMEM（加10%血清）（6）细胞计数板和计数器4.实验步骤：（1）取细胞4d前，动物腹膜腔内注射5-10ml 4%硫代乙酸钠。
（2）乙醚麻醉后，拉颈处死动物，经颈总动脉放血。
将动物仰置，剪去腹壁皮毛，用70%酒精消毒。
（3）沿正中线剪开腹壁，将5-10mlHBSS注入腹膜腔，用吸管反复冲洗腹膜腔的细胞。
（4）吸出腹膜腔的细胞悬液，离心（1000r/min,10min）。
（5）用培养液混悬沉淀细胞，将细胞悬液加入培养皿中，培养2h. （6）吸去培养液，用不含Ca2+和Mg2+的HBSS清洗2次，去除漂浮的细胞，得到附着于培养皿底部的巨噬细胞。
（7）采用刮取法或酶消化法取出贴壁的巨噬细胞，离心（1000r/min,10min）。
用培养液混悬细胞，将细胞调整至1-3X106个/ml,继续培养或直接用于实验研究。
5.实验结果分析：（1）除巨噬细胞外，自腹膜腔洗出的细胞还含有淋巴细胞等。
由于淋巴细胞不贴壁，培养2h后用HBSS清洗，可除去淋巴细胞和其他悬浮细胞。
最终获得95%以上是巨噬细胞。
（利用巨噬细胞贴壁能力较其他细胞强）。
（2）巨噬细胞大小约50μm,一般不分裂，在培养条件下可存活1-3周。
直接从腹腔取得的巨噬细胞为静止性的，呈圆形，伪足不明显。
经硫代乙酸钠刺激可获得大量的炎症性巨噬细胞，培养2h后，细胞多呈梭形并伸出伪足，即“有头有尾”，具有较强的变形运动和吞噬能力。
高糖培养巨噬细胞的原理
高糖培养巨噬细胞的原理
高糖培养巨噬细胞是一种常用的细胞培养方法，通过提供高浓度的葡萄糖供细胞代谢，促进细胞增殖和生长。
巨噬细胞是免疫系统中的一类重要的吞噬细胞，具有清除病原体、参与免疫调节等功能。
为了保证巨噬细胞在体外培养过程中的正常功能和活性，常需提供适宜的培养条件。
高糖培养巨噬细胞的原理主要有以下几点：
1.能量供应：巨噬细胞代谢过程中需要大量的能量，葡萄糖是主要供能物质之一。
通过提供高浓度的葡萄糖，可以满足细胞能量需求，促进细胞的生长和增殖。
2.代谢产物：高糖培养环境下，细胞可以更充分地代谢葡萄糖，产生较多的代谢产物，如乳酸和丙酮酸等。
这些代谢产物有助于调节细胞内环境，维持细胞的正常生理状态。
3.防止细胞凋亡：在高糖环境下，细胞能够更好地维持细胞内的渗透平衡，防止细胞因渗透压差异而引发细胞凋亡。
需要注意的是，在高糖培养巨噬细胞时，应根据不同的细胞类型和研究目的，调整葡萄糖浓度和培养时间，以达到最佳的细胞生长和功能表达效果。
巨噬细胞的培养方法
巨噬细胞的培养方法
巨噬细胞，嘿，这可是个有趣的小家伙呢！要培养它们呀，那可得有点小技巧。
首先呢，咱得给它们准备一个舒服的“家”，就像咱给自己找个舒服的床一样。
这就需要合适的培养基啦。
培养基就像是巨噬细胞的食物和房子的结合体，得有各种营养成分，让它们能吃得饱饱的，茁壮成长。
然后呢，就是细胞来源啦。
可以从动物体内提取，就好像从一个大宝藏里挖出这些小家伙们。
这可得小心点，别把它们弄伤啦。
温度也是很重要的呀！不能太冷也不能太热，得让它们感觉像在春天的暖阳下一样惬意。
不然它们可不乐意好好生长呢。
还有啊，培养的环境得干净卫生，不能有乱七八糟的细菌啊啥的来捣乱。
这就好比我们的家要干干净净的，不然住着多不舒服呀。
在培养的过程中，要时刻关注它们的状态。
看看它们是不是长得欢实呀，有没有啥不对劲的地方。
这就跟咱照顾小宠物似的，得时刻留意着。
有时候，它们可能会闹点小脾气，长得不那么顺利。
这时候可别着急，得慢慢找原因，是营养不够啦，还是环境不合适啦。
就像咱要是不舒服了，也得找找是吃坏肚子啦还是着凉啦。
培养巨噬细胞可不是一蹴而就的事儿，得有耐心，就像种小花儿一样，得精心呵护。
等它们长大了，那可就是咱的小宝贝啦，可以用来做各种实验，帮助我们了解更多关于身体的奥秘呢！
想想看，通过我们的努力，让这些小小的巨噬细胞在我们的培养下变得强大，是不是很有成就感呢？这就好像看着自己的孩子一点点长大一样开心呀！所以呀，大家可别小瞧了这培养巨噬细胞的过程，这里面的学问可大着呢！咱得认真对待，才能让它们发挥出最大的作用呀！你说是不是呢？。
巨噬细胞培养
1.培养瓶 离心管 注射型滤器（正压过滤器） 2.手术器材：镊子 手术剪 止血钳 注射器 针头 3.包装用品 支架：饭盒 包装纸 硫酸纸 棉线 准备：
1. 清洗： 刷洗，煮沸后加洗剂 冲洗，振荡冲洗15-20次 酸泡，烤干后泡24h 浸泡，去离子水2次，每次24h，新玻璃器材5%HCL
（37℃，5％CO2）培养 2-3 小时。
（6）除去培养液，用 Hanks 液冲洗培养孔 2-3 次，去除未贴壁细胞，
纯化巨噬细胞，再用RPMI1640液冲洗1-2次，再加入RPMI1640（10％
无支原体胎牛血清）培养液备用。
（7）细胞的传代培养
（8）普通光镜下细胞计数，鉴定，检测活性
小鼠腹腔巨噬细胞的鉴定 用酸性磷酸酶法鉴定巨噬细胞。 （1）取出有细胞贴壁的盖玻片放于载玻片上，用 HANK’S液冲洗 2-3 次，放入冰箱（4℃），30分钟后取出，在细胞贴壁细胞上滴加 10％中 性甲醛溶液数滴，放入冰箱（4℃）固定30 分钟。 （2）自来水漂洗5 分钟，把水沥干。 （3）在固定好的细胞上滴加酸性磷酸作用液数滴，37℃处理 30 分钟。 （4）自来水漂洗3-5 次。 （5）在细胞上滴加1％硫化铵3-5 分钟。 （6）自来水冲洗3-5 次，甩干。 （7）在细胞上滴加吉姆萨染色液染色15 分钟。 （8）自来水冲洗3-5 次去除多余染液，用磷酸盐缓冲液临时封片，镜 检。 玻璃器皿： 1.浸泡：洗涤剂中浸泡数小时，刷洗，5%HCL浸泡12h以上 2.刷洗：在洗剂中毛刷（软毛，轻用力，注意更换），充分冲洗，晾干 3.浸酸：6h以上，最好过夜 清洗液配方： 强 次 弱 重铬酸钾（g）:63 120 100 浓H2SO4(ml):1000 200 100 蒸馏水（ml）：200 1000 1000 4.冲洗：自来水（压力），瓶内盛满水，倒空10次以上，重蒸水浸洗2-3 次，烘干后包装 胶塞：水浸泡，2%NaOH煮沸10min,自来水冲洗晾干，1%稀HCL浸泡 30min,自来水，重蒸水冲洗3次，烘干备用 塑料：水泡，自来水冲洗（不刷洗），2%NaOH过夜，自来水冲洗， 1%稀HCL浸泡30min,自来水，重蒸水冲洗3次，烘干备用
人巨噬细胞体外培养的形态
人巨噬细胞体外培养的形态
人巨噬细胞是一类重要的免疫细胞，它们在体内起着清除病原
体和细胞垃圾的作用。
在体外培养条件下，人巨噬细胞通常呈现出
多种形态。
首先，人巨噬细胞在培养基中通常呈现为悬浮状态，呈圆形或
椭圆形。
这些细胞通常具有丰富的胞质，呈灰白色或淡黄色，细胞
质内含有丰富的溶酶体和吞噬体，这些细胞器是巨噬细胞进行吞噬
和降解病原体和细胞垃圾的重要结构。
其次，当人巨噬细胞受到刺激或吞噬病原体后，它们的形态会
发生改变。
巨噬细胞会通过伪足的延伸和细胞膜的变化将病原体包
裹并吞噬到细胞内部。
这时，巨噬细胞可能会呈现出更多的突起和
伪足，形态呈现出更加不规则的形状。
此外，在培养基中，人巨噬细胞还可能形成集群或聚集在一起。
这种集群形态有助于巨噬细胞之间的相互作用和信号传导，从而更
好地执行其免疫功能。
总的来说，人巨噬细胞在体外培养条件下呈现出悬浮的圆形或
椭圆形，具有丰富的胞质和溶酶体，当受到刺激时可能呈现出不规则形状，同时也可能形成集群。
这些形态特征反映了巨噬细胞在体外培养条件下的活跃状态和免疫功能。
巨噬细胞的分离、纯化与培养
一、从小鼠、豚鼠或家兔腹腔中分离巨噬细胞1．取6周左右的小鼠（或600克左右的豚鼠，或3公斤左右的家兔），剃去腹部的毛并消毒。
腹腔注射1ml（豚鼠20ml，家兔200ml）无菌的液体石蜡或巯基乙酸肉汤或4％淀粉肉汤。
3～4天以后收集腹腔细胞。
2．如要收集腹腔静置巨噬细胞，不注射刺激物，直接从这一步开始。
放血处死动物，以减少腹腔中的红细胞。
消毒腹部，沿腹中线注入3～4ml（豚鼠20～40ml，家兔50～70ml）冰中预冷的无菌PBS-H （含10U/ml肝素和10％小牛血清的PBS）。
轻轻按摩腹部5分钟。
3．以下均无菌操作。
剪开腹壁，用吸管吸出渗出液，再用同样容量的预冷PBS-H冲洗腹腔2～3次。
合并渗出液于离心管中，4℃离心250×g 10分钟，去上清液。
4．用预冷的RPMI-1640培养液洗涤细胞3次，每次4℃离心250×g 10分钟，去上清液。
用预冷的适量RPMI-1640培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞并决定细胞活力。
二、家兔肺泡巨噬细胞的分离和纯化1．取2～3公斤重的家兔，耳缘静脉注射10ml空气处死动物或注射2ml（含130mg）戊巴比妥麻醉动物。
仰卧固定，消毒胸部，剪开胸壁。
以下过程注意无菌操作。
小心从环状软骨下方剪下气管，分离心脏和血管，取出肺，剪去脂肪和结缔组织。
用无菌纱布小心擦净肺表面，称重。
2．分离肺泡巨噬细胞：用夹子夹住气管，使肺悬空。
向气管中注射40ml无菌的冷生理盐水，让生理盐水进入全部肺泡。
用镊子提起气管，从夹子下面剪断气管，将肺中的液体倒入离心管中。
再用同样方法，用40ml无菌冷生理盐水冲洗肺泡，合并浸出液，置4℃。
3．分离肺组织中的巨噬细胞：取出肺泡巨噬细胞后，剪去气管，将肺组织放在有冷RPMI-1640培养液的平皿中。
平皿置冰上，用吸满冷RPMI-1640培养液的20ml注射器接23号针头，一边灌注一边用针头梳离肺组织，直到肺组织与支气管树全部分离。
人巨噬细胞培养方法
人巨噬细胞培养方法
人巨噬细胞是一种重要的免疫细胞，用于研究免疫和炎症反应的机制。
以下是一种常用的人巨噬细胞培养方法：
材料：
1. 人外周血单个核细胞（PBMC），来源可以是新鲜的外周血样本或者离心分离的PBMC。
2. 无血清RPMI 1640培养基，含有GlutaMAX、非必需氨基酸、钠硼砂缓冲液等。
3. 10% 热灭活胎牛血清（FBS）。
4. 非必需维生素溶液。
5. 100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 链霉素混合溶液。
步骤：
1. 将PBMC离心沉淀，并用PBS洗涤2次，以去除血浆。
2. 将PBS去除，加入无血清RPMI 1640培养基，使细胞悬浮。
3. 细胞计数，并用无血清RPMI 1640培养基将细胞浓度调整至合适的浓度（一般为1x10^6细胞/ml）。
4. 在无血清RPMI 1640培养基中加入10% FBS，以提供细胞生长所需的营养物质。
5. 在培养基中加入1% 非必需维生素溶液，以提供额外的维生素补充。
6. 加入100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 链霉素混合溶液，以防止细菌污染。
7. 将细胞悬浮液移入含有6孔或12孔培养板中的培养皿，并在37°C的培养箱中培养。
8. 培养细胞时，每隔2-3天更换一次培养基，以保持细胞的健康生长。
9. 在培养期间，可以根据需要添加不同的刺激剂（如细菌成分、细胞因子等）来激活细胞，并观察其对刺激的反应。
这是一种基本的人巨噬细胞培养方法，根据具体的实验需求和细胞类型的不同，培养条件可能会有所调整。
小鼠肺泡巨噬细胞的分离与培养
小鼠肺泡巨噬细胞的分离与培养巨噬细胞通常有两个不同的亚群：经典激活M1型，具有促炎作用。
可被LPS单独或与Th1细胞因子(如IFN-γ，GM-CSF)联合极化，并产生促炎细胞因子，IL-1β、IL-6、IL-12、IL-23和TNF-α；第二种是交替激活M2型巨噬细胞，具有抗炎和免疫调节作用，被Th2细胞因子IL-4和IL-13极化，产生IL-10和TGF-β等抗炎细胞因子。
目前实验常用的细胞系有RAW264.7，THP-1以及原代BMDM细胞等，而肺泡巨噬细胞(Alveolar macrophages, AM)比较少用但研究很有必要。
AM是肺的常驻组织巨噬细胞，在出生前后定植于肺部，在成年生物体中无需单核细胞的贡献即可长期自我维持，对免疫调节和表面活性剂稳态至关重要。
由于AM定位于肺泡的空气空间，所以直接暴露于吸入的空气和病原体或其他雾化颗粒中。
我们可以通过支气管肺泡灌洗法(BAL)清洗肺部收集。
一、方法：通过支气管肺泡灌洗(BAL)获取肺泡巨噬细胞。
1. 为每只老鼠准备一个15mL的锥形管，管内装有3mL完整的培养基。
2.将BAL缓冲液(PBS+EDTA)在水浴中加热至37°C，在整个过程中要注意保持温度。
3.在不破坏颈静脉或气管的情况下，采用颈椎脱位法对小鼠实施安乐死，避免AM暴露于CO2或异氟醚中，影响AM的功能特性。
4. 使用解剖工具，切除皮肤、胸腔和肌肉，露出肺和气管，避免割伤或破裂血管。
5. 用一把细剪刀在喉头下方的气管上部做一个小切口，气管朝下的部分(远离实验者)应保持完整，不要切开整个气管。
6. 使用切口插入一根稍钝的18-G套管，将套管插入气管向肺方向深5mm，注意不要损伤肺组织。
7. 将1mL注射器吸取1mL温热BAL缓冲液连接到插入的套管上。
8. 注射缓冲液1mL，另一只手固定套管位置。
9. 拉动柱塞收集注射器中的BAL液。
回收率约为800 ~ 900 μL。
注意气压不宜过高，否则肺泡破裂，BAL液流失。
巨噬细胞培养
巨噬细胞培养（macrophage）主要分布于肺、脾、淋巴结、胸膜腔和腹膜腔等处。
巨噬细胞属免疫细胞，它们的主要作用是清除体内年轻损伤或凋亡的细胞，以及免疫复合物和病原体等抗原性异物。
巨噬细胞是讨论细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。
巨噬细胞简单获得，便于培养，并可举行纯化。
巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件相宜下可生活2～3周，多用做原代培养，难以长久生存。
主要包括腹膜腔巨噬细胞（peritoneal macrophage）和肺泡巨噬细胞（alveolar macrophage)两种细胞。
（一）腹膜腔巨噬细胞培养【材料】 1．组织来源死亡胎儿的腹膜。
2．培养用试剂清洗液为HBSS和不含Mg2+和Ca2+的CMF-Hanks液。
3．培养基配方和制备常用RPMI 1640，含有10%FBS,l00U/ml和100ug/ml。
也可用DMEM或MEM，含有10% FBS,15mmol/L HEPES,3.5g/L、584mg/L、IOOU/ml和100ug/ml。
4．试验器材止血钳、解剖剪和解剖镊。
【办法】 1．取材将5～10ml冲洗液注入腹膜腔内，用吸管反复冲洗腹膜腔的细胞。
2．分别细胞将腹膜腔的细胞悬液吸入离心管中，举行1000r/min离心10分钟，离心2次。
3．接种与培养用培养液重悬沉淀细胞，将细胞悬液加入培养皿内，培养2小时。
弃去培养液，用CMF-Hanks液清洗2次，除去飘荡的细胞，得到附着于培养皿底壁的巨噬细胞。
采纳酶消化或刮取的办法取出贴壁的，举行1000r/min离心10分钟。
用培养液混悬沉淀细胞，举行细胞计数，将细胞浓度调节为（1～3) x106/ml，进一步培养。
【结果】自腹膜腔洗出的细胞除巨噬细胞以外，还含有淋巴细胞等细胞。
终于获得的细胞中巨噬细胞占95％以上。
大小约50 um，存活1～3周，普通不分裂。
挺直从腹膜腔取得的巨噬细胞为静止性细胞，伪足不显然，呈圆形。
经硫代乙醇酸盐诱导可获得大量的炎性巨噬细胞，细胞有较强的运动和吞噬能力，多呈梭形。
培养巨噬细胞实验报告
一、实验目的1. 学习和掌握巨噬细胞的培养方法。
2. 观察巨噬细胞的形态变化，了解其生物学特性。
3. 掌握巨噬细胞的功能检测方法。
二、实验原理巨噬细胞是免疫系统中一类重要的细胞，具有吞噬、消化、呈递抗原等生物学功能。
在体外培养巨噬细胞，可以通过诱导单核细胞分化为巨噬细胞，进而研究其生物学特性及功能。
三、实验材料1. 实验动物：昆明小鼠。
2. 试剂：RPMI-1640培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、二甲基亚砜（DMSO）、佛波酯（PMA）、台盼蓝染液、结晶紫染液等。
3. 仪器：细胞培养箱、倒置显微镜、离心机、移液器、培养皿、培养瓶等。
四、实验方法1. 小鼠腹水制备：取昆明小鼠，无菌条件下，经腹腔注射5ml无菌生理盐水，轻柔腹部，使其在腹腔中分布均匀。
48小时后，无菌条件下抽取腹水，用台盼蓝染液检测细胞活力，确保细胞活力大于95%。
2. 单核细胞分离：将腹水以1000r/min离心5分钟，弃上清，加入RPMI-1640培养基重悬细胞，计数后按每毫升含1×10^6个细胞浓度接种于培养皿中。
3. 巨噬细胞诱导：在单核细胞培养液中加入10^-6mol/L PMA，37℃、5%CO2条件下培养24小时，诱导单核细胞分化为巨噬细胞。
4. 巨噬细胞培养：诱导后的细胞用RPMI-1640培养基洗涤2次，加入胎牛血清（含10%FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素）重悬细胞，按每毫升含1×10^6个细胞浓度接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2条件下培养。
5. 巨噬细胞形态观察：在倒置显微镜下观察巨噬细胞的形态变化，记录其吞噬功能。
6. 吞噬功能检测：将培养的巨噬细胞用RPMI-1640培养基洗涤2次，加入适量鸡红细胞（浓度约为1×10^6个/ml），37℃、5%CO2条件下培养30分钟。
收集细胞，用台盼蓝染液染色，显微镜下观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞的情况。
五、实验结果1. 巨噬细胞形态观察：诱导后的单核细胞形态发生变化，细胞体积增大，细胞器增多，表面出现伪足，表明巨噬细胞已经成功诱导。
巨噬细胞培养步骤
巨噬细胞培养步骤巨噬细胞可是免疫系统里的厉害角色呀！要培养它们，那可得仔细着点呢。
先得准备好合适的培养基，这就好比给巨噬细胞准备一个舒服的家。
这个家得有它们需要的各种营养成分，让它们能茁壮成长。
然后就是获取巨噬细胞的来源啦。
可以从动物的腹腔、血液等地方提取。
就像去果园里挑选最甜的果子一样，得找到最合适的那部分细胞。
把细胞小心翼翼地放到培养瓶里，这时候就得像照顾小婴儿一样精心啦。
温度要适宜，环境要干净，可不能有任何干扰它们生长的因素存在。
接下来就是耐心等待啦。
看着它们一点点地分裂、增殖，就像看着小树苗一点点长大变成大树。
这过程中得时刻关注着，看看它们有没有什么特殊的需求。
在培养的过程中，还得注意观察细胞的状态。
要是发现有不对劲的地方，就得赶紧想办法解决，不然它们可就长不好啦。
这就好比看到小树苗有点发黄，就得赶紧找找原因，是缺水了还是缺肥了。
培养巨噬细胞可不是一天两天就能完成的事儿，得有足够的耐心和细心。
就像盖房子，一砖一瓦都得用心去垒。
有时候想想，这培养细胞和我们生活中的好多事情都挺像的。
都需要用心去经营，去呵护，才能有好的结果。
你说是不是呢？等巨噬细胞培养好了，就可以拿去做各种实验啦，去探索更多关于免疫系统的奥秘。
这就像是我们辛苦学习了好久，终于可以去检验成果，去解决难题一样，让人充满期待。
总之，培养巨噬细胞可真是个精细活儿，每一步都不能马虎，每一个细节都得注意到。
只有这样，才能培养出健康、活跃的巨噬细胞，为科学研究做出贡献呀！。
巨噬细胞培养
巨噬细胞原代培养1、实验前三天，向每只小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤1ml（勿注入肠内）。
2、引颈杀死动物，手提鼠尾将全鼠浸入70%酒精中3～5秒。
3、置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，但勿伤及腹膜壁。
4、再用70%酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10mlEagle液注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动。
5、用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸取入针管内。
6、小心拔出针头，把液体注入离心管中，250g4℃离心10分钟，去上清，加10mlEagle培养基。
7、计数细胞，每只小鼠可产生20～30×105细胞，其中90%为巨噬细胞。
8、为获取3×105帖附细胞/平方厘米，需接种2.5×106/ml。
9、为纯化培养细胞，去除其它白细胞，接种数小时后，去除培养液，用Eagle液冲洗1～2次后，再加新Eagle培养液置37℃CO2温箱中培养.小鼠单核/巨噬细胞RAW 264.71.在ATCC对该细胞传代的描述中是采用细胞刮棒进行的。
我们的经验是，以0.25%胰酶+0.02%的EDTA作为消化液。
使用温至室温的消化液进行消化，消化时镜下观察，并用手掌轻拍细胞贴壁的瓶底，约3~5 min后，待约10%左右的细胞脱离瓶壁即可终止消化，弃去胰酶，以含10%FBS的DMEM培养基吹打细胞。
值得注意的是该细胞对机械损伤比较敏感，所以不要用吸管反复吹打细胞。
该细胞很难将瓶内所有细胞都吹下来，所以换瓶传代就行了。
看了楼主的描述，感觉是细胞难以耐受机械损伤而导致裂解了。
2.消化液：0.5％胰酶、0.2％EDTA，实验前加温到37度以50ml培养瓶为例：1、细胞贴壁生长，长满瓶底80％时，弃去培养液，加D-HANKS 漂洗两次；2. 加入含胰酶和EDTA的消化液1－2ml,消化37℃约2-5min，镜下可见细胞基本圆形回缩即中止消化，弃消化液加D-HANKS 漂洗两次；3.加入新培养液10ml复吹打混悬细胞，按需要分入新的培养瓶3.我得操作如下：实验前将DPBS及DMEM加温到37度使用Flask75培养瓶：1、细胞贴壁生长，长满瓶底70％时，弃去培养液，加DPBS(磷酸盐缓冲液)10ml漂洗一至两次；弃去2. 加入10mlDPBS,然后用scratcher轻轻刮即可，离心后去除DPBS.用DMEM培养液10ml复吹打混悬细胞3.分入新的培养瓶；4. 入37℃5％CO2孵箱，几小时后即可再贴壁。
巨噬细胞培养注意事项
巨噬细胞培养注意事项
1、细胞分离：尽量在封闭的环境下进行细胞分离，防止致病微生物的污染。
2、细胞培养：需要采用营养功能良好的细胞培养基，在适当的温度和湿度条件下进行培养。
3、杀菌：在培养细胞前，需要预先对培养基进行杀菌处理，以防止细菌的污染。
4、细胞离心：在细胞分离前，需要通过离心来去除细胞外的杂质和少量的红细胞沉淀。
5、细胞活性：在取细胞操作之后，需要定期检查细胞表型，以监测细胞的活性水平。
6、游离抗原：由于巨噬细胞是经过免疫调节的，因此在实验中，需要用特定的抗原，如核苷酸或蛋白质，以刺激其免疫功能完成实验目的。
实验一 巨噬细胞培养
实验一腹腔巨噬细胞培养实验目的掌握巨噬细胞培养基本过程实验前准备一、材料成年大鼠1、无菌材料（1）手术器械：解剖剪、解剖镊、止血钳。
（2）消毒用品：碘酒棉球、酒精棉球、酒精灯。
（3）其他用品：注射器、培养皿、离心管、吸管。
（4）刺激剂：4%硫代乙酸钠，煮沸灭菌。
（5）清洗液：HBSS和不含Ca2+和Mg+的HBSS。
（6）培养液：DMEM 加血清。
二、操作程序，以成年大鼠腹腔取材，其法如下：1、实验前4天，向大鼠腹腔内注入无菌硫代乙酸钠5-10ml（勿注入肠内！），以刺流产生大量的巨噬细胞。
2、引颈处死大鼠，经颈总动脉放血。
将动物仰置，剪去腹壁皮毛，用70%酒精消毒。
3、沿正中线剪开腹部皮肤，但勿伤及腹膜壁，把皮肤拉向上下两侧，暴露出腹膜壁，剪开腹壁。
4、注射器吸5-10ml HBSS液注入腹腔中，同时用吸管反复冲洗腹膜腔的细胞，从两侧压揉腹膜壁，使液体在腹腔内流动。
6、吸出使腹膜腔中细胞悬液，置空白管中，离心（1000r/min，10min）。
然后，HBSS混悬细胞，重复离心1次。
7、去上清，先加1ml 培养液混悬沉淀细胞，反复吹打200次左右（动作要轻，尽量不产生气泡）（接种一小滴于培养皿中镜下观察细胞密度，如果密度过大，多加培养液稀释，将细胞稀释到目的浓度,如果细胞数量少，稍加培养液稀释即可种到培养皿中，先接种中间，按一定方向接种，注意不要接种在边缘，平铺，不够，添加适量培养液），培养2h。
8、吸除去培养液，可去除其它白细胞，纯化培养细胞，用不含Ca2+和Mg+的HBSS清洗2次，再加新培养液培养液置CO2温箱中。
三、结果分析巨噬细胞刚贴壁时偏圆形，20min后慢慢伸出伪足，铺开呈三角形或多角形。
此次实验结果巨噬细胞活力不好，有污染出现，可能原因1）取材过程无菌概念不强；2）腹腔注射药物影响；3）细胞接种过程污染；4）培养液可能存在问题；5）培养箱问题。
减少污染：1、严格无菌操作2、大鼠皮肤严格消毒3、碘酒消毒腹部皮肤，酒精绵球脱碘。
巨噬细胞的实验原理是啥
巨噬细胞的实验原理是啥
巨噬细胞的实验原理是通过体外培养的方式，将目标细胞（如细菌、病毒或异物）与巨噬细胞接触，观察和分析巨噬细胞的生物学功能和作用。
巨噬细胞通常参与机体的免疫防御，通过吞噬、杀伤和降解外来病原体或异物，维持机体的内稳态和健康状态。
具体实验步骤可以包括以下内容：
1. 制备巨噬细胞：从实验动物或人体中获取巨噬细胞，通过培养基培养和增殖，使其获得足够的数量。
2. 培养实验细胞：将巨噬细胞放入培养皿中，提供合适的培养基和条件（如温度、湿度、适宜的营养物质），使其继续生长和分化。
3. 处理标的细胞：将待测的目标细胞（如细菌）加入到巨噬细胞培养皿中，使其与巨噬细胞接触。
4. 观察和分析：观察巨噬细胞对目标细胞的处理过程，可以通过显微镜观察和记录形态学变化，或者通过其他实验技术（如流式细胞术、PCR等）检测相关指标，如细胞增殖、细胞毒性、细胞吞噬能力等。
通过巨噬细胞实验，可以研究巨噬细胞与外源物质的相互作用过程、潜在细胞信
号通路和免疫机制等。
这些实验结果有助于理解巨噬细胞的生物学功能、疾病发生机制以及新药物和疫苗研发的方向。
巨噬细胞培养方法
巨噬细胞培养方法
实验材料及实验步骤
实验原理
1 正常情况下，动物腹腔中及腹腔的浆膜表面都有一定数量的巨噬细胞。
为取得更多的巨噬细胞，向动物腹腔中注射刺激剂（硫代乙酸钠），促进机体产生大量巨噬细胞，通过腹腔灌洗获取细胞。
2巨噬细胞的黏附能力明显强于其它类型的细胞。
利用巨噬细胞与其它细胞发生黏附的时间差或者贴壁能力的不同，可以从成分混杂的细胞悬液中分离出纯度较高的巨噬细胞。
实验材料
1 材料来源成年大鼠
2 手术器械解剖剪、解剖镊和止血钳
3 清洗液HBSS和不含Ca2+、Mg2+的HBSS
4 培养液DMEM,
操作步骤
1 大鼠腹膜腔注射10ml 4%硫代乙酸钠
2 4天后拉颈处死，颈动脉放血，医用碘酒、75%乙醇消毒
3 剪开腹壁，用10ml含Ca2+、M g2+ HBSS注入腹膜腔，用吸管反复冲洗腹膜腔的细胞
4 取细胞悬液离心1000r/min,离心10min
5 用DMEM混悬细胞，接种于培养皿内培养半小时
6 用不含Ca2+、Mg2+的HBSS清洗2次，除去漂浮的细胞得到附着于培养皿底壁的巨噬细胞
7 加入培养液继续培养。
GNB14170 HBSS缓冲液成分表
GNB14025 HBSS缓冲液成分表。
巨噬细胞培养
3.刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。
4.泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g：浓硫酸200ml：蒸馏水1000ml）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。
3. 胶帽，离心管帽烘干后只能在2％氢氧化钠溶液中浸泡6-12小时（切记时间不能过长），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。
4. 胶头可用75％酒精浸泡5分钟，然后紫外照射后使用即可。
5.塑料培养瓶，培养板，冻存管：
6.其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸气消毒，可用70％酒精浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子，放在超净台台面上，直接暴露在紫外线下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用2—3周时间洗除残留的氧化乙烯。用20000—100000rad的r射线消毒塑料制品效果最好。
为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆，可在纸包装后，用密写墨水作好标记。其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水，在包装纸上作一记号，平时这种墨水不带痕迹，一经高温，即出现字迹，从而可以判定它们是否消毒。密写墨水的配制：氯化钻(CoC12·6H2o)2g，30％盐酸10m1，蒸馏水88m1。
注意事项：
1.严格执行高压锅的操作规程：高压消毒时，先检查锅内是否有蒸馏水，以防高压时烧干，水不能过多因为其将使空气流畅受阻，会降低高压消毒效果。检查安全阀是否通畅，以防高压时爆炸。
1.小鼠颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡3分钟，取出小鼠，置于无菌纸上，腹面朝上；
2.用镊子提起小鼠下腹部皮肤，剪开一小口，撕开皮肤，完全暴露腹膜；
人巨噬细胞体外培养的形态
人巨噬细胞体外培养的形态人巨噬细胞是一类非常重要的免疫细胞，它们在人体内起着清除病原微生物和废弃细胞的重要作用。
虽然在体内的功能已经得到了广泛的研究，但人巨噬细胞的体外培养形态却是一个相对较少被关注的领域。
人巨噬细胞的体外培养需要一定的条件和培养基。
在细胞培养实验室中，我们通常使用培养皿来进行细胞培养，这样可以提供一个适合细胞生长的环境。
在培养皿中，人巨噬细胞呈现出悬浮生长的状态，细胞的形态呈现多样化，有些细胞呈现出圆形或椭圆形，有些则呈现出星形或分枝状。
人巨噬细胞的形态特点也与其功能密切相关。
在体外培养中，我们可以观察到人巨噬细胞的吞噬能力。
当人巨噬细胞遇到病原微生物或废弃细胞时，它们会通过伸展出细胞伪足将其包裹并吞噬进细胞内部，完成吞噬过程后，细胞的形态会发生明显的变化，呈现出更大和更圆的形态。
除了吞噬能力，人巨噬细胞还具有分泌细胞因子的能力。
在体外培养中，我们可以观察到人巨噬细胞释放细胞因子的过程。
细胞因子是一类具有调节和介导免疫反应的蛋白质，它们可以促进炎症反应和免疫细胞的活化。
当人巨噬细胞受到刺激时，它们会释放细胞因子，这些细胞因子可以引起周围细胞的炎症反应，并吸引其他免疫细胞参与到炎症反应中来。
在人巨噬细胞的体外培养过程中，我们还可以观察到细胞的增殖和分化现象。
人巨噬细胞可以通过细胞分裂的方式增殖，从而维持其在体外培养中的数量。
此外，人巨噬细胞还可以分化为不同的亚型，如经典型和替代型巨噬细胞，这些亚型在免疫反应中具有不同的功能和调控机制。
总的来说，人巨噬细胞的体外培养形态丰富多样，反映了其在免疫反应中的复杂功能和调控机制。
通过对人巨噬细胞的体外培养研究，我们可以更深入地了解其生物学特性和免疫功能，为免疫治疗和疾病治疗提供理论和实践基础。
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1、实验前三天，向每只小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤1ml（勿注入肠内）。
2、引颈杀死动物，手提鼠尾将全鼠浸入70%酒精中3～5秒。
3、置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，但勿伤及腹膜壁。
4、再用70%酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10mlEagle液注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动。
5、用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸取入针管内。
6、小心拔出针头，把液体注入离心管中，250g4℃离心10分钟，去上清，加10mlEagle培养基。
7、计数细胞，每只小鼠可产生20～30×105细胞，其中90%为巨噬细胞。
8、为获取3×105帖附细胞/平方厘米，需接种2.5×106/ml。
9、为纯化培养细胞，去除其它白细胞，接种数小时后，去除培养液，用Eagle液冲洗1～2次后，再加新Eagle培养液置37℃CO2温箱中培养小鼠单核/巨噬细胞RAW 264.71.在ATCC对该细胞传代的描述中是采用细胞刮棒进行的。
我们的经验是，以0.25%胰酶+0.02%的EDTA作为消化液。
使用温至室温的消化液进行消化，消化时镜下观察，并用手掌轻拍细胞贴壁的瓶底，约3~5 mi n后，待约10%左右的细胞脱离瓶壁即可终止消化，弃去胰酶，以含10%FBS的DMEM培养基吹打细胞。
值得注意的是该细胞对机械损伤比较敏感，所以不要用吸管反复吹打细胞。
该细胞很难将瓶内所有细胞都吹下来，所以换瓶传代就行了。
看了楼主的描述，感觉是细胞难以耐受机械损伤而导致裂解了。
2.消化液：0.5％胰酶、0.2％EDTA，实验前加温到37度以50ml培养瓶为例：1、细胞贴壁生长，长满瓶底80％时，弃去培养液，加D-HANKS 漂洗两次；2. 加入含胰酶和EDTA 的消化液1－2ml,消化37℃约2-5min，镜下可见细胞基本圆形回缩即中止消化，弃消化液加D-HANKS 漂洗两次；3.加入新培养液10ml复吹打混悬细胞，按需要分入新的培养瓶3.我得操作如下：实验前将DPBS及DMEM加温到37度使用Flask75培养瓶：1、细胞贴壁生长，长满瓶底70％时，弃去培养液，加DPBS(磷酸盐缓冲液)10ml漂洗一至两次；弃去2. 加入10mlDPBS,然后用scratcher轻轻刮即可，离心后去除DPBS.用DMEM 培养液10ml复吹打混悬细胞3.分入新的培养瓶；4. 入37℃5％CO2孵箱，几小时后即可再贴壁；4. 入37℃5％CO2孵箱，几小时后即可再贴壁。
4.RAW264.7细胞传代后贴壁时间比较短，半小时就能贴很多，刚贴壁时细胞呈圆形，折光度很好，镜下观察明亮如小珍珠状一个个地散落于瓶底面。
生长一段时间后，部分细胞会变为类似四角形，伸出伪足之类的吧。
这个时候其实就是提示你注意传代了，这部分细胞如再不传代，很容易就老化掉。
5.细胞老得特别快,用DMEM培养基本上一天培养基就会变黄,需要换液,如果换液换晚了的话细胞就感觉长融在一起细胞壁不清楚,但基本上不会有死细胞6.小鼠的单核细胞系RAW264.7细胞(ATCC号:TIB-71)用含10% 胎牛血清(FBS，美国GIBCO公司)的无酚红DMEM (美国Promega公司)培养液培养，其中含50 U/ml青霉素和50 μg/ml庆大霉素。
3 d换液1次,细胞汇片后, 用胰酶二乙胺四乙酸（EDTA）消化液消化细胞,根据不同的实验目的接种于不同规格的培养板上。
7.ATCC complete growth medium:The basemedium for this cell line is ATCC-formulated Dulbecco's Modified Eagle's Medium（DMEM）, Catalog No. 30-2002. To make the complete growth medium, add the following components to the base medium: fetal bovine serum to a final concentration of 10%.Atmosphere:air, 95%; carbon dioxide (CO2), 5%Temperature:37.0°C8.Subcultures are prepared by scraping.For a 75 cm2 flask, remove all but （差不多）10 ml culture medium (adjust amount accordingly for other culture vessels). Dislodge cells from the flask substrate with a cell scraper; aspirate and add appropriate aliquots of the cell suspension into new culture vessels.Subcultivation Ratio: A subcultivation ratio of 1:3 to 1:6 is recommendedMedium Renewal: Replace or add medium every 2 to 3 days.9.Preservation:Freeze medium:Complete growth medium supplemented with 5% (v/v) DMSOtorage temperature: liquid nitrogen vapor phase10.This line was established from a tumor induced by Abelson murine leukemia virus. They arenegative for surface immunoglobulin (sIg-), Ia (Ia-) and Thy-1.2 (Thy-1.2) This line does not secrete detectable virus particles and is negative in the XC plaque formation assay. The cells will pinocytose（摄取）neutral red（中性红）and will phagocytose （吞噬）latex beads （乳胶微球）and zymosan（酵母多糖）. They are capable of antibody dependent lysis of sheep erythrocytes (绵羊红细胞)and tumor cell targets. LPS or PPD （结核菌素）treatment for 2 days stimulates lysis of erythrocytes but not tumor cell targets. Data communicated in Feb. 2007 by Dr Janet W. Hartley, indicates the expression of infectious ecotropic MuLV closely related, if not identical, to the Moloney MuLV helper virus used in the original virus inoculum. The cells also express polytropic MuLV, unsurprisingly based on the mouse passage history of the virus stocks [ PubMed 18177500].PBS磷酸盐缓冲液含0.05%吐温－20的pH7.4的磷酸盐缓冲液(简称为PBS－T)配制方法为：称取磷酸二氢钾(KH2PO4)，磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)，氯化钠(NaCl)，氯化钾(KCl)，吐温－20 ，加水。
PBS:Phosphate Buffered SalinePBS 1L配方：pH7.4：磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.27g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.42g，氯化钠(NaCl)：8g，氯化钾(KCl)0.2g，加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.2-7.4，最后定容到1L。
高温高压灭菌后室温保存。
PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 10mmol/L，KH2PO4 2mmol/LDPBS杜氏磷酸缓冲液，全称为：Dulbecco's Phosphate Buffered Saline和常用标准PBS区别是不含钙、镁离子。
组分分子量浓度 (gm/L) 摩尔浓度 (mM)氯化钾 (KCl) 75 0.20 2.67磷酸二氢钾 (KH2PO4) 136 0.20 1.47氯化钠 (NaCl) 58 8.00 138.00磷酸氢二钠 (Na2HPO4) 142 1.15 8.10pH值为7.4。
D-Hanks液则是无钙镁离子的Hanks液。
BSS与细胞生长状态下的pH值、渗透压及无菌状态一致，且配方简单，是组织培养基本用液，常用于配制培养基及其他用液，或洗细胞等，细胞在BSS中可生存几个小时。
Hanks配制甲液：Na2HPO4•2H2O 0．06克KH2PO4 0．06克MgSO4•7H2O 0．20克葡萄糖1．00克NaCl 8．00克三蒸水750毫升乙液：CaCl2 0．14克三蒸水100毫升①将乙液徐徐加入甲液中。
②将0．35克NaHCO3溶解在37℃100毫升三蒸水中。
③用数滴NaHCO3液溶解0．02克酚红。
④将②、③液移入①液中。
⑤用三蒸水定容至1000毫升，充分混匀，4℃冰箱过夜。
⑥滤过消毒，小瓶分装，冷藏。
注意：酚红对细胞有一定毒性，目前实验中的用量除0．02克外，还有0．01克和0．005克，也有BSS液中不加酚红的。
酚红量不同，BSS颜色也不同。
配制胰蛋白酶消化液胰蛋白酶主要采自牛或猪的胰脏，呈白色粉末状，易潮解，应在低温干燥处保存。
胰酶的活力常用一份胰酶解离酪蛋白的份数表示，常用胰酶活力为1：125或1：250。
本实验室一般用1：250(GRC公司生产)。
胰蛋白酶对细胞的分离效果与细胞的类型、特性和瓶壁表面特性有关。