巨噬细胞培养

1、实验前三天，向每只小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤1ml（勿注入肠内）。

2、引颈杀死动物，手提鼠尾将全鼠浸入70%酒精中3～5秒。

3、置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，

但勿伤及腹膜壁。

4、再用70%酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10mlEagle液注入腹腔中，同时从两侧用

手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动。

5、用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸取入针管

内。

6、小心拔出针头，把液体注入离心管中，250g4℃离心10分钟，去上清，加10mlEagle

培养基。

7、计数细胞，每只小鼠可产生20～30×105细胞，其中90%为巨噬细胞。

8、为获取3×105帖附细胞/平方厘米，需接种2.5×106/ml。

9、为纯化培养细胞，去除其它白细胞，接种数小时后，去除培养液，用Eagle液冲洗1～2

次后，再加新Eagle培养液置37℃CO2温箱中培养

小鼠单核/巨噬细胞RAW 264.7

1.在ATCC对该细胞传代的描述中是采用细胞刮棒进行的。我们的经验是，以0.25%胰

酶+0.02%的EDTA作为消化液。使用温至室温的消化液进行消化，消化时镜下观察，并用手掌轻拍细胞贴壁的瓶底，约3~5 mi n后，待约10%左右的细胞脱离瓶壁即可终止消化，弃去胰酶，以含10%FBS的DMEM培养基吹打细胞。值得注意的是该细胞对机械损伤比较敏感，所以不要用吸管反复吹打细胞。该细胞很难将瓶内所有细胞都吹下来，所以换瓶传代就行了。看了楼主的描述，感觉是细胞难以耐受机械损伤而导致裂解了。

2.消化液：0.5％胰酶、0.2％EDTA，实验前加温到37度以50ml培养瓶为例：1、细胞

贴壁生长，长满瓶底80％时，弃去培养液，加D-HANKS 漂洗两次；2. 加入含胰酶和EDTA 的消化液1－2ml,消化37℃约2-5min，镜下可见细胞基本圆形回缩即中止消化，弃消化液加D-HANKS 漂洗两次；3.加入新培养液10ml复吹打混悬细胞，按需要分入新的培养瓶3.我得操作如下：实验前将DPBS及DMEM加温到37度使用Flask75培养瓶：1、

细胞贴壁生长，长满瓶底70％时，弃去培养液，加DPBS(磷酸盐缓冲液)10ml漂洗一至两次；弃去2. 加入10mlDPBS,然后用scratcher轻轻刮即可，离心后去除DPBS.用DMEM 培养液10ml复吹打混悬细胞3.分入新的培养瓶；4. 入37℃5％CO2孵箱，几小时后即可再贴壁；4. 入37℃5％CO2孵箱，几小时后即可再贴壁。

4.RAW264.7细胞传代后贴壁时间比较短，半小时就能贴很多，刚贴壁时细胞呈圆形，折

光度很好，镜下观察明亮如小珍珠状一个个地散落于瓶底面。生长一段时间后，部分细胞会变为类似四角形，伸出伪足之类的吧。这个时候其实就是提示你注意传代了，这部分细胞如再不传代，很容易就老化掉。

5.细胞老得特别快,用DMEM培养基本上一天培养基就会变黄,需要换液,如果换液换晚了

的话细胞就感觉长融在一起细胞壁不清楚,但基本上不会有死细胞

6.小鼠的单核细胞系RAW264.7细胞(ATCC号:TIB-71)用含10% 胎牛血清(FBS，美国

GIBCO公司)的无酚红DMEM (美国Promega公司)培养液培养，其中含50 U/ml青霉素和

50 μg/ml庆大霉素。3 d换液1次,细胞汇片后, 用胰酶二乙胺四乙酸（EDTA）消化液消化

细胞,根据不同的实验目的接种于不同规格的培养板上。

7.ATCC complete growth medium:The base

medium for this cell line is ATCC-formulated Dulbecco's Modified Eagle's Medium（DMEM）, Catalog No. 30-2002. To make the complete growth medium, add the following components to the base medium: fetal bovine serum to a final concentration of 10%.

Atmosphere:air, 95%; carbon dioxide (CO2), 5%

Temperature:37.0°C

8.Subcultures are prepared by scraping.

For a 75 cm2 flask, remove all but （差不多）10 ml culture medium (adjust amount accordingly for other culture vessels). Dislodge cells from the flask substrate with a cell scraper; aspirate and add appropriate aliquots of the cell suspension into new culture vessels.

Subcultivation Ratio: A subcultivation ratio of 1:3 to 1:6 is recommended

Medium Renewal: Replace or add medium every 2 to 3 days.

9.Preservation:

Freeze medium:Complete growth medium supplemented with 5% (v/v) DMSO

torage temperature: liquid nitrogen vapor phase

10.This line was established from a tumor induced by Abelson murine leukemia virus. They are

negative for surface immunoglobulin (sIg-), Ia (Ia-) and Thy-1.2 (Thy-1.2) This line does not secrete detectable virus particles and is negative in the XC plaque formation assay. The cells will pinocytose（摄取）neutral red（中性红）and will phagocytose （吞噬）latex beads （乳胶微球）and zymosan（酵母多糖）. They are capable of antibody dependent lysis of sheep erythrocytes (绵羊红细胞)and tumor cell targets. LPS or PPD （结核菌素）treatment for 2 days stimulates lysis of erythrocytes but not tumor cell targets. Data communicated in Feb. 2007 by Dr Janet W. Hartley, indicates the expression of infectious ecotropic MuLV closely related, if not identical, to the Moloney MuLV helper virus used in the original virus inoculum. The cells also express polytropic MuLV, unsurprisingly based on the mouse passage history of the virus stocks [ PubMed 18177500].

PBS磷酸盐缓冲液

含0.05%吐温－20的pH7.4的磷酸盐缓冲液(简称为PBS－T)配制方法为：

称取磷酸二氢钾(KH2PO4)，磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)，氯化钠(NaCl)，氯化钾(KCl)，吐温－20 ，加水。

PBS:Phosphate Buffered Saline

PBS 1L配方：

pH7.4：

磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.27g，

磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.42g，

氯化钠(NaCl)：8g，

氯化钾(KCl)0.2g，

加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.2-7.4，最后定容到1L。高温高压灭菌后室温保存。

PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 10mmol/L，KH2PO4 2mmol/L

DPBS杜氏磷酸缓冲液，全称为：Dulbecco's Phosphate Buffered Saline

和常用标准PBS区别是不含钙、镁离子。