巨噬细胞原代培养、传代、冻存、复苏

巨噬细胞培养

巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周，多用做原代培养，难以长期生存。

巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l 等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。

培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，以小鼠腹腔取材法最为实用，其法如下：

1．实验前三天，向每只小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤1ml（勿注入肠内）。

2．引颈杀死动物，手提鼠尾将全鼠浸入70％酒精中3～5秒。

3．置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，但勿伤及腹膜壁。

4．再用70％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动。

5．用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸取入针管内。

6．小心拔出针头，把液体注入离心管中，1000g 4℃离心10分钟，去上清，加10 ml Eagle培养基。

7．计数细胞，每只小鼠可产生20～30×105细胞，其中90％为巨噬细胞。

8．为获取3×105个帖附细胞/平方厘米，需接种2.5×106/ml。

9．为纯化培养细胞，去除其它白细胞，接种数小时后，去除培养液，用Eagle 液冲洗1～2次后，再加新Eagle培养液置37℃ CO2温箱中培养。

小鼠腹腔巨噬细胞的制备

1.小鼠颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡3分钟，取出小鼠，置于无菌纸上，腹

面朝上；

2.用镊子提起小鼠下腹部皮肤，剪开一小口，撕开皮肤，完全暴露腹膜；

3.10ml注射器装上大号针头，注入6 ml Hanks液或PBS，用镊子提起腹膜，

向腹腔中注入Hanks液，针尖朝上，避开肠和脂肪，回抽腹腔液，不同方向冲洗数次，吸出腹腔液；

4.细胞悬液离心200×g10分钟，用Hanks液洗一次，用RPMI1640－5%小牛

血清悬起细胞，2×106细胞/ ml ；

5.细胞悬液置入培养瓶，37度培养2小时后，吸弃上清，用预热培养基洗二

次，留下贴壁细胞；

6.含10 mM EDTA的PBS加入培养瓶，覆盖细胞，37度孵育20分钟，用吸

管用力吹打下细胞，或用橡皮擦帚轻轻刮下细胞，即为腹腔巨噬细胞，纯度一般大于90%，每只小鼠平均可得2×106腹腔巨噬细胞。

注:

1.雌性小鼠6-8周最适用。雄性小鼠肠壁脂肪多。不利于腹腔液收集；

2.在冲洗过程中应小心，以免刺破血管或肠壁，血液流入腹腔液；

3.吸出的腹腔液应洗后再贴壁，否则有血浆膜形成，影响贴壁；

4.贴壁巨噬细胞分离有较多方法，如利多卡因孵育等，但大多不够理想，故

细胞分离后应用台盼兰染色检测活力；

5.橡皮擦帚可自制，用自行车气门芯上的橡皮管套在预先折弯的滴管尖头上，

灭菌后使用，较为实用；

6.炎性巨噬细胞的制备可用3%的脱水硫羟乙酸培养基2ml，注入小鼠腹腔，

4天后同法由集腹腔细胞，每只小鼠腹腔细胞产量可以增加到3×107细胞左右。需指出的是炎性巨噬细胞的功能活性与正常腹腔巨噬细胞有很大差异。

巨噬细胞的纯化

1）用帖壁法纯化巨噬细胞

1．用含20％～40％小牛血清的RPMI-1640培养液将巨噬细胞配成2×106～4×10 6/ml的浓度。以每平方厘米2×105～4×105个巨噬细胞的密度将细胞悬液接种到

玻璃培养皿（瓶）或塑料培养皿（瓶）中。37℃5％CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养1小时或24小时。1小时培养节省时间但会丢失一些粘附力弱的巨噬细胞，而24小时可以得到较多的巨噬细胞。20％～40％的小牛血清可以减少B淋巴细胞的粘附。

2．摇晃培养皿（瓶），悬浮未粘附细胞，吸出细胞悬液。用预温的Hanks液洗涤细胞3～4次。悬浮细胞可重复粘附，得到更多巨噬细胞。用适量含2.5mmol/ L EDTA的无钙镁Hanks液消化细胞37℃15～30分钟。用吸管吹打分离细胞，离心250×g 10分钟，去上清液。

3．用预冷的Hanks液洗涤细胞3～4次，每次离心250×g 10分钟，去上清液。最后用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞并决定细胞活力，将细胞配成所需的浓度。

2）用不连续密度梯度离心纯化巨噬细胞

1．取15ml离心管，将制备好的各浓度密度梯度材料按下浓上淡的顺序依次分层加在离心管中，每个浓度2ml。最后加上上述巨噬细胞悬液3～5ml（约含2×107～5×107细胞）。

2．4℃中，水平离心1000×g 30分钟，垂直取出离心管，小心吸出各交界面的细胞。分别用预冷的含1％小牛血清RPMI-1640培养液洗涤各交界面细胞2次，每次200×g 10分钟。用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液将细胞配成所需的浓度。

Blasi等[2]研究鼠克隆巨噬细胞系对酵母相（Y相）及菌丝相（H相）白念珠菌的应答时发现，巨噬细胞能分辨Y相及H相菌并给予不同应答。对Y相菌仅是吞噬作用而不引起巨噬细胞自身分泌功能的变化，而H相菌可作为刺激信号引起巨噬细胞肿瘤坏死因子（TNF）分泌增加及溶菌酶分泌减少。尽管TNF 不导致H相菌的死亡，但可通过自分泌及旁分泌的机制调节巨噬细胞及其它效应细胞的抗白念珠菌活性。在非单一细胞系里，由于不同细胞类型间的配合，鼠脾巨噬细胞体外在Y相白念珠菌的刺激下也应答而分泌TNF。

Blasi P et al.Infect Immun,1992;60(3):832-837

细胞培养过程中的注意事项及试剂配制

一.常用设备

准备室的设备：

单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品规（放置消毒过的物品）、包装台。

配液室的设备：

扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。