有机溶剂及变性剂对南美白对虾体壁几丁质酶的影响[1]

第 26 卷第 4 期海洋通报V ol. 26，No.4 2007 年 08 月 MARINE SCIENCE BULLETIN Aug. 2007有机溶剂及变性剂对南美白对虾体壁几丁质酶的影响林建城，陈郁花，林俊兵( 莆田学院环境与生命科学系，福建莆田 351100 )摘 要：从南美白对虾体壁提取几丁质酶，测定了几丁质酶 ( EC3.2.1.14 ) 催化胶体几丁质水解反应的动力学参数，研究了几种有机溶剂及其变性剂对对虾体壁几丁质酶的影响，以探讨养殖环境与对虾的生长发育过程的相关性。

结果是对虾体壁几丁质酶米氏常数K m = 2.09 mg/mL，最大反应速度V m = 0.93 µmol/mL·min；甲醇、乙醇、正丙醇、乙二醇、丙三醇及脲对几丁质酶有抑制作用；二氧六环、二甲亚砜和SDS在低浓度时对酶有激活作用,随着浓度的升高表现出抑制作用；丙酮对酶有激活作用；戊二醛和甲醛对酶的抑制强度不大，最大的抑制程度分别达 8.0 % 和 9.8 %。

表明养殖环境的变化可引起与对虾蜕皮直接相关的几丁质酶生理生化的改变。

关键词：南美白对虾；几丁质酶；有机溶剂；变性剂；酶活力中图分类号：Q556.1 文献标识码：A 文章编号：1001-6932(2007)04-0061-0005几丁质酶 ( EC3.2.1.14 ) 能特异地催化水解几丁质中β-1, 4-糖苷键生成 N-乙酰-D-氨基葡萄糖( NAG )，广泛存在于微生物、甲壳动物和某些植物中，在自然界的碳循环中具有极其重要的作用。

南美白对虾 ( Penaeus vannamei ) 是优良的养殖种类, 在对虾的体壁 ( 壳膜 ) 及内脏中分布有几丁质酶，是其赖以生存、生长的重要酶类之一。

对虾在其生活史中要经过多次蜕皮，已证实虾眼柄中 X 器官－窦腺复合体制造和分泌的一种多肽类蜕皮抑制激素在调节对虾蜕皮过程中起重要作用。

目前人们还注意到对虾表皮分泌的几丁质酶及其生理过程与虾生长发育过程中的周期性蜕皮存在相关性，在虾幼体的孵化中起重要作用 [1]，因此有关甲壳动物几丁质酶生理生化的研究也越来越受重视 [2, 3]。

特别是当前对虾养殖的水环境已受到严重污染，水体中有机化合物、金属离子等的严重超标现象势必影响对虾体内几丁质酶的活力及构象，进而扰乱了对虾的正常生理活动过程。

前已阐明环境因子对对虾内脏 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力的影响 [4, 5]，本文从生物化学以及动力学的角度研究了有机污染物 ( 如有机容剂和变性剂 ) 对南美白对虾生理机能的影响效应。

1 材料与方法1.1 材料N-乙酰-D-氨基葡萄糖( NAG ) 为Sigma产品，3, 5 二硝基水杨酸为 Fluka 产品，甲壳素出自中国医药集团上海化学试剂公司，十二烷基硫酸钠( SDS )、脲、各种有机溶剂等试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 方法1.2.1 几丁质酶的制备取鲜活的南美白对虾的体壁，样品以W样品∶V = 1∶3 浸泡在预冷的50 mmol/L NaAc-HAc 缓冲液中匀浆，在高速组织捣碎机中破碎 1 min，放置冰箱抽提 4 h 以上，匀浆液在 4 ℃，20 000 g 下离心 30 min，得离心上清液，为粗酶制剂。

1.2.2 胶体几丁质的制备10 g 细粉几丁质 ( 甲壳素 ) 加入 100 mL 浓盐酸，4 ℃间隔搅拌 24 h，倒入 500 mL 预冷蒸馏水中，放置 2 d，离心，沉淀用蒸馏水洗至中性，用100 mmol/L NaAc-HAc ( pH5.6 )缓冲液配成 10 mg/mL 胶体几丁质。

收稿日期：2006-10-12；收修改稿日期：2007-01-3062 海 洋 通 报 26 卷1.2.3 几丁质酶活力的测定方法 参照陈清西等方法 [6]，在 0.5 mL 的测活体系中 ( 含终浓度为 50 mmol/L 、pH 5.6 NaAc-HAc 缓冲液、5 mg/mL 胶体几丁质 )， 55 ℃ 预热 10 min ，后加入 0.05 mL 的酶液， 55 ℃ 下恒温反应 30 min ，以 0.5 mL 的 NaOH ( 浓度为 0.5 mol/L ) 终止反应，离心，去沉淀，取上清液 0.5 mL ，加入 0.5 mL DNS ，煮沸 5 min ，在 752 紫外可见分光光度计测定 OD 520nm 。

1 个酶活力单位定义为：每小时水解胶体几丁质产生 1 µmol N-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量。

1.2.4 有机溶剂及其变性剂对对虾体壁几丁质酶的影响 选择甲醇、乙醇、正丙醇、乙二醇、丙三醇、戊二醛、甲醛、丙酮、二氧六环、二甲亚砜 ( DMSO ) 等有机溶剂以及SDS 、脲为效应物，在 0.5 mL 的测活体系中 ( 含终浓度为 50 mmol/L 、pH5.6 NaAc-HAc 缓冲液，5 mg/mL 胶体几丁质 )，加入不同浓度的效应物，计算各处理组的相对酶活力 ( 相对于未经处理的酶活力的百分比 )，分析研究各效应物对对虾体壁几丁质酶活力的影响。

2 结果与分析2. 1 几丁质酶催化胶体几丁质水解的动力学参数对南美白对虾几丁质酶催化底物胶体几丁质水解反应的动力学参数进行测定：在 0.5 mL 50 mmol/L NaAc-HAc 缓冲液 ( pH = 5.6 ) 的测活体系中，改变底物浓度，55 ℃下，测定酶促反应的初速度，以Lineweaver-Burk 双倒数作图 ( 图 1 )，求几丁质酶水解胶体几丁质的米氏常数 K m = 2.09 mg/mL ，最大反应速度 V m = 0.93 µmol/mL·min 。

2. 2 有机溶剂对南美白对虾体壁几丁质酶活力的影响2.2.1 几种伯醇对酶活力的影响 研究了甲醇 ( a )、乙醇( b ) 和正丙醇 ( c ) 对几丁质酶活力的影响，测定结果见图2-1。

三种伯醇对几丁质酶均表现为抑制作用，浓度在10 %( 体积分数 φ % ) 以内几丁质酶失活速度较快，后随抑制剂浓度增大酶活力呈缓慢的失活趋势。

同时，三种伯醇对酶活力的抑制程度不同，10 % 的甲醇、乙醇和正丙醇可分别使对虾体壁几丁质酶的活力下降 68.4 %、 61.5 %和 22.0 %，甲醇的抑制能力较强。

2.2.2 多元醇对酶活力的影响 不同浓度的乙二醇 ( d )、丙三醇 ( e ) 对对虾体壁几丁质酶活力均呈现微弱的抑制作用，抑制作用也显示了浓度效应，实验结果见图 2-2。

10 %的乙二醇与丙三醇可分别使酶活力丧失 7.3 %和 9.4 %，丙三醇对酶活力的抑制作用稍强。

2.2.3 醛类化合物对酶活力的影响 选择戊二醛 ( f ) 和甲醛 ( g ) 为效应物，在 0 ~ 0.2 % 浓度范围内研究了醛类化合物对对虾体壁几丁质酶的效应，结果见图 2-3。

两种醛类物质对酶的效应均表现为：起先是随浓度的增大抑制作用增强，后随浓度增大抑制作用减弱，渐趋稳定。

戊二醛和甲醛的浓度为 0.04 % 时，酶的剩余活力分别为 92.5 % 和 90.2 %，抑制强度不大。

2.2.4 丙酮对酶活力的影响 丙酮 ( h ) 对对虾体壁几丁质酶活力的影响结果见图 2-4。

结果表明丙酮对对虾体壁几丁质酶活力有一定的激活作用，随着浓度的升高，激活作用增强； 10 % 的丙酮可以使酶活力提高 25.9%，后随丙酮浓度的增加激活作用渐趋平稳。

2.2.5 二氧六环和二甲亚砜对酶活力的影响 分别以二氧六环 ( i ) 和二甲亚砜 ( j ) 为效应物，检测它们对酶活力的影响，结果见图 2-4。

二氧六环和二甲亚砜对对虾体壁几丁质酶均表现为先扬后抑的效应，但二氧六环对酶活力的影响较大。

2.5 % 的二氧六环对酶激活作用较大，可使酶活力提高 14.4 %，而二甲4 期 林建城 等：有机溶剂及变性剂对南美白对虾体壁几丁质酶的影响 63 亚枫对酶活力先表现为微弱的激活作用，后随着浓度的升高，酶活力呈缓慢下降趋势。

2. 3 变性剂对南美白对虾体壁几丁质酶活力的影响2.3.1 SDS 对酶活力的影响 在 0 ~ 100 mmol/L 浓度范围内，研究了 SDS ( k ) 对对虾体壁几丁质酶活力的影响，结果表明 ( 图 2 - 5 ) ： SDS 对酶活力表现为低浓度下激活而随浓度增大转而抑制的效应。

7.5 mmol/L 的SDS 可使酶活力提高 27.3 %，而 40 mmol/L 的 SDS 又可使酶活力丧失 29.8 %。

2.3.2 脲对酶活力的影响 脲 ( l ) 对对虾体壁几丁质酶活力的抑制作用 ( 图 2 - 6 ) 表现为浓度效应，在 0 ~ 6 mol/L 浓度范围内，随尿素的浓度增大，抑制作用增强，6 mol/L 的脲可使酶活力下降 25.0 %。

图 2 有机溶剂与变性剂对南美白对虾体壁几丁质酶活力的影响a: 甲醇; b: 乙醇; c: 正丙醇; d: 乙二醇; e: 丙三醇; f: 戊二醛; g: 甲醛; h: 丙酮; i: 二氧六环; j: 二甲亚枫; k: 十二烷基硫酸钠; l: 脲Fig. 2 Effects of different organic solvents and denaturants on the activity of chitinase from the integument of Penaeus vannameia: Methanol; b: Alcohol; c: Propanol; d: Glycol; e: Glycerol; f: Glutaraldehyde; g: Formaldehyde;h: Acetche; i: Dioxane; j: Dimethyl sulfoxide; k: Sodium dodecyl sulfate; l: Urea3 讨 论酶高催化活性有其特殊的微环境效应，几丁质酶在有机溶剂介质中，酶活性中心必需基团所处的微环境极性可能发生较大变化，从而降低了酶活性，另一方面介质中有机溶剂含量的增加，酶蛋白失活的趋势也增强 [7]。

本实验结果表明甲醇、乙醇、正丙醇、乙二醇、丙三醇对南美白对虾体壁几丁质酶活力均有不同程度的抑制作用，与前研究的这些有机溶剂对对虾内脏N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶 ( NAGase ) [5] 活力均表现为在低浓度下激活、高浓度下呈现抑制作用的效应不同。

黄小红等报道 [6] 了乙醇、正丙醇和乙二醇对苏云金芽孢杆菌 ( Bt ) 几丁质酶的影响，结果是在低浓度时对酶有激活作用，随着浓度的升高表现出抑制作用，而甲醇和丙三醇对 Bt 几丁质酶又有较大的抑制作用，与本实验结果相似。