花生粕的枯草芽孢杆菌BSH001发酵及产物性质_刘冬梅

盐酸、硫酸铜、乙醇均为分析纯，广州化学试剂 厂生产； 氢氧化钠、硫酸钾、乙醚、硼酸均为分析纯， 天津市福 晨 化 学 试 剂 厂 生 产； 碳 酸 钠、浓 硫 酸、甲 醇、冰醋酸 均 为 分 析 纯，天 津 市 科 密 化 学 试 剂 有 限 公司生产； 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、 三羟甲基氨基甲烷、四甲基乙二胺、β-巯基乙醇、甘 氨酸、考马 斯 亮 蓝 Ｒ-250、标 准 蛋 白 （ 分 子 质 量 为 24 ～ 97 ku） 均为分析纯，北京鼎国生物技术有限责 任公司生产．
科研业务费专项资金资助项目（ D2116760） 作者简介： 刘冬梅（ 1972-） ，女，博士，副教授，主要从事食品微生物利用与控制研究． E-mail： liudm@ scut． edu． cn
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华 南 理 工 大 学 学 报 （ 自 然 科 学 版）
第 42 卷
基酸平衡，减少花生蛋白质中的过敏原，文中对 BS H001 发酵 PNM 的条件、FPNM 中蛋白质的部分性 质和发酵前后的氨基酸变化进行了研究．
1． 3 实验方法
1． 3． 1 BS H001 菌种的活化及种子液的制备 （ 1） BS H001 菌种的活化 根据配方配制种子培养基，于 121 ℃ 、0． 1 MPa
下灭菌 20 min 后冷却，接入 BS H001，于 30 ℃ 下培 养 24 h 后，为母种子液．
（ 2） BS H001 种子液的制备 根据配方配制种子培养基，于 121 ℃ 、0． 1 MPa 下灭 菌 20 min 后 冷 却，接 入 母 种 子 液，在 30 ℃ 、 200 r / min下培养 24 h 后，BS H001 细胞浓度达 1． 0 × 109 ～ 3． 0 × 109 CFU / mL，为种子液． 1． 3． 2 PNM 的发酵 在 50 g PNM 中加入适量的水和硫酸铵，搅拌均
匀后，装入 150 mL 的锥形瓶中，封口，在 0． 1 MPa 下 灭菌一定时间后冷却至 30 ℃ ，按 2% ～ 10% 的质量 分数接种 BS H001 种子液，搅拌均匀后，于 30 ℃ 下 发酵一定 时 间，在 发 酵 期 间 定 期 搅 拌，发 酵 结 束 后 的 PNM 进行真空冷冻干燥． 1． 3． 3 蛋白质含量分析
质． 正交试验结果表明： 枯草芽孢杆菌 BS H001 发酵花生粕的最优条件为含水量 52% 、
发酵时间 44 h、搅拌间隔 8 h、灭菌时间 45 min、硫酸铵含量 4． 0% ，在此条件下发酵花生
粕中的蛋白质含量达 56． 20% ，比花生粕的提高了 23． 49% ； 发酵花生粕中非必需氨基
来降解． 枯草芽孢杆菌被用于许多大豆发酵食品的 发酵，如泰国的 Thua-Nao、日本的纳豆和中国的豆 豉 等［4-6］，这 些 发 酵 食 品 都 利 用 枯 草 芽 孢 杆 菌 分 泌 的蛋白酶使大分子蛋白质水解成小分子蛋白质，因 此其蛋白质有较好的生物效价［7］； 同时，枯草芽孢 杆菌的发酵作用使食品中蛋白质类过敏原的结构 发生变化，在 降 低 过 敏 反 应 的 同 时，增 加 了 食 品 中 游离氨基酸和多肽的含量［8-10］． 目前，在利用枯草芽 孢杆菌发酵豆粕生产易消化的蛋白质饲料方面已 有较多研究［11-13］，但利用其进行花生粕发酵的研究 则很少，尚未实现发酵花生粕（ FPNM） 的规模化生 产，更没有涉及到 PNM 发酵前后的氨基酸种类及含 量变化．
（ 1） 含水量的影响实验 PNM 分别在 33% 、50% 、60% 、67% 、71% 的含 水量下 进 行 实 验． 其 他 发 酵 条 件 如 下： 发 酵 时 间 48 h、搅 拌 间 隔 8 h、灭 菌 时 间 20 min、硫 酸 铵 含 量 2． 0% ． （ 2） 发酵时间的影响实验 分别在 24、36、48、60、72 h 的发酵时间下进行 实验． 其他发酵条件 如 下： 含 水 量 50% 、搅 拌 间 隔 8 h、灭菌时间 20 min、硫酸铵含量 2． 0% ． （ 3） 搅拌间隔的影响实验 分别在 0（ 不搅拌） 、4、8、12、16 h 的搅拌间隔下 进行实验． 其他发酵条件如下： 含水量 50% 、发酵时 间 48 h、灭菌时间 20 min、硫酸铵含量 2． 0% ． （ 4） 灭菌时间的影响实验 分别在 0、10、20、30、40 min 的灭菌时间下进行 实验． 其他发酵条件 如 下： 含 水 量 50% 、发 酵 时 间 48 h、搅拌间隔 8 h、硫酸铵含量 2． 0% ． （ 5） 硫酸铵含量的影响实验 分别在 0． 0% 、1． 0% 、2． 0% 、3． 0% 、4． 0% （ 质 量分数，余同） 的硫酸铵含量下进行实验． 其他发酵 条件如下： 含水量 50% 、发酵时 间 48 h、搅 拌 间 隔 8 h、灭菌时间 20 min．
质的来源．
关键词： 发酵； 枯草芽孢杆菌； 花生粕； 蛋白质； 氨基酸； 电泳； 正交试验
中图分类号： Q 939． 97
doi： 10． 3969 / j． issn． 1000-565X． 2014． 11． 019
花生粕（ PNM） 是花生仁经压榨提炼油料后所 得的副产品，其粗蛋白质含量为 38． 0% ～ 47． 0% ，粗 纤维含量为 4． 0% ～ 7． 0% ，粗脂肪含量为 0． 5% ～ 2． 0% ，钙含量为 0． 2% ～ 0． 3% ，磷（ 以植酸磷形式 存在） 含量为 0． 4% ～ 0． 7%［1］． 我国花生粕的年产 量约为 1 000 万吨，居世界第一位，约占世界总产量 的 38%［2］． 但以下 3 个主要缺陷限制了花生粕在饲 料和食品行业的应用： （ 1） 花生粕中的氨基酸不平 衡，特别是缺乏一些必需 氨 基 酸 （ 如 赖 氨 酸、蛋 氨 酸、苏氨酸） ； （ 2） 花生粕易感染黄曲霉从而产生黄 曲霉毒素，将其作为牲畜饲料时易使牲畜肝脏受到 损害； （ 3） 花生蛋白质中存在过敏原． 花生粕中氨基 酸的缺陷可通过添加氨基酸或其他蛋白质来弥补， 黄曲霉 毒 素 的 危 害 可 通 过 将 花 生 粕 用 量 控 制 在 10% 以下或利用碱或微生物发酵降解的方法来减 轻［3］，花生蛋白质中的过敏原可采用枯草芽孢杆菌
1 材料及方法
1． 1 实验材料
枯草芽孢杆菌 BS H001 由华南理工大学轻工 与食品学院分离并保存； 斜面培养基组成如下： 牛 肉膏 3 g / L，蛋白胨 10 g / L，NaCl 5 g / L，琼脂 2 g / L， pH = 7． 0； 种子培养基除不加琼脂外，其余组成与斜 面培养基相同．
利用凯氏定氮法来测定 PNM 的蛋白质含量． 取 烘干至恒重的 PNM 或 FPNM 5 g 与硫酸、硫酸铜、硫 酸钾加热 消 化，使 蛋 白 质 分 解，分 解 后 的 氨 与 硫 酸 结合生成 硫 酸 铵，然 后 碱 化 蒸 馏 使 氨 游 离，再 用 硼 酸吸收，以 盐 酸 标 准 溶 液 滴 定，将 酸 消 耗 量 乘 以 换 算系数，即得蛋白质含量． 做 3 个平行实验，取平均 值，即得蛋白质含量（ 质量分数，下同） ． 1． 3． 4 硫酸铵氮含量测定
第 11 期
刘冬梅 等： 花生粕的枯草芽孢杆菌 BS H001 发酵及产物性质
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1． 3． 6 BS H001 发酵 PNM 的多因素实验 即使采用最优的单因素条件，各因素之间的交
互作用也会影响 BS H001 的发酵，因此需考虑多因 素的交互作用对 PNM 发酵的影响． 文中进行了 5 因 素 4 水平正交试验，5 因素分别为 PNM 的含水量 （ 因素 A，分别取 44% 、47% 、50% 、52% ） 、PNM 发酵 时间（ 因素 B，分别取 40、44、48、52 h） 、搅拌间隔（ 因 素 C，分别取 4、6、8、10 h） ，灭菌时间（ 因素 D，分别 取 30、35、40、45 min） 、硫酸铵含量（ 因素 E，分别取 3． 0% 、4． 0% 、5． 0% 、6． 0% ） ． 根据正交实验设计软 件，设计了共 16 组实验，分别按照 1． 3． 3 和 1． 3． 4 节的方 法 测 定 每 组 的 蛋 白 质 含 量 和 硫 酸 铵 氮 含 量，每组做 3 个平行实验，取平均值． 1． 3． 7 蛋白质分子质量分布的 SDS-PAGE 分析
花生粕的枯草芽孢杆菌 BS H001 发酵及产物性质*
刘冬梅 陈浩 胡小慧 吴晖 李理
（ 华南理工大学 轻工与食品学院，广东 广州 510640）
摘 要： 为改善花生粕中的氨基酸平衡，减少花生蛋白质中的过敏原，将枯草芽孢杆菌
BS H001 用于花生粕的发酵，对发酵条件进行了优化，并研究了发酵后花生粕的部分性
1． 2 主要仪器
KDC-40 型低速离心机，科大创新股份有限公 司中佳分公司生产； 5804Ｒ 型台式高速冷冻离心机， Eppendorf AG 22331，德国艾本得中国有限公司生 产； DYY-6C 型电泳仪及电泳槽，北京市六一仪器厂 生产； J-2 型 菌 落 计 数 器，宁 波 科 学 仪 器 厂 生 产； ALPHA1-2型真空冷冻干燥机，德国 Christ 有限公司 生产； PQX 型多段可控人工气候箱，宁波东南仪器 有限公司生产； 自动凯氏定氮仪，瑞士 Büchi 公司生 产； 医学低温冰箱，青岛海尔集团生产．
第 42 卷 第 11 学版） Journal of South China University of Technology
（ Natural Science Edition）
Vol. 42 No. 11 November 2014
文章编号： 1000-565X（ 2014） 11-0129-07
酸、必需氨基酸和总氨基酸的含量分别提高了 4． 92% 、43． 97% 和 16． 49% ． SDS-PAGE
电泳分析表明，经优化后第 9、13、15、16 组发酵花生粕中分子质量为 63、48、41 ku 的蛋
白质大分子被全部降解． 上述结果表明，BS H001 发酵花生粕可成为动物可利用高蛋白