阿司匹林对人结肠癌细胞中肿瘤干细胞标记物CD44表达的影响

阿司匹林对人结肠癌细胞中肿瘤干细胞标记物CD44表达的影响目的：观察阿司匹林对人结肠癌肿瘤干细胞标志物CD44的影响，以探讨其对结肠癌干细胞的作用。

方法：Western blot检测不同浓度阿司匹林作用后CD44在人结肠癌细胞株HT-29和SW480中的表达情况。

结果：Western blot结果显示肿瘤干细胞标志物CD44在人结肠癌细胞株HT-29和SW480中均有表达，阿司匹林能降低HT-29和SW480中CD44蛋白的表达，并具有良好的量-效关系（P＜0.05）；两种细胞中CD44蛋白的表达比较差异均无统计学意义（P>0.05）。

结论：阿司匹林能降低结肠癌细胞株HT-29和SW480中CD44的表达，并对结肠癌肿瘤干细胞有抑制作用。

结直肠癌是全球第三大最常见的恶性肿瘤，也是导致癌症死亡的主要原因[1]。

肿瘤干细胞虽然只占结直肠癌组织一小部分，但其具有自我更新的能力，并在肿瘤的发生、生长和转移中起重要作用，因而是肿瘤根治的靶点。

CD44是Wnt通路的靶基因[2]，CD44在结直肠癌中高表达，可作为结直肠癌干细胞标志物[3-4]，与结直肠癌的发生、发展以及浸润转移密切相关，可能成为一个潜在的治疗靶点。

非甾体抗炎药（NSAIDs）阿司匹林因具有解热镇痛抗炎作用，在临床十分常用，且研究显示可以通过降低腺瘤和结直肠癌发生的风险，从而有效预防结直肠癌发生[5]，抑制甚至逆转结直肠癌癌前病变，延长患者的寿命[6]。

本研究小组前期实验结果表明阿司匹林可显著降低HT-29（COX-2高表达）、SW-480（COX-2阴性表达）细胞系中的肿瘤标志物CD133、Lgr5的表达[7-8]。

阿司匹林对肿瘤干细胞标志物CD44有何影响，目前尚不清楚。

本实验拟通过研究阿司匹林对人结肠癌细胞株HT-29和SW-480中肿瘤干细胞标记物CD44表达影响，进一步探讨阿司匹林预防结直肠癌发生的可能机制，现报道如下。

1 材料与方法1.1 材料细胞株HT-29和SW-480人结肠癌细胞株。

1.2 主要试剂McCoy’S 5a培养基、胰蛋白酶及阿司匹林（美国Sigma公司），BCA蛋白浓度测定试剂盒及RIPA裂解液（武汉博士德公司），辣根酶标记山羊抗小鼠IgG及小鼠抗人β-actin（北京中杉金桥公司），小鼠抗人CD44单克隆抗体（美国Cell Signaling Technology公司）。

1.3 方法1.3.1 细胞的培养用10%胎牛血清的McCoy’S 5a培养基培养HT-29、SW480细胞株，置于37 ℃，5% CO2的培养箱中培养，待细胞贴壁生长至80%～90%融合时，用细胞消化夜進行消化传代。

细胞处于对数期时、生长状态良好时可用于实验。

1.3.2 Western blot检查HT-29、SW-480细胞中CD44表达将HT-29、SW480细胞培养24 h后分别加入不同浓度的阿司匹林（0、2.5、5.0、10.0 mmol/L）的培养基继续培养24 h，分别记为对照组、低浓度组、中浓度组、高浓度组。

收集各浓度处理后的细胞，按RIPA方案提取细胞总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，定量上样后电泳，转膜后封闭1 h。

加入小鼠抗人CD44单克隆抗体、小鼠抗人β-actin一抗，4 ℃过夜，0.1% TBST漂洗10 min×3次，于室温与辣根酶标记山羊抗小鼠IgG孵育1 h，0.1% TBST漂洗漂洗10 min×3次。

应用Luminol显色，暗室X线胶片曝光拍照，用凝胶图象分析系统进行结果分析。

1.4 统计学处理使用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，组内的比较采用单因素方差分析，组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果Western blot结果显示，在HT-29和SW480细胞中，各组的CD44蛋白印记条带颜色由深到浅，见图1。

在HT-29细胞中，CD44蛋白的校准值均低于对照组；SW480细胞中，CD44校准值均亦低于对照组，各浓度组与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

两种细胞的组间相比差异无统计学意义（P>0.05），见图2。

3 讨论目前，肿瘤干细胞理论的提出为肿瘤研究提供了新的方向，肿瘤干细胞主导了肿瘤的发生、发展、转移[9]。

干细胞亚群增多使肿瘤细胞对放化疗的抵抗能力增强，导致了肿瘤复发以及癌症死亡率增高等[10]，因此，肿瘤干细胞可作为彻底根治肿瘤的靶点[11]。

细胞表面跨膜糖蛋白分子CD44是粘附分子中重要成员，在淋巴细胞、单核细胞、红细胞、上皮细胞等多种细胞以及在结直肠癌、胰腺癌、胃癌等恶性肿瘤中分布，主要参与细胞-细胞、细胞-基质之间的特异性粘连过程。

CD44根据其外显子的转录片段是否參与选择性拼接，可分成CD44s和CD44v。

CD44v主要功能体现在机体的病理过程中，尤其是CD44v6[12]和CD44v9[13]，可以使肿瘤侵袭能力上升，可能是因为其改变了肿瘤细胞表面粘附分子的构成和功能。

CD44作为结直肠癌干细胞的标志物得到了有关学者的证实，Wang等[14]通过分选出人结肠癌细胞株SW620中CD44+CD133-的细胞，其更好的代表了结肠癌干细胞，因其具有集落形成、增殖力强、抗凋亡以及诱导细胞耐药等干细胞的特性。

Du等[15]研究显示从结肠癌患者分离出的CD44+肿瘤细胞，仅需100个就能够发展成异质性肿瘤，而且由单个CD44+肿瘤细胞形成的球体具有肿瘤细胞的多种层次结构。

这些研究表明CD44是结肠癌肿瘤干细胞最重要的表面生物学标志物之一，结直肠癌中，CD44显著表达[16-18]，与结直肠癌的发生、发展、浸润转移以及预后密切相关。

Chai等[17]运用免疫组化检测CD44在145例不同病理类型标本中的表达，结果显示CD44在结肠癌组织中的表达率为95.65%，显著高于正常黏膜5%、炎性增生性息肉22.58%、管状腺瘤性息肉55.26%及绒毛状息肉75.76%，CD44表达强度与肠息肉癌变进展呈正相关。

Jing等[3]研究结果指出结肠癌伴肝转移时，CD44基因表达量最高，其次是结肠癌和正常黏膜，其差异有统计学意义，CD44基因表达量与肿瘤位置、组织学有关，这与Du的研究结果不谋而合[15]，并提出CD44可以作为用于预测结肠癌肝转移及判断结肠癌患者生存率更可靠的标记物。

Bendardaf等[19]研究发现CD44s和CD44v6在结直肠中高表达，原发肿瘤比转移瘤更高，这点与Hong的研究结果相似，转移瘤中CD44s的表达程度与肿瘤组织学分级和原发肿瘤的侵袭性成正相关，与无病生存期成反比。

Du等[20]研究表明CD44+肿瘤细胞通过表达朊病毒蛋白（PrPc）而增强结肠肠癌转移的风险。

此外，有研究显示CD44基因微小RNA结合位点的功能性遗传变异可以中国人群罹患结直肠癌的遗传易感性[21]。

有关于CD44与结肠癌患者生存期的关系问题，也有学者提出了不一样的观点，即CD44表达和患者的总生存期或无病生存期之间没有相关性[22-23]，甚至呈负相关[18]，可能是由于肿瘤干细胞标志物对结直肠癌预后的影响取决于肿瘤的病理分型。

一系列研究均表明服用阿司匹林等NSAIDs可以降低结直肠癌的发病风险，改善患者预后，减少术后复发率以及降低癌症死亡风险等[24]。

本小组前期实验结果显示阿司匹林均能显著降低人结肠癌细胞株HT-29、SW-480中肿瘤标志物CD133、Lgr5的表达，从而抑制肿瘤干细胞，其机制主要涉及机制COX-2途径和非COX-2途径，且以非COX-2途径为主。

然而其对肿瘤干细胞标志物CD44有何影响尚不清楚，需待进一步研究。

本研究结果显示HT-29、SW-480细胞株中均表达CD44，Muraro等[25]研究结果与此一致。

此外，随着阿司匹林浓度的增加，HT-29和SW480细胞中CD44的表达明显减少，并呈量-效关系，差异有统计学意义（P＜0.05）。

有研究表明阿司匹林等NSAIDs可能抑制Wnt/β-catenin 信号通路，从而干预癌症发生的初始步骤[26]。

阿司匹林等NSAIDs可以减弱β-catenin/TCF敏感基因CD44的转录，并呈量效关系[26]，这与本实验研究结果不谋而合。

Zeilstra等[27]研究亦显示与CD+/+/ApcMin/+小鼠比较而言，CD44-/-/ApcMin/+小鼠通过促进隐窝基底部上皮细胞的凋亡从而减少了50%的结肠腺瘤发生率，此研究表明，CD44在肠道肿瘤的发生中起了重要作用，同时也表明CD44并不影响细胞增殖而是维持肠道隐窝细胞凋亡与生长之间的平衡。

CD44表达降低不仅可以降低结肠癌的发生，而且可以减少结肠癌的转移[28]。

CD44在肠上皮细胞及结直肠癌的表达是不依赖于p53，由此表明CD44可以作为结直肠癌治疗的靶点[29]。

综上所述，公认的结直肠癌干细胞标志物CD44在结肠癌中大量表达，其表达水平与肿瘤分化程度、分期和肿瘤部位等密切相关，反应了肠息肉癌变进展过程，可以独立判断患者预后[30-32]。

本研究结果表明阿司匹林可抑制CD44的表达，可能是通过削弱CD44介导的Wnt信号而抑制肿瘤干细胞，从而起到防治结直肠癌的作用，为阿司匹林预防结直肠癌提供了相关实验依据。

参考文献[1] DeSantis C E，Lin C C，Mariotto A B，et al.Cancer treatment and survivorship statistics[J].CA Cancer J Clin，2014，64（4）：252-271.[2] Zeilstra J，Joosten S P，Dokter M，et al.Deletion of the WNT target and cancer stem cell marker CD44 in Apc（Min/+）mice attenuates intestinal tumorigenesis[J].Cancer Research，2008，68（10）：3655-3661.[3] Jing F，Kim H J，Kim C H，et al.Colon cancer stem cell markers CD44 and CD133 in patients with colorectal cancer and synchronous hepatic metastases[J].International Journal of Oncology，2015，46（4）：1582-1588.[4]陈小燕，赵逵.Lgr5与结肠癌关系的研究进展[J].世界华人消化杂志，2013，21（8）：673-678.[5] Fernándezcalderón M，Betés Ibá?ez M T.Aspirin in the primary prevention of colorectal cancer[J].Anales Del Sistema Sanitario de Navarra，2012，35（2）：261-267.[6] Ye H，Chen P，Dai W，et al.Association of long-term oral low-dose aspirin and survival in colorectal cancer：a meta-analysis[J].Chinese Journal of Gastrointestinal Surgery，2015，18（6）：589-592.[7]陳小燕，廖永美，刘胜远，等.阿司匹林对HT-29、SW480结肠癌细胞株CD133表达的影响[J].世界华人消化杂志，2013，21（1）：13-18.[8]陈小燕，廖永美，赵逵.阿司匹林对人结肠癌细胞中肿瘤干细胞标记物Lgr5表达的影响[J].遵义医学院学报，2012，35（4）：287-290.[9] Chen S，Huang E H.The colon cancer stem cell microenvironment holds keys to future cancer therapy[J].J Gastrointest Surg，2014，18：1040-1048.[10] Morrison R，Schleicher S M，Sun Y，et al.Targeting the mechanisms of resistance to chemotherapy and radiotherapy with the cancer stem cell hypothesis[J].J Oncol，2011，2011（12）：13.[11] Karlic H，Herrmann H，Schulenburg A，et al.Tumor stem cell research-basis and challenge for diagnosis and therapy[J].Wiener Klinische Wochenschrift，2010，122（13-14）：423-436.[12] Zhao L H，Lin Q L，Wei J，et al.CD44v6 expression in patients with stage II or stage III sporadic colorectal cancer is superior to CD44 expression for predicting progression[J].Int J Clin Exp Pathol，2015，8（1）：692-701.[13] Katoh S，Goi T，Naruse T，et al.Cancer stem cell marker in circulating tumor cells：expression of CD44 variant exon 9 is strongly correlated to treatment refractoriness，recurrence and prognosis of human colorectal cancer[J].Anticancer Research，2015，35（1）：239-244.[14] Wang C，Xie J，Guo J，et al.Evaluation of CD44 and CD133 as cancer stemcell markers for colorectal cancer[J].Oncology Reports，2012，28（4）：1301-1308.[15] Du L，Wang H，He L，et al.CD44 is of functional importance for colorectal cancer stem cells[J].Clin Cancer Res，2008，14（21）：6751-6760.[16] Zavrides H N，Zizi-Sermpetzoglou A，Panousopoulos D，et al.Prognostic evaluation of CD44 expression in correlation with bcl-2 and p53 in colorectal cancer[J].Folia Histochemica Et Cytobiologica，2005，43（1）：31-36.[17] Chai N，Zhang W，Wang Y，et al.Lgr5 and CD44 expressions in different types of intestinal polyps and colorectal cancer[J].Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao，2013，33（7）：972-976.[18] Hong I，Hong S W，Chang Y G，et al.Expression of the cancer stem cell markers CD44 and CD133 in colorectal cancer：an immunohistochemical staining analysis[J].Annals of Coloproctology，2015，31（3）：84-91.[19] Bendardaf R，Algars A，Elzagheid A，et parison of CD44 expression in primary tumours and metastases of colorectal cancer[J].Oncology Reports，2006，16（4）：741-746.[20] Du L，Rao G，Wang H，et al.CD44- positive cancer stem cells expressing cellular prion protein contribute to metastatic capacity in colorectal cancer[J].Cancer Research，2013，73（8）：2682-2694.[21] Wu X M，Yang H G，Zheng B A，et al.Functional Genetic variations at the microRNA binding-site in the CD44 gene are associated with risk of colorectal cancer in chinese populations[J].PLoS One，2015，10（5）：e0 127 557.[22] Pitule P，Cedikova M，Daum O，et al.Immunohistochemical detection of cancer stem cell related markers CD44 and CD133 in metastatic colorectal cancer patients[J].Biomed Research International，2014，432 139.[23] Huh J W，Kim H R，Lee J H，et parison of cyclooxygenase-2 and CD44 mRNA expression in colorectal cancer and its relevance for prognosis[J].Journal of Pathology，2009，454（4）：381-387.[24] Jacobs E J，Newton C C，Gapstur S M，et al.Daily aspirin use and cancer mortality in a large US cohort[J].J Natl Cancer Inst，2012，104（16）：1208-1217.[25] Muraro M G，Mele V，D?ster S，et al.CD133+，CD166+CD44+，and CD24+CD44+ phenotypes fail to reliably identify cell populations with cancer stem cell functional features in established human colorectal cancer cell lines[J].Stem Cells Translational Medicine，2012，1（8）：592-603.[26] Dihlmann S，Siermann A，V on K D M.The nonsteroidal anti-inflammatory drugs aspirin and indomethacin attenuate beta-catenin/TCF-4 signaling[J].Oncogene，2001，20（5）：645-653.[27] Zeilstra J，Joosten S P，Dokter M，et al.Deletion of the WNT target and cancer stem cell marker CD44 in Apc（Min/+）mice attenuates intestinal tumorigenesis[J].Cancer Research，2008，68（10）：3655-3661.[28] Zaytseva Y Y，Rychahou P G，Gulhati P，et al.Inhibition of fatty acid synthase attenuates CD44-associated signaling and reduces metastasis in colorectal cancer[J].Cancer Research，2012，72（6）：1504-1517.[29] Zeilstra J，Joosten S P，Vermeulen L，et al.CD44 expression in intestinal epithelium and colorectal cancer is independent of p53 status[J].PLoS One，2013，8（8）：e72 849.[30]劉丹，孙婧华，朱金明，等.β-catenin与大肠癌干细胞标记物EpCAMhigh/CD44+在大肠癌中的表达及临床意义[J].临床肿瘤学杂志，2013，18（2）：117-122.[31]徐邓勇，丁克峰.阿司匹林预防大肠癌的研究进展[J].国际肿瘤学杂志，2013，40（1）：68-71.[32]于新蕊，宋辉，周立颖.阿司匹林与结直肠癌预防[J].中国肿瘤，2012，21（9）：682-685.。