微生物发酵生产紫杉醇研究进展

微生物发酵生产紫杉醇研究进展

摘要：综述了微生物发酵生产紫杉醇的主要研究进展，包括产紫杉醇的内生

真菌的生物多样性、真菌细胞发酵生产紫杉醇的优势，同时也对如何改良内生真

菌菌种性能和优化培养基组成及培养条件以提升其产紫杉醇的能力，作出了较为

全面的综述。

关键字：紫杉醇，微生物发酵，内生菌，产量

前言：目前国外市场上的紫杉醇仍依靠从红豆杉树皮中提炼和人工合成方法，目前并未见有第三种形式形成大规模产业化制作的报道。紫杉醇的生产受着原材

料与科技二个方面的约束，短期内无法突破。为克服红豆杉资源匮乏和紫杉醇需

要量的日益扩大的问题，人类对生产紫杉醇开展了多种多样的科学研究，涉及化

学全合成、植物细胞培养、微生物转化和微生物发酵。微生物发酵法生产紫杉醇

由于具备突出优点，其研制与发展日益引起中外科研学者的普遍重视。

一、紫杉醇产生菌的研究进展

（一）产紫杉醇的内生真菌的种类

Stierle和Strobel等首次从短叶红豆杉的树枝上分离出一个可以形成紫杉

醇的内生真菌，命名为安德列亚霉[1]。当时这一发现对于紫杉醇的药源研究是一

次重要的突破，为开发紫杉醇的物源提出了一个崭新的途径。此后，各地研究者

相继进行对产紫杉醇的内生真菌的分离操作，先后在西藏红豆杉、云南省红豆杉、东北地区红豆杉、欧洲红豆杉和中国红豆杉中分离到能形成紫杉醇的内生真菌，

其寄主植被基本包括红豆杉属下的所有种类。在国外的树木中，科学家也分离出

来到了可形成紫杉醇的内生真菌。Li等在不同种类的秃柏的韧皮部和木材部中均

分离出能形成紫杉醇的内生真菌[2]。GA等18人在同一种松树中分离出产紫杉醇

的内生真菌。这表明，产紫杉醇的内生真菌不但存在于红豆杉属植被中，在某些

非红豆杉属植被中也存在，他的研究结果更拓宽了产紫杉醇的内生真菌的研究范畴。

（二）真菌发酵制备紫杉醇的优越性

与过去在红豆杉植株的树皮上获得的紫杉醇比较，由内生真菌发酵制备紫杉

醇有着更多的优越性，微生物发酵方法具有以下特点：（1）微生物发酵的方法

易扩大化，有利于工业化生产的落地实施；（2）微生物易于通过诱变育种等方

法筛选高产菌株，提高紫杉醇的产量，微生物育种及选育速度明显高于植物细胞株；（3）内生真菌生长迅速，在简单培养基中便可大量繁殖，形成丰富的发酵

活性性质；（4）内生真菌在生物反应器中生长时，可人为调节各项发酵参数，

使代谢路径朝着有利于紫杉醇的生产及高浓度紫杉醇的积累的方向进行。

二、关于改良微生物性能以及优化培养条件以增加紫杉醇产量的研究进展

近十年间，国内外利用内生真菌产生紫杉醇的科研报告数量迅速增加，但用

内生真菌发酵培养生产紫杉醇却仍无法实现中型或较大的工业化生产规模（工业

化生产表达率至少是毫克级的，但现在的普遍产量仅为几百微克）。其中主要面

临以下2个困难：1）没有良好的适用于发酵生产的工业菌种。据国外研究，目

前产紫杉醇的菌种主要为红豆杉内源型菌种，一般菌丝体不发达，不利于菌体代

谢生产紫杉醇。2）由于受到发酵条件的影响，单位培养液中紫杉醇的浓度偏低。针对第1个困难，必须从两个方面着手处理，一是积极地在自然界中筛选性能稳

定良好并适合于发酵的原始出发菌种，二是对现有高产紫杉醇的菌种进行基因重

组改良，使之可以形成大量菌丝体以增加紫杉醇的产量；针对第2个困难，应对

培养基组成和培养条件进行深入研究，依据不同内生真菌的生长条件，选择最适

培养基和最适培养条件以提升紫杉醇产量。

（一）改良产紫杉醇的菌株性能以提升紫杉醇产量

使用常规诱变改良菌株性能：1993年，国内周东坡等在东北红豆杉中分解得

到产紫杉醇的菌株，其中菌株HQD33经过紫外线、EMS、60Co-γ-ray、NTG等诱

变剂顺序诱变后，获得高产突变菌株NCEU-1，其紫杉醇产量达到314.07ug/L，

大大超过原出发菌株紫杉醇的产量（51.06ug/L -125.70ug/L)[3]。

利用原生质体诱变改良菌株性能：徐峰对紫杉醇产生菌树状多节孢原生质体

制备的酶系组成﹑pH范围、酶解温度和酶解持续时间，以及直接影响原生质体获

得和再生的各种因素开展了深入研究，发现了较为理想的酶解条件和再生条件。

同时，对新获得的树状多节孢原生质体进行了紫外诱变条件摸索研究，发现良好

的紫外诱变条件为30W紫外线灯、30cm距离﹑光照50s。随后，又对紫杉醇高产

突变菌株NCEU-1的原生质体，开展了紫外线和氯化锂复合诱变育种深入研究，

检测出制霉菌素抗性突变株，并成功筛选出4株正突变菌株。经发酵筛选实验，

得到了一株遗传性稳定菌株，其紫杉醇产量增加到了418.24ug/L[4]。另外利用双

亲灭活原生质体融合的实验大大提高了紫杉醇的产量，使紫杉醇的总产量已经超

过了468.62ug/L。

可见除了利用常规的诱变育种以外，利用原生质体诱变和原生质体融合的技术，可以提高内生真菌生产紫杉醇的产量，利用产生紫杉醇的内生发达菌丝和产

生紫杉醇前体物的菌株互补培养，对紫杉醇的产量也有一定的提升效果。

（二）优化培养基组成和培养条件以提升紫杉醇产量

优化培养基组成：主要分为两大方向，一是主要通过筛选培养基的最佳碳氮

源以及微量元素提高菌丝体的产量来提升紫杉醇的产量；另一方向主要是通过添

加前体物或前体类似物或代谢过程中影响酶活力和紫杉醇积累的物质来提高单位

菌丝体产紫杉醇的能力。赵凯等采用正交实验研究了添加前体物质对紫杉醇产生

菌HQD33产紫杉醇的影响，紫杉醇含量达到203.656ug/L[5]。张亚妮在T14菌的

发酵液中添加单一苯丙氨酸，紫杉醇含量从90ug/L提升至146.4ug/L[6]。刘晓兰

等在培养基中分别添加苯丙氨酸、醋酸钠、酪氨酸等前体，确定最佳前体浓度后，结合培养基和培养条件优化，紫杉醇含量提升至448.52ug/L[7]。

优化培养条件：发酵条件的优化与是发酵过程中最基本的要求，也是最重要

最难掌握的技术指标。温度、PH值、接种量、溶氧等的优化控制，依据不同的发

酵而有所不同。为减少物料成本以及加快研究速度，多数发酵条件的优化摸索首

先通过摇瓶实验来完成。江南大学代文亮等对内生真菌Fusarium mairei UH23

发酵产紫杉醇的工艺条件进行了研究，最佳培养条件为：温度26℃，发酵起始

PH7.0,接种量5%，装液量250ml三角瓶装量60ml，发酵周期12d。西北大学张亚

妮等对内生真菌T14条件进行了优化研究，T14产紫杉醇的最适温度为30℃，最

佳PH为5.5，最适碳源为蔗糖，最适氮源为0.3%的氯化铵。