紫杉醇的发酵培养
微生物发酵生产紫杉醇研究进展
微生物发酵生产紫杉醇研究进展摘要：综述了微生物发酵生产紫杉醇的主要研究进展，包括产紫杉醇的内生真菌的生物多样性、真菌细胞发酵生产紫杉醇的优势，同时也对如何改良内生真菌菌种性能和优化培养基组成及培养条件以提升其产紫杉醇的能力，作出了较为全面的综述。
关键字：紫杉醇，微生物发酵，内生菌，产量前言：目前国外市场上的紫杉醇仍依靠从红豆杉树皮中提炼和人工合成方法，目前并未见有第三种形式形成大规模产业化制作的报道。
紫杉醇的生产受着原材料与科技二个方面的约束，短期内无法突破。
为克服红豆杉资源匮乏和紫杉醇需要量的日益扩大的问题，人类对生产紫杉醇开展了多种多样的科学研究，涉及化学全合成、植物细胞培养、微生物转化和微生物发酵。
微生物发酵法生产紫杉醇由于具备突出优点，其研制与发展日益引起中外科研学者的普遍重视。
一、紫杉醇产生菌的研究进展（一）产紫杉醇的内生真菌的种类Stierle和Strobel等首次从短叶红豆杉的树枝上分离出一个可以形成紫杉醇的内生真菌，命名为安德列亚霉[1]。
当时这一发现对于紫杉醇的药源研究是一次重要的突破，为开发紫杉醇的物源提出了一个崭新的途径。
此后，各地研究者相继进行对产紫杉醇的内生真菌的分离操作，先后在西藏红豆杉、云南省红豆杉、东北地区红豆杉、欧洲红豆杉和中国红豆杉中分离到能形成紫杉醇的内生真菌，其寄主植被基本包括红豆杉属下的所有种类。
在国外的树木中，科学家也分离出来到了可形成紫杉醇的内生真菌。
Li等在不同种类的秃柏的韧皮部和木材部中均分离出能形成紫杉醇的内生真菌[2]。
GA等18人在同一种松树中分离出产紫杉醇的内生真菌。
这表明，产紫杉醇的内生真菌不但存在于红豆杉属植被中，在某些非红豆杉属植被中也存在，他的研究结果更拓宽了产紫杉醇的内生真菌的研究范畴。
（二）真菌发酵制备紫杉醇的优越性与过去在红豆杉植株的树皮上获得的紫杉醇比较，由内生真菌发酵制备紫杉醇有着更多的优越性，微生物发酵方法具有以下特点：（1）微生物发酵的方法易扩大化，有利于工业化生产的落地实施；（2）微生物易于通过诱变育种等方法筛选高产菌株，提高紫杉醇的产量，微生物育种及选育速度明显高于植物细胞株；（3）内生真菌生长迅速，在简单培养基中便可大量繁殖，形成丰富的发酵活性性质；（4）内生真菌在生物反应器中生长时，可人为调节各项发酵参数，使代谢路径朝着有利于紫杉醇的生产及高浓度紫杉醇的积累的方向进行。
紫杉醇的大规模培养及其影响因素
课程名称细胞工程课题紫杉醇的大规模培养及其影响因素学院酿酒与食品工程学院专业生物工程姓名学号指导老师老师紫杉醇的大规模培养及其影响因素钟坤1酿酒与食品工程学院生工112班摘要：紫杉醇是一个从红豆杉植物中提取的对多种癌症都具有较好疗效的天然药物。
近几年植物细胞培养生产紫杉醇的尝试性研究不断有突破性进展，综合当今研究报告，对利用植物细胞培养大规模生产紫杉醇过程及其影响因素作一定的分析与概述。
关键字：紫杉醇、细胞培养、红豆杉、影响因素紫杉醇是一种复杂的天然的抗癌药物，属于二萜生物碱，其基本结构由浆果赤霉素Ⅲ和连接其13位碳上一苯丙氨酸衍生物构成。
1982年紫杉醇开始在临床上进行试验，1989年完成II期临床，1990年进行Ⅲ期临床，1992年12月29日美国正式批准用于晚期卵巢癌、肺癌、子宫癌的治疗。
它是经认证、目前最好的天然抗癌药物之一，可广泛用于肺鳞癌、肺腺癌、乳腺癌、睾丸胚胎癌、卵巢癌、恶性胸腺癌、胆囊癌、食道癌、非小细胞肺癌、淋巴瘤、膀胱癌、生殖细胞癌、头颈癌等肿瘤的治疗，特别是晚期卵巢癌的治疗。
1995年中国医学科学院药物研究所研制的国产紫杉醇原料(从云南红豆杉、西藏红豆杉、东北红豆杉、中国红豆杉和美丽红豆杉五种植物中提取，纯度达98％以上)、据估算，从1000~2000棵稀有的紫杉树皮中只能提取lkg紫杉醇，而对l例病人制各充足的药物需3～4棵百年的老红豆杉树。
由于红豆杉属植物中紫杉醇的含量极低，远远不能满足市场的要求。
为了解决紫杉醇供需之间的尖锐矛盾，多年来，科学家在寻找及扩大紫杉醇药源途径方面做了大量工作，紫杉醇的全合成已取得成功，但皆因路线长，收率低等原因目前无法实现工业化．化学半合成是一条扩大紫杉醇来源的较好途径，国外已用半合成法生产紫杉醇，但化学半合成所用前体巴卡亭III和10一去乙酰巴卡亭III等仍要依赖于从红豆杉属植物中提取，限制了它的应用，利用植物细胞培养技术生产紫杉醇是一种大有前途的途径。
紫杉醇真菌发酵试验方案
紫杉醇真菌发酵试验方案1、培养基种子培养基：马铃薯200 g (去皮煮汁，过滤取液)，蔗糖20 g，水1 L。
配制方法是马铃薯去皮切条，水煮30 min，4 层纱布过滤，溶入蔗糖，然后加水定容，121℃灭菌30 min，在超净工作台内倒平板。
发酵培养基：葡萄糖5 g /L，蔗糖15 g /L，蛋白胨1 g /L，醋酸钠1 g /L，MgSO4 2. 5 mg /L，C a (NO3) 2 10 mg /L，CuSO4 10 mg /L，ZnSO4 5 mg /L，M nCl2 2. 5 mg /L，FeCl3 2 mg /L，KH2 PO4 100mg /L，维生素B1 5 mg /L，维生素B6 5 mg /L，甲醇10mL /L，油酸5mL /L。
2、菌株活化在冰箱中保存的平板菌种上取10m m×10 mm大小的菌块接种，转接于种子培养基中，200 r/m in摇床上28 ℃黑暗培养3 d。
3、液体培养(1)摇瓶培养实验将内生真菌菌株接种到发酵培养基中，培养3 d后取6 m l接入250 m l三角瓶中，28℃、220 r/min，每瓶60m l培养7 d。
(2)发酵罐培养实验将内生真菌菌株接种到发酵培养基中，培养3 d后取6 0m l接入2500 m l发酵罐中，28℃、220 r/min，培养7 d。
4、紫杉醇粗提将发酵液4 000 r/m in离心，取上清液于60 ℃下旋转蒸发至1 /10体积后，加入等体积乙酸乙酯在超声波下萃取1 h，收集乙酸乙酯层，沉淀的菌体用组织捣碎仪处理后，经低温冻融2次，加入一定量乙酸乙酯用超声波细胞破碎仪破碎细胞。
加入等体积乙酸乙酯超声波提取1 h，收集乙酸乙酯层。
菌体沉淀和上清液再加入等体积的乙酸乙酯超声波提取2次。
合并乙酸乙酯层，并于50 ℃下旋转蒸发至干，加入适量甲醇溶解洗涤固体，再加入体积比为1：1的二氯甲烷-水混合液萃取后，将二氯甲烷层45 ℃旋转蒸发至干，用少量甲醇溶解过滤。
紫杉醇发酵研究进展
微生物发酵生产紫杉醇的研究尽管取得了很 大 的 进 展 ，但 大 多 仍 停 留 在 实 验 室 研 究 阶 段 ，至 今 市场上的紫杉醇仍几乎全部来自红豆杉树。其重 要原因就是分离到的紫杉醇的内生真菌发酵液中 紫 杉 醇 的 产 量 仍 然 很 低 ，难 以 实 现 工 业 化 生 产 ，要 进行工业生产，分 离 到 的 菌 株 生 产 紫 杉 醇 的 产 量 至少要达到毫克级水平 。 ［４］ 如何提高发酵过 程 中 紫杉醇的产量，大 量 学 者 经 过 研 究 找 到 了 一 些 有 效的途径。 ４．１ 菌 种 改 良 ４．１．１ 利用常规 诱 变 改 良 菌 种 诱 变 经 常 被 用 来筛选高产菌株和获得优良种子。常采用的诱变 方法有物 理 和 化 学 诱 变。 周 东 坡 等 从 ［１２］ 东 北 红 豆杉 中 分 离 到 ３ 株 紫 杉 醇 产 生 菌，其 中 ＨＱＤ３３ 经过紫外线、ＥＭＳ、６０ＣＯ－γ－ｒａｙ、ＮＴＧ 等 诱 变 剂顺序诱 变 得 到 高 产 突 变 菌 株 ＮＣＥＵ－１，其 紫 杉醇产量到达３１４．０７μｇ／ｌ，远 远 高 于 原 始 出 发 菌 株紫杉醇的产量（５１．０６ －１２５．７０μｇ／ｌ）。 ４．１．２ 利用原生 质 体 融 合 和 诱 变 改 良 菌 种 原
紫 杉 醇 （ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ，商 品 名 Ｔａｘｏｌ）是 一 种 二 萜 类 衍 生 物 ，是 当 前 公 认 的 广 谱 、活 性 强 的 抗 癌 药 物之一。紫杉醇主要用于治疗卵巢癌和乳腺癌、 对肺癌、大 肠 癌、黑 色 素 瘤、头 颈 部 癌、淋 巴 瘤、脑 瘤也都 有 一 定 疗 效。 紫 杉 醇 最 早 是 Ｗａｎｉ等 于 ［１］ １９７１ 年 从 短 枝 红 豆 杉 （Ｔａｘｕｓｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）树 皮 中 分 离得到的。紫杉醇的抗癌机制在于它能结合到微 管上起稳定和防 止 微 管 解 聚 作 用，使 微 管 蛋 白 聚 合与解聚的动态 平 衡 被 打 破，微 管 的 结 构 发 生 改 变，使 其 不 与 染 色 体 连 接，染 色 体 不 能 移 向 两 极， 停留在 Ｇ２ 期和 Ｍ 期直至死亡，从而达到抗 肿 瘤 的目的。经美国国立癌症研究（ＮＣＩ）与 百 时 美 施 贵宝公司三 十 多 年 的 开 发，紫 杉 醇 于 １９９２ 年 １２ 月获得 ＦＤＡ 批准上市，现已在世界５００多个国家 上市 。 ［２］ 紫杉醇原料药目前主要依靠从天然 植 物 中提取，但紫杉醇在红豆杉树 皮 中 含 量 太 低，每 １ 万 ｋｇ红 豆 杉 树 皮 才 能 提 取 １ｋｇ 紫 杉 醇 原 料 药， 而且最大 问 题 是 这 种 做 法 会 毁 灭 大 量 红 豆 杉 树 木 ，并 破 坏 环 境 ，所 以 ，保 护 红 豆 杉 资 源 ，寻 找 新 的 获取紫杉醇的途径具有十分重要的意义。目前正 在 开 发 的 生 产 方 法 ，包 括 化 学 合 成 法 、微 生 物 发 酵 法及红豆杉细胞培养法。微生物发酵法生产紫杉 醇因具有明显的 优 势，其 研 究 和 开 发 越 来 越 受 到 人们的关注。
红豆杉内生真菌产紫杉醇的培养基优化
赵赟鑫，张 欢，邓百万，等． 红豆杉内生真菌产紫杉醇的培养基优化［J］． 江苏农业科学，2014，42（ 11） ： 389 － 392． doi： 10． 15889 / j． issn． 1002 － 1302． 2014． 11． 138
— 389 —
采取 无 氮 配 方 发 酵 液 培 养，分 别 选 取 （ NH4 ） 2 SO4 、 NH4 NO3 、酒石酸铵和蛋白胨为氮源，浓度均为 8． 0 g / L，考察 单因素氮源对 LB － 10 紫杉醇积累和菌丝体生物量的影响， 筛选出最适氮源进行初氮浓度的单因素试验。
采取初始发酵液培养，选取无水 MgSO4 的不同浓度 4． 0、 6. 0、8． 0、10． 0、12． 0 g / L，研究无水 MgSO4 的不同浓度对 LB － 10 菌体紫杉醇生物合成产量和菌丝体生物量的单因素影响。 1． 2． 5． 2 正交试验及验证性试验 选取对菌体生长和紫杉 醇积累有较大影响的最适碳源、最适氮源和硫酸镁浓度，分别 取 3 个水平，以紫杉醇产量为指标，进行 L9 （ 33 ） 正交试验以 及验证性试验。
紫杉醇含量计算公式： 发酵液中紫杉醇的含量（ μg / L） = ［甲醇中紫杉醇的含量（ mg / mL） × 溶解提取物所用甲醇的体 积（ mL） × 106］/ 提取时所取发酵液的体积（ mL） 。
每次提取的紫杉醇均做 3 个平行样，分别经 HPLC 测定 并通过公式计算发酵液中紫杉醇的含量，求其平均值。 1． 2． 4 生物量的测定 取一定体积的发酵液 4 800 r / min 离 心 20 min，菌丝体用蒸馏水洗涤 2 次，收集菌丝体，置于 80 ℃ 烘箱中烘干至恒重，称量，计算菌丝体生物量。 1． 2． 5 培养基配方的优化方法 1． 2． 5． 1 单因素试验 采取无碳配方发酵液培养，分别选取 葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和淀粉为碳源，浓度均为 80． 0 g / L，考察 单因素碳源对 LB － 10 紫杉醇积累和菌丝体生物量的影响， 筛选出最适碳源进行初糖浓度的单因素试验。
对于微生物发酵法生产紫杉醇的探究
内生真菌的培养、保存
• 一般20 ℃～25 ℃培养一个月左右,即可形成内生 真菌菌落。
• 二是从产紫杉醇的内生真菌细胞中分离出 产紫杉醇的关键酶基因并将其导入微生物 体内，利用其它真菌甚至细菌、酵母菌构 建新的紫杉醇高产工程菌株来生产紫杉醇。
• 三是优化发酵培养条件，通过添加碳源、 氮源和前体物、特殊的诱导子、抑制剂等 物质借助代谢途径工程的研究来提高真菌 紫杉醇的合成量。
发酵液中紫杉醇的分离，提纯和检测
对于微生物发酵法生产紫杉醇的探究
紫杉醇
• 紫杉醇是红豆杉属植物的树皮中提出的一 种复杂的次生代谢产物，属于二萜类衍生 物。是目前所了解的惟一一种可以促进微 管聚合和稳定已聚合微管的药物。通过临 床相关研究，紫杉醇是目前公认的广谱、 活性强的抗癌药物之一。由于其具有显著 抗癌效果，现已成为临床上治疗肿瘤的重 要药物。
• 化学半合成法
• 化学全合成法
• 微生物发酵法
• 红豆杉细胞培养法
目前国际市场上的紫杉醇主要从红豆杉树 皮提取及半合成,迄今为止尚未见有第三种 形式形成大规模工业化生产的报道。
• 紫杉醇是濒临灭绝的珍稀树种
• 紫杉醇在树皮中的含量极低,仅为干重的 0.101 %～0.106 % ,且生长缓慢,植株成熟 约需100 年。约3～6棵100 年左右的红豆 杉树皮才能提取出用于治疗一个癌症病人 所需求的紫杉醇。即使将世界上现有的红 豆杉全部砍伐，所提取的紫杉醇也只能挽 救12.5万癌症患者的生命，远远不能满足 当今市场的需求量。
紫杉醇的发酵培养
自1929年英国人发现青霉菌分泌青霉素能抑制葡 萄球菌生长以后，相继发现了链霉素、氯霉素、金霉 素、土霉素、四环素、新霉素和红霉素等抗菌素.在 近几十年内，抗生素的研究又有了飞速的发展，已找 到的抗生素有数千种，其中具有临床效果并已利用发 酵法大量生产和广泛应用的多达百余种.
2、维生素类药物
美国西部山区有一片红豆杉林，山林中有一个小村镇，住
着2000多居民。这个小村镇虽然不大，却以长寿而闻名美国。 小村镇里，寿命最短的人都活到95岁以上，绝大多数人的寿命 都在100岁以上，百岁寿星处处可见！
副作用
但是，人们发现紫杉醇具有独特的 抗肿瘤作用，能够显著地抑制肿瘤生长， 对晚期卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、 卡波济肉瘤等疗效确切，而且副作用很 小。当世界各国都为无法攻克癌症而焦 灼的时候，红豆杉中紫杉醇的发现像一 棵救命的灵芝草，给癌症患者带来了生 的希望。
2) 内生真菌的培养
• 种子培养基: 液体培养基，将纯 化菌株接种到液体培养基中培养 种子菌,3 d 后,取5 mL 液体种 子菌转入发酵罐中发酵。
• 发酵培养基：2.8L 和10L 小罐发酵方法： 以3%接种量将种子培养液接入已灭菌 (2.8L 小罐进行实罐灭菌,10L 罐先空消, 再用无菌压缩空气吹干后加入灭过菌的培 养基)、冷却的发酵培养基中，200 r/ min ，28℃通风培养16~18d，定期测定 发酵液中紫杉醇含量、生物量、总糖和 pH 值。
• 维生素作为六大生命要素之一，为整个生命活动所必 需.VA的前体β-胡萝卜素及VC和VE均为抗氧化剂，能 保护人体组织的过氧化损伤并提高机体免疫力，有抗 癌、抗心血管疾病和白内障等功能.
• 就拿Vc为例，Vc的微生物发酵法早已取得重要突破， 利用“大小菌落”菌株混合培养生产VC的工艺已经成 熟，进入产业化.目前利用氧化葡萄糖杆菌与一种蜡 状芽孢杆菌混合菌共固定化发酵技术，可将Vc的收率 提高到80%以上，生产周期比传统工艺缩短1/3.
紫杉醇发酵生产工艺
微生物发酵生产紫杉醇产品介绍及社会价值：紫杉醇是一种二萜类衍生物，是当前公认的广谱、活性强的抗癌药物之一⋯。
紫杉醇最早是wanj等于1971年从短枝红豆杉(7Ikusbreviifolia)树皮中分离得到的。
随后，schiff等证实紫杉醇具有独特的抗癌机制。
随着紫杉醇的临床应用，对其研究也逐渐深入，其主要抗癌机制为抑制肿瘤细胞的微管(Microtllbules)合成，以阻断细胞分裂，致使肿瘤体积逐渐缩小；紫杉醇还可诱导细胞凋亡，另外还有类似脂多糖(IPS)的作用，可调节机体的免疫功能。
目前国际市场上的紫杉醇仍依靠从红豆杉树皮提取及半合成，迄今为止尚未见有第三种形式形成大规模工业化生产的报道。
紫杉醇的工业生产受到了原料和技术两方面的制约，短期内难以突破。
为了解决红豆杉资源短缺与紫杉醇需求量的日益增加的矛盾，人们对生产紫杉醇进行了多方面的研究，包括化学全合成、红豆杉细胞培养及微生物发酵。
微生物发酵法生产紫杉醇因具有明显优势，其研究和开发越来越受到国内外研究学者的广泛关注。
这里提出一种运用基因工程，代谢工程，发酵工程结合的方法生产紫杉醇，该法首先将杉醇纯合成基因克隆至大肠杆菌，让其高产紫杉二烯，再把它流加至高产紫杉醇酵母的发酵罐中，运用代谢工程手段生产紫杉醇。
创新点：运用克隆方法，将合成紫杉二烯的代谢过程酶的结构基因，以及调控系列克隆至大肠杆菌，让其表达，此过程刚被Parayil Kumaran Ajikumar及其同事实现，而运用代谢工程手段让高产紫杉醇酵母利用紫杉二烯这个前体高产紫杉醇，这是没尝试但可行的。
国内外研究：1、分离菌种：最早stierle和strobel等在短叶红豆杉的枝条上分离到一种内生真菌，能够产生紫杉醇，定名为安德列亚霉。
此后，各国学者纷纷开展产紫杉醇内生真菌的分离工作，陆续从西藏红豆杉、云南红豆杉、东北红豆杉、欧洲红豆杉、中国红豆杉中分离到产紫杉醇的内生真菌，其宿主植物几乎涉及红豆杉属的各个种。
微生物发酵法生产紫杉醇的研究进展_张昕欣_pdf
化工 进 展·392·CHEMICAL INDUSTRY AND ENGINEERING PROGRESS2012年第 31卷第 2期进展与述评微生物发酵法生产紫杉醇的研究进展张昕欣 1，吴翰桂1，奚立民1，王玲萍 2（1台州职业技术学院生物与化学工程系，浙江台州 318000；2浙江海正药业股份有限公司，浙江台州 318000） 摘 要：微生物发酵生产紫杉醇由于其环境友好、工艺简单、成本低廉的优势，近年来被认为是解决紫杉醇生 产原料来源危机的良好方法。
由于单位发酵液中紫杉醇产量太低，迄今为止尚没有一株可以进行工业化生产的 产紫杉醇菌株问世。
本文就微生物发酵法生产紫杉醇的研究现状进行了总结分析，主要包括紫杉醇产生菌的筛 选、发酵培养基的优化、微生物体内紫杉醇合成相关酶基因的克隆及产紫杉醇菌种的改良。
关键词：紫杉醇产生菌；培养基优化；菌种改良 中图分类号：Q 939.79文献标志码：A文章编号：1000–6613（2012）02–0392–05Recent research and prospect on microbial producing taxolZHANG Xinxin 1，WU Hangui 1，XI Limin 1，WANG Lingping 2（1 Departement of Biological and Chemical Engineering ，Taizhou Technical College ，Taizhou 318000，Zhejiang ，China； 2Hisun Pharmaceutical Co. Ltd.，Taizhou 318000，Zhejiang ，China ）Abstract ： F o r its environmentally acceptable ， r e latively simple and inexpensive features ，microor-ganisms fermentation has been investigated as a potential alternatives to solve the crisis of raw material. No commercial fermentation strain has been used so far ，because of the low production. The aim of this study is to review and analysis the present status of research on paclitaxel-producing by microorganisms ，screening of paclitaxel-producing microorganisms ，optimization of the culture medium ，genes of the paclitaxel biosynthesis and improvement of the taxol-producing microorganisms. Key words ：taxol-producing microorganisms ；optimization of the culture medium ；improvement of strain紫杉醇（taxol ）是在 20世纪 60年代早期从太 平洋紫杉中分离出来的一种二萜类生物碱（图 1）， 经研究发现其具有广泛的抗癌活性[1]。
紫杉醇产生菌的筛选与发酵条件的调控
２．１ 产紫杉醇的内生真菌形态特征描述 从已分离的２３０个菌株中获得５个产紫杉醇的
内生真菌，其内生真菌菌落特征如图１所示。其中
万方数据
第１期
陈建华，等：紫杉醇产生菌的筛选与发酵条件的调控
‘６７。
—————————————“————————————————————＋——————————————————————————————＿————————＿———————————————————————————————————————————————————————————————————————＿＿——————＿——————————————————————————————＿＿—————————一一
万方数据
中南大学学报（自然科学版）
第３５卷
杉醇具有抗肿瘤作用，特别是对卵巢癌、乳腺癌、肺 癌、食道癌、前列腺癌以及直肠癌等有特效，此外，在 类风湿性关节炎、中风、早老性痴呆等疾病的治疗 上，也有较好的疗效，被誉为近十几年来天然药物研 究领域最重大的发现，因此受到世界各国的重视。 由于生产紫杉醇的原材料（红豆杉树皮）紧缺，在尝 试了诸如化学半合成和全合成、组织培养生产紫杉 醇等方法后，自２０世纪９０年代初始，许多国家特别 是发达国家相继开展了筛选产紫杉醇微生物的研 究，如美国、日本、加拿大等国的科学家各自从不同 的红豆杉种类中分离出不同的紫杉醇产生菌‘１’２］。
取标准品紫杉醇溶液２弘Ｌ，样品溶液１０弘Ｌ，分 别点样于硅胶Ｇ板上，置于预饱和层析缸中展开，晾 干，喷雾显色。观察斑点的大小、位置和颜色，目测 估计紫杉醇及紫杉烷类化合物的含量。 １．２．５ 紫外吸收测定样品中紫杉醇及紫杉烷类化
合物的含量 采用英国ＵＮＩＣＡＭ公司制造的ＨｅＭＯＳ核酸 蛋白分析仪进行分析。以２２８ ｎｍ处的吸光度Ａ脚为 纵坐标，紫杉醇浓度ＩＤ为横坐标，用紫杉醇标准样制 作标准曲线。测定经过稀释的培养物提取液的Ｊ＝【。。ｓ 值，从标准曲线上查出相应浓度Ｐ，，再按下列算式换 算出紫杉醇及紫杉烷类化合物的浓度Ｐ２。
紫杉醇发酵生产工艺
微生物发酵生产紫杉醇产品介绍及社会价值：紫杉醇是一种二萜 类衍生物，是当前公认的广谱、活性强的 抗癌药物之一 ？。
紫杉醇最早是wanj 等于1971 年从短枝红豆杉(7lkusbreviifolia) 树皮中分离得到的。
随后， schiff 等证实 紫杉醇具有独特的抗癌机制。
随着紫杉醇 的临床应用，对其研究也逐渐深入，其主 要抗癌机制为抑制肿瘤细胞的微管 (Microtllbules) 合成，以 阻断细胞分裂，致使肿瘤体积逐渐缩小；的作用，可调节机体的免疫功能。
目前国际市场上的紫杉醇仍依靠从红豆杉树皮提取及半合 成，迄今为止尚未见有第三种形式形成大规模工业化生产的报道。
紫杉醇的工业生产受到了 原料和技术两方面的制约， 短期内难以突破。
为了解决红豆杉资源短缺与紫杉醇需求量的日 益增加的矛盾，人们对生产紫杉醇进行了多方面的研究，包括化学全合成、红豆杉细胞培养 及微生物发酵。
微生物发酵法生产紫杉醇因具有明显优势，其研究和开发越来越受到国内外 研究学者的广泛关注。
这里提出一种运用基因工程，代谢工程，发酵工程结合的方法生产紫杉醇， 该法首先将杉醇 纯合成基因克隆至大肠杆菌，让其高产紫杉二烯，再把它流加至高产紫杉醇酵母的发酵罐中， 运用代谢工程手段生产紫杉醇。
创新点：运用克隆方法，将合成紫杉二烯的代谢过程酶的结构基因，以及调控系列克隆至大 肠杆菌，让其表达，此过程刚被 Parayil Kumaran Ajikumar 及其同事实现，而运用代谢工程手 段让高产紫杉醇酵母利用紫杉二烯这个前体高产紫杉醇，这是没尝试但可行的。
国内外研究：1、 分离菌种：最早stierle 和strobel 等在短叶红豆杉的枝条上分离到一种内生真菌，能够产生紫杉醇，定名为安德列亚霉。
此后， 各国学者纷纷开展产紫杉醇内生真菌的分离工作， 陆续 从西藏红豆杉、云南红豆杉、东北红豆杉、欧洲红豆杉、 中国红豆杉中分离到产紫杉醇的内 生真菌，其宿主植物几乎涉及红豆杉属的各个种。
紫杉醇发酵生产工艺
微生物发酵生产紫杉醇产品介绍及社会价值：紫杉醇是一种二萜类衍生物，是当前公认的广谱、活性强的抗癌药物之一⋯。
紫杉醇最早是wanj等于1971年从短枝红豆杉(7Ikusbreviifolia)树皮中分离得到的。
随后，schiff等证实紫杉醇具有独特的抗癌机制。
随着紫杉醇的临床应用，对其研究也逐渐深入，其主要抗癌机制为抑制肿瘤细胞的微管(Microtllbules)合成，以阻断细胞分裂，致使肿瘤体积逐渐缩小；紫杉醇还可诱导细胞凋亡，另外还有类似脂多糖(IPS)的作用，可调节机体的免疫功能。
目前国际市场上的紫杉醇仍依靠从红豆杉树皮提取及半合成，迄今为止尚未见有第三种形式形成大规模工业化生产的报道。
紫杉醇的工业生产受到了原料和技术两方面的制约，短期内难以突破。
为了解决红豆杉资源短缺与紫杉醇需求量的日益增加的矛盾，人们对生产紫杉醇进行了多方面的研究，包括化学全合成、红豆杉细胞培养及微生物发酵。
微生物发酵法生产紫杉醇因具有明显优势，其研究和开发越来越受到国内外研究学者的广泛关注。
这里提出一种运用基因工程，代谢工程，发酵工程结合的方法生产紫杉醇，该法首先将杉醇纯合成基因克隆至大肠杆菌，让其高产紫杉二烯，再把它流加至高产紫杉醇酵母的发酵罐中，运用代谢工程手段生产紫杉醇。
创新点：运用克隆方法，将合成紫杉二烯的代谢过程酶的结构基因，以及调控系列克隆至大肠杆菌，让其表达，此过程刚被Parayil Kumaran Ajikumar及其同事实现，而运用代谢工程手段让高产紫杉醇酵母利用紫杉二烯这个前体高产紫杉醇，这是没尝试但可行的。
国内外研究：1、分离菌种：最早stierle和strobel等在短叶红豆杉的枝条上分离到一种内生真菌，能够产生紫杉醇，定名为安德列亚霉。
此后，各国学者纷纷开展产紫杉醇内生真菌的分离工作，陆续从西藏红豆杉、云南红豆杉、东北红豆杉、欧洲红豆杉、中国红豆杉中分离到产紫杉醇的内生真菌，其宿主植物几乎涉及红豆杉属的各个种。
发酵法生产紫杉醇的工艺研究
发酵法生产紫杉醇的工艺研究(孙春艳S2009134 )一、项目立项依据（立项的必要性及需求分析）紫杉醇(paclitaxel，商品名Taxol)是从红豆杉属植物树皮中提取分离出来的一种次生代谢物，是一种二萜类衍生物，是当前公认的广谱、活性强的抗癌药物之一。
由于其具有显著抗癌效果，现已成为临床上治疗肿瘤的重要药物。
紫杉醇的活性就表现在两个方面：1.对于迅速分裂的肿瘤细胞，紫杉醇“冻结”有丝分裂纺锤体，从而使肿瘤细胞停止在G2期和M期，直至死亡。
2.紫杉醇也作用于巨噬细胞上的肿瘤坏死因子(TNF)受体，促使释放白细胞介素(IL)-1、TNF-2、IL-6、干扰素(IFN)-1、IFN-2对肿瘤细胞起杀伤或抑制肿瘤细胞迁移作用。
紫杉醇在临床上的研究既有抗癌方面的作用又有治疗非癌症方面的作用。
在癌症方面，对晚期卵巢癌、转移性乳腺癌、食道癌、肺癌、头颈部癌和鳞状细胞癌均有明显疗效。
在非癌症方面，对类风湿性关节炎、抗疟作用、多囊性肾病、卡波海里是肉瘤有良好的治疗及抑制作用。
随着生活水平的提高，环境污染日益加剧，给人类健康造成了危害，同时人类癌症的发生随之日益加剧，所以人们对紫杉醇的需求也随之增加。
紫杉醇在Taxus属植物树皮中含量仅为0.01%，每提取1公斤要砍伐1000-2000棵树的树皮。
据估测，紫杉醇正式应用于临床后，每年约需200公斤以上，按现在的提取得率0.03%计算，每年要收集700吨树皮来提取。
即使全部天然资源采伐，也只能满足短期需要，并造成对森林和人类生存环境以及生物多样性不可弥补的损失，因此紫杉醇的原料保障就成为该药能否成功走向市场的的关键。
但因资源匮乏，单纯从含量甚微的天然红豆杉植物中提取紫杉醇无法满足临床需求，故紫杉醇的药源问题已引起人们的极大关注。
发酵法生产紫杉醇优点很多，既能保护生态环境，又能快速的生产出所需要的药品，是值得研究应用的。
针对紫杉醇的需求量的增加，药源少的问题，运用发酵的方法生产紫杉醇，降低它的价格，为广大人民所用，就成了迫在眉睫的任务。
微生物发酵法生产抗癌药物紫杉醇
一、紫杉醇的概况和作用机制
二.微生物发酵法生产紫杉醇的技术路线 三.提高内生菌紫杉醇的产量的方法
一、紫杉醇的概况和作用机制
红 豆 杉 树
紫杉醇（Paclitaxel,商品名Taxol）的概述：
1963年美国化学家瓦尼（M.C. Wani）和沃尔（Monre E. Wall） 首次从一种生长在美国西部大森林中称谓太平洋杉（Pacific Yew） 树皮和木材中分离到了紫杉醇的粗提物。
1971年Wall 和Wani将粗提物进行纯化，并确定了其化学结构（一 种四环二萜化合物，并把它命名为紫杉醇（taxol））。
2001 年Huang Q 等通过实验获得紫杉醇生物合成的重要中间产物 紫杉二烯( Taxadiene, 产量达13mg/L) , 成为基因工程菌合成紫 杉醇中间体的先例。
• （1）缺乏良好的适合发酵的工业菌株
• （2）由于发酵条件的限制，单位培养液中 紫杉醇的含量低
三 提高内生菌紫杉醇的产量的方法
（一）改良菌种
1. 利用常规的诱变改良菌种
2. 利用原生质体融合改良菌种 3. 利用基因工程构建工程菌
分离紫杉醇合成代谢酶类和获得它们的 cDNA 克隆，将已经构建的携 带紫杉醇合成途径关键酶基因的真菌表达载体转入高产紫杉醇内生真菌中， 获得高产紫杉醇工程菌株
2 内生真菌纯化、鉴定与保存
待培养基上初步长出菌落后，选择长势较好 的菌落，挑取菌丝到PDA平板上纯化，根 据经典形态学方法鉴定菌种。纯化的菌株 在PDA斜面4℃下保持，备用。
3 发酵培养
• 从PDA 平板上切取5 mm × 5 mm 小块菌 落,接种至装有150 mL 液体培养基的500 mL 三角瓶中, 于28 ℃ , 100 r/ min 摇床上 振荡培养10-14 d.
发酵法生产紫杉醇的工艺研究
发酵法生产紫杉醇的工艺研究(孙春艳S2009134 )一、项目立项依据（立项的必要性及需求分析）紫杉醇(paclitaxel，商品名Taxol)是从红豆杉属植物树皮中提取分离出来的一种次生代谢物，是一种二萜类衍生物，是当前公认的广谱、活性强的抗癌药物之一。
由于其具有显著抗癌效果，现已成为临床上治疗肿瘤的重要药物。
紫杉醇的活性就表现在两个方面：1.对于迅速分裂的肿瘤细胞，紫杉醇“冻结”有丝分裂纺锤体，从而使肿瘤细胞停止在G2期和M期，直至死亡。
2.紫杉醇也作用于巨噬细胞上的肿瘤坏死因子(TNF)受体，促使释放白细胞介素(IL)-1、TNF-2、IL-6、干扰素(IFN)-1、IFN-2对肿瘤细胞起杀伤或抑制肿瘤细胞迁移作用。
紫杉醇在临床上的研究既有抗癌方面的作用又有治疗非癌症方面的作用。
在癌症方面，对晚期卵巢癌、转移性乳腺癌、食道癌、肺癌、头颈部癌和鳞状细胞癌均有明显疗效。
在非癌症方面，对类风湿性关节炎、抗疟作用、多囊性肾病、卡波海里是肉瘤有良好的治疗及抑制作用。
随着生活水平的提高，环境污染日益加剧，给人类健康造成了危害，同时人类癌症的发生随之日益加剧，所以人们对紫杉醇的需求也随之增加。
紫杉醇在Taxus属植物树皮中含量仅为0.01%，每提取1公斤要砍伐1000-2000棵树的树皮。
据估测，紫杉醇正式应用于临床后，每年约需200公斤以上，按现在的提取得率0.03%计算，每年要收集700吨树皮来提取。
即使全部天然资源采伐，也只能满足短期需要，并造成对森林和人类生存环境以及生物多样性不可弥补的损失，因此紫杉醇的原料保障就成为该药能否成功走向市场的的关键。
但因资源匮乏，单纯从含量甚微的天然红豆杉植物中提取紫杉醇无法满足临床需求，故紫杉醇的药源问题已引起人们的极大关注。
发酵法生产紫杉醇优点很多，既能保护生态环境，又能快速的生产出所需要的药品，是值得研究应用的。
针对紫杉醇的需求量的增加，药源少的问题，运用发酵的方法生产紫杉醇，降低它的价格，为广大人民所用，就成了迫在眉睫的任务。
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自1929年英国人发现青霉菌分泌青霉素能抑制葡 萄球菌生长以后，相继发现了链霉素、氯霉素、金霉 素、土霉素、四环素、新霉素和红霉素等抗菌素 .在 近几十年内，抗生素的研究又有了飞速的发展，已找 到的抗生素有数千种，其中具有临床效果并已利用发 酵法大量生产和广泛应用的多达百余种 .
2、维生素类药物
美国西部山区有一片红豆杉林，山林中有一个 小村镇，住
着2000多居民。这个小村镇虽然不大，却以长寿而闻名美国。 小村镇里，寿命最短的人都活到 95岁以上，绝大多数人的寿命 都在100 岁以上，百岁寿星处处可见！
这则新闻吸引了不少 科学家的目光，纷纷到这 来考察，然而他们并没有 发现这里人的奇异之处， 饮食生活与其他地区人群 并无太大差别。仔细观察 以后，发现这里的居民有 两个与红豆杉有关的生活 习惯，一是他们好采摘红 豆杉树叶泡茶喝;二是经 常到红豆杉树林中散步或 者运动。
这种现象引起了科学家的极大兴趣。 经过不懈努力，美国施宝贵公司于 1992年 从红豆杉中提取出天然抗癌物质 紫杉醇。 接着，英国、俄罗斯、韩国和中国的科研 人员也都从中提取出这种珍贵的药物。
副作用
但是，人们发现紫杉醇具有独特的 抗肿瘤作用，能够显著地抑制肿瘤生长， 对晚期卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、 卡波济肉瘤等疗效确切，而且副作用很 小。当世界各国都为无法攻克癌症而焦 灼的时候，红豆杉中紫杉醇的发现像一 棵救命的灵芝草，给癌症患者带来了生 的希望。
酸（DHA），是人体不能合成而又必需的多烯脂肪酸 缺乏时会导致机体代谢的紊乱而引起多种疾病，如高 血压、糖尿病、癌症、病毒感染以及皮肤老化等 .
海洋中有一种繁殖力很强的网粘菌SR21，其干菌 体DHA含量为30%～40%，可通过发酵生产DHA，每升培 养液产量为4.5g。
紫杉醇的发酵培养法
紫杉醇的发酵培养
杨海望 植物专业 学号021142063
肿瘤是一类严重威胁人们生命和生活
质量的重大和主要疾病。我国国内每年新 发生癌症患者 160 万人, 并有130 万人死 于癌症。发达国家美、欧、日等每年新增 的癌症患者达 400 万人左右 , 全世界癌症 死亡人数每年达 630 万人。长期以来 , 寻 找抗癌生物资源与天然药物成为各国医药、 化学及生物学家的一个共同愿望 。
植物中提取
快速繁殖方法
人们从 T.Media“Hicksi和i” T.Media“ Hill ”这两种植物的根中提
取到紫杉醇，含量红豆杉属植物的 4 倍，但是大田种植 ,3 年才能收割一 次，不太理想。
打破休眠 扦插
全合成
巨大的社会效益、经济效益和极为重要的学术价 值吸引了全球范围内的40 多个一流的研究小组 从事紫杉醇的全合成工作.
除此以外，随着科学技术的不断发 展，紫杉醇的 新用途也被不断发现。据 《欧洲医生》杂志报道，紫杉醇对多种慢 性顽症有较好的治疗作用，比如进行性硬 化症、风湿性关节炎、牛皮癣、湿疹等， 治疗效果都不错。随着时间的推移，紫杉 醇的用途进一步被人们所认识，其治疗适 用范围还会扩大。
? 紫杉醇具有如此神奇的作用，本应该进行大面 积、大量开发红豆杉。然而，不容乐观的是， 全世界每年紫杉醇的产量都在 300千克以下， 因为红豆杉是濒临灭绝的珍稀植物，是第三纪 冰川期遗留下来的。
紫杉醇的 抗癌机理
紫杉醇能选择性地与微管蛋白结合 , 促进 微管蛋白双聚体聚合为多聚体。对迅速分裂 的肿瘤细胞 , 紫杉醇冻结有丝分裂纺锤体 , 从 而使有丝分裂停止在 G2 期和M 期, 阻止了 癌细胞的快速繁殖直至死亡。作用于巨噬细 胞上的肿瘤坏死因子 ( TNF) 受体, 促使释 放白细胞介质 IL21 、TNF22 、IL26 、干 扰素( IFN) 21 、IFN22 , 对肿瘤细胞杀 伤或抑制作用 ; 诱导肿瘤细胞凋亡 。
? 维生素作为六大生命要素之一，为整个生命活动所必 需.VA的前体β -胡萝卜素及VC和VE均为抗氧化Байду номын сангаас，能 保护人体组织的过氧化损伤并提高机体免疫力，有抗 癌、抗心血管疾病和白内障等功能 .
? 就拿Vc为例，Vc的微生物发酵法早已取得重要突破， 利用“大小菌落”菌株混合培养生产 VC的工艺已经成 熟，进入产业化.目前利用氧化葡萄糖杆菌与一种蜡 状芽孢杆菌混合菌共固定化发酵技术，可将 Vc的收率 提高到80%以上，生产周期比传统工艺缩短 1/3.
部分合成法（半合成法）
10 - 去乙酰巴卡亭Ⅲ，可从天然红豆杉针叶中以 0. 1 % 的含量
分离得到, 为化学半合成提供了较丰富的原料。 紫杉醇的半合成方法 已比较成熟, 国外已用半合成法生产紫杉醇。
离体细胞培养法
细胞系 诱导子 农杆菌Ti 和 Ri 质粒介导 愈伤组织褐化
发酵培养法
发酵培养法
? 首先，看看微生物发酵工程与医药及我 们生活的关系
? 加之紫杉醇在树皮中的含量极低 ,仅为干重的 0.101 % ～0.106 % , 且生长缓慢 ,植株成熟约 需100 年。约3～6棵100 年左右的红豆杉树皮 才能提取出用于治疗一个癌症病人所需求的紫 杉醇。因此 ,紫杉醇来源仍将成为该药长期供 应的关键制约因素 .
怎样能获得更多的紫杉醇？
人们想到了一些方法
Wender 的逆合成分析
Mukaiyama 的逆合成分析
1994 年初,Holto 和Nicolaou 几乎同时宣告
紫杉醇的全合成获得成功 . 二者的全合成工作 完成的十分出色 , 但合成路线均太长 , 且中间步 骤的收率又相差很大 , 导致紫杉醇的最终收率 均很低. 最高只能达到 2. 7 % ，目前来看 , 紫杉醇的化学全合成还仅具有研究意义 , 缺少 商业价值 .
3、医用酶制剂
? 目前，我国每年约有 60万人死于冠心病，约 120万人死于脑梗塞、脑溢血，而美国每年约 有15万人死于中风，约 80%的病例是由于阻止 血液流向大脑的血凝块引起而导致突发性死亡， 而通过微生物可以大量生产出高浓度和活力的 溶栓酶，并且成本很低。
4、多烯脂肪酸 多烯脂肪酸，如γ -亚麻酸(GLA)和二十二碳六烯